CN102313787A

CN102313787A - 一种肠衣中多种大环内酯类兽药残留量的检测方法

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Publication number: CN102313787A
Application number: CN201110096740A
Authority: CN
Inventors: 林维宣; 蒋维旗; 赵雪荣; 陈溪
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-04-18
Filing date: 2011-04-18
Publication date: 2012-01-11
Anticipated expiration: 2031-04-18
Also published as: CN102313787B

Abstract

本发明涉及分析化学、食品安全领域。一种肠衣中多种大环内酯类兽药残留量的检测方法，样品经甲醇或乙腈提取，提取液经C₁₈或OasisHLB固相萃取柱净化，采用ZORBAXEclipseC₈分析柱，以乙腈-0.15%甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱，电喷雾、正离子扫描模式分离与检测七种大环内酯类兽药残留量。七种大环内酯类兽药检测低限均为20μg/kg。回收率螺旋霉素71.4～78.8、替米考星75.7～85.6、竹桃霉素81.1～85.8、泰乐菌素78.9～83.0、红霉素87.1～89.6、罗红霉素83.7～85.4、交沙霉素75.6～81.8。室内相对标准偏差为：螺旋霉素7.7～11.1、替米考星8.0～15.7、竹桃霉素10.5～16.4、泰乐菌素8.1～12.5、红霉素10.5～12.4、罗红霉素10.6～14.4、交沙霉素7.8～18.0。检测限、回收率和精密度等满足国内外的有关要求。

Description

一种肠衣中多种大环内酯类兽药残留量的检测方法

技术领域

本发明涉及分析化学、食品安全领域，具体地说，是一种肠衣中多种大环内酯类兽药残留量的检测方法，尤其涉及螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素、泰乐菌素、红霉素、罗红霉素、交沙霉素等七种兽药残留量的液相色谱-质谱/质谱检测方法。

背景技术

大环内酯类抗生素(macrolide antibiotics,MALs)是一类化学结构和抗菌作用相近的碱性抗生素群,属于中谱抗生素，广泛用于畜禽细菌性和支原体感染的化学治疗,同时也是重要的生长促进剂,在动物药品和饲料添加物中占有重要位置。然而当过量或不当使用此类抗生素时,会造成大环内酯类抗生素及其代谢产物的残留,并通过食物链进入人体，在体内器官积累到一定程度，可造成前厅和耳蜗神经损伤，导致眩晕和听力下降，严重者可造成肝肾损伤，高残留对敏感人群会产生致敏性和毒性反应。长期接触会改变人体肠道菌群的微生态环境，造成肠道菌群失调，同时易产生细菌抗药性。

MALs在动物性食品中的残留检测和监控与其他兽药一样已受到许多国家的高度重视,目前欧盟、日本、澳大利亚及我国等国家均对MALs提出了限量要求。将对人类健康构成严重危害。

目前，大环内酯类兽药的检测方法主要有：微生物法、免疫分析法（ELISA）、薄层色谱法（TLC）、气质联用法（GC/MS）、高效液相色谱法（HPLC）、液质联用法（LC/MS）、液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）等。微生物法选择性低，特异性不高，且仅检测单一药物的残留。免疫分析法（ELISA），特别是近来发展的放射受体分析法（CharmⅡ法），涉及的样品前处理简单、快速、特异性好，但难以实现多残留分析。薄层色谱法检测灵敏度较低，不适合食品中MALs残留的微量分析。高效液相谱法测定低限不能满足当前国内外对大环内酯类抗生素残留分析的要求，难以应用。近年来，液质联用法检测大环内酯类抗生素的研究比较活跃。夏曦等采用液相色谱-质谱/质谱法检测猪肉中四种大环内酯类药物残留量；谢丽琪等采用液相色谱-质谱/质谱法测定牛奶中大环内酯类抗生素残留量；谢文等采用液相色谱-质谱/质谱法检测蜂王浆产品中5种大环内酯类抗生素残留量；陈莹等采用液相色谱-质谱/质谱法测定了鳗鱼中大环内酯类、喹诺酮类和磺胺类兽药残留量。但肠衣中多种大环内酯类抗生素残留量检测方法未见报道。本发明旨在利用LC-MS/MS检测技术，建立一种可同时检测肠衣中多种大环内酯类抗生素残留量的检测方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有不足问题，提供一种液相色谱-质谱/质谱法检测肠衣中多种大环内酯类抗生素残留量的检测方法。可方便、准确、高效地同时检测肠衣中螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素、泰乐菌素、红霉素、罗红霉素、交沙霉素等七种大环内酯类抗生素残留量。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：一种肠衣中多种大环内酯类兽药残留量的检测方法，包括以下步骤：

1、样品提取：

称取5 g均匀肠衣样品置于50 mL具塞离心管中，加25 mL提取溶剂，涡旋，于4000 r/min离心3 min，将提取液收集于50mL容量瓶中，再加20 mL提取溶剂，重复上述操作，合并提取液，加提取溶剂定容至50 mL。精密量取10 mL提取液于20mL离心管中，在45℃以下水浴减压浓缩至近干，用10 mL缓冲溶液分次溶解残渣。

2、固相萃取柱净化

将提取液转移过固相萃取柱，弃去流出液，用5 mL水和5 mL淋洗溶液依次洗涤离心管，洗涤液过C₁₈柱，弃去流出液，负压抽干，用6 mL甲醇洗脱。收集全部洗脱液，在45℃以下水浴减压浓缩至近干，加2 mL样液溶解稀释液溶解，混匀，过0.22 μm 针筒滤膜，进行LC-MS/MS分析。

3、液相色谱-质谱/质谱仪测定

按照色谱条件测定样品和标准溶液，质谱分离采用在正离子模式下进行母离子全扫描，再对其子离子进行全扫描。通过被测样品的质谱和相关信息，得到其定性和定量结果。定性时应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。定量测定时采用标准曲线法。

作为优选，步骤1中所述提取溶剂为甲醇或乙腈。

作为优选，步骤1中所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，配置方法为溶解13.8 g磷酸二氢钠于950 mL水中，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH值到8.0，最后用水稀释至1。

作为优选，在步骤2中所述固相萃取柱为C₁₈净化柱（500 mg/6 mL，或相当者）或HLB净化柱（Oasis ，500 mg/6 mL，或相当者）。C18净化柱和HLB净化柱使用前依次用5 mL甲醇、5 mL水预淋洗。

作为优选，在步骤2中所述淋洗溶液为甲醇－水混合溶液（2+8,V/V）。

作为优选，在步骤2中所述样液溶解稀释液为甲醇－水混合溶液（1+1,V/V）。

作为优选，在步骤3中所述色谱分析条件为：

液相色谱条件：

a）色谱柱: ZORBAX Eclipse C₈柱, 150mm×4.6 mm(i.d) ,5μm；

b）流动相A:乙腈, 流动相B: 0.15%甲酸水溶液，梯度洗脱。

c）流速: 400 μL/min；

d）进样量:20μL.

串联质谱条件：

a) 离子源:电喷雾离子源；

b) 扫描方式:正离子扫描；

c) 检测方式:多反应监测；

d) 电喷雾电压(IS):4800 V；

e) 雾化气压力(GS1):42 psi；

f) 气帘气压力(CUR):25 psi；

g) 辅助气流速(GS2):45 psi；

h) 离子源温度(TEM):540℃；

i) 碰撞气(CAD):6 psi；

j) 分别设定母离子、子离子、去簇电压（DP）、碰撞室入口电压（EP）、碰撞室出口电压（CXP）、碰撞气能量（CE）。

作为优选，在步骤3中所述标准溶液的配置方法为：配置单个标准储备液时选用甲醇为溶剂，配置混合标准储备液时选用空白样品溶液稀释或定容。

作为优选，所述梯度洗脱程序为：

0～3.5分钟，流动相A30～70%，流动相B70～30%；

3.5～8分钟，流动相A70%，流动相B30%；

8～10分钟，流动相A70～30%，流动相B30～70%；

10～16分钟，流动相A30%，流动相B70%。

进一步地，所述大环内酯类兽药包括螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素、泰乐菌素、红霉素、罗红霉素、交沙霉素等七种兽药至少一种。

由于采用上述技术方案，本发明的有益效果在于：

1、建立了肠衣中螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素、泰乐菌素、红霉素、罗红霉素、交沙霉素等七种大环内酯类兽药残留量的液相色谱-串联质谱法检测方法。实现了对七种大环内酯类兽药的同时检测。

2、提取液采用C18或HLB固相萃取净化柱，通过对固相萃取柱净化条件的优化，具有较好的净化效果，并保证七种大环内酯类兽药都有较高的回收率。

3、利用液相色谱-质谱/质谱多反应模式（MRM）检测，具有抗干扰能力强的特点。

4、与以往的方法比较，具有简单、快速、准确、高效等优点，七种大环内酯类兽药检测低限均为20 μg/kg。平均回收率为：螺旋霉素71.4～78.8、替米考星75.7～85.6、竹桃霉素81.1～85.8、泰乐菌素78.9～83.0、红霉素87.1～89.6、罗红霉素83.7～85.4、交沙霉素75.6～81.8。相对标准偏差为：螺旋霉素7.7～11.1、替米考星8.0～15.7、竹桃霉素10.5～16.4、泰乐菌素8.1～12.5、红霉素10.5～12.4、罗红霉素10.6～14.4、交沙霉素7.8～18.0。方法的检测低限满足国内外相关法规的要求，精密度、回收率等技术指标符合相关标准的规定。

附图说明：

图1 空白肠衣样品添加七种大环内酯类兽药混合标准溶液（20 μg/kg）提取离子流图；图中保留时间（min）：螺旋霉素(spiramycin)9.26 ,替米考星(tilmicosin)9.63,竹桃霉素(leandomycin)10.01,泰乐菌素(tylosin)10.17,红霉素(erythromycin)10.11,罗红霉素(roxithromycin)10.59,交沙霉素(josamycin)11.04。

图2 螺旋霉素子离子全扫描质谱图；

图3 替米考星子离子全扫描质谱图；

图4 竹桃霉素子离子全扫描质谱图；

图5 泰乐菌素子离子全扫描质谱图；

图6 红霉素子离子全扫描质谱图；

图7 罗红霉素子离子全扫描质谱图；

图8交沙霉素子离子全扫描质谱图。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不局限于具体实施例。

实施例1 肠衣中多种大环内酯类兽药残留量的检测方法

1、样品提取：

（1）甲醇提取方法：称取5 g均匀试样置于50 mL具塞离心管中，加25 mL甲醇，涡旋，于4000 r/min离心3 min，将上层甲醇提取液收集于50mL容量瓶中，再加20 mL甲醇，重复上述操作，合并甲醇提取液，加甲醇定容至50 mL。精密量取10 mL甲醇提取液于20mL离心管中，在45℃以下水浴减压浓缩至近干，用10 mL磷酸盐缓冲溶液分次溶解残渣。

（2）乙腈提取方法：称取5 g均匀试样置于50 mL具塞离心管中，加25 mL乙腈，涡旋，于4000 r/min离心3 min，将上层乙腈提取液收集于50mL容量瓶中，再加20 mL乙腈，重复上述操作，合并乙腈提取液，加乙腈定容至50 mL。精密量取10 mL乙腈提取液于20mL离心管中，在45℃以下水浴减压浓缩至近干，用10 mL磷酸盐缓冲溶液分次溶解残渣。

2、固相萃取柱净化法

（1）C₁₈固相萃取柱净化：C₁₈小柱（500 mg/6 mL，或相当者）依次用5 mL甲醇、5 mL水预淋洗。将提取液转移过C₁₈净化柱，弃去流出液，用5 mL水和5 mL甲醇－水（2+8,V/V）依次洗涤离心管，洗涤液过C₁₈柱，弃去流出液，负压抽干，用6 mL甲醇洗脱。收集全部洗脱液，在45℃以下水浴减压浓缩至近干，加2 mL甲醇－水（1+1,V/V）溶解，混匀，过0.22 μm 针筒滤膜，进行LC-MS/MS分析。

（2）HLB固相萃取柱净化法：Oasis(HLB)小柱（500 mg/6 mL，或相当者）依次用5 mL甲醇、5 mL水预淋洗。将提取液转移过HLB净化柱，弃去流出液，用5 mL水和5 mL甲醇－水（2+8,V/V）依次洗涤离心管，洗涤液过HLB柱，弃去流出液，负压抽干，用6 mL甲醇洗脱。收集全部洗脱液，在45℃以下水浴减压浓缩至近干，加2 mL甲醇－水（1+1,V/V）溶解，混匀，过0.22 μm 针筒滤膜，进行LC-MS/MS分析。

4、液相色谱-质谱/质谱仪测定

按照液相色谱－质谱/质谱条件测定样品和标准工作溶液，质谱分离采用在正离子模式下进行母离子全扫描，再对其子离子进行全扫描。通过被测样品的质谱和相关信息，得到其定性和定量结果。定性时应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。定量测定时采用标准曲线法。

液相色谱条件：

e）色谱柱: ZORBAX Eclipse C₈柱, 150mm×4.6 mm(i.d) ,5μm；

f）流动相：乙腈-0.15 %甲酸水溶液，梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1；

g）流速: 400 μL/min；

h）进样量:20μL.

表1 流动相梯度洗脱程序

时间（min）	乙腈 %	0.15 %甲酸水溶液
			0	30	70
3.5	70	30
			8	70	30
10	30	70
			16	30	70

串联质谱条件：

k) 离子源:电喷雾离子源；

l) 扫描方式:正离子扫描；

m) 检测方式:多反应监测；

n) 电喷雾电压(IS):4800 V；

o) 雾化气压力(GS1):42 psi；

p) 气帘气压力(CUR):25 psi；

q) 辅助气流速(GS2):45 psi；

r) 离子源温度(TEM):540℃；

s) 碰撞气(CAD):6 psi；

t) 离子对、去簇电压（DP）、碰撞气能量（CE）及碰撞室出口电压（CXP），见表2。

表2 离子对、去簇电压（DP）、碰撞气能量（CE）及碰撞室出口电压（CXP）

Figure DEST_PATH_568279DEST_PATH_IMAGE002

5、线性关系：将标准储备液逐级稀释，制备六个不同浓度的系列混合标准工作液，按浓度从低到高顺序，依照上述色谱条件和质谱条件进行测定。每一浓度测定3次，按其标准溶液浓度 Y（ng/mL）与对应的峰面积平均值 X（cps）作标准曲线图，计算回归方程和相关系数，结果见表3。

表3 线性方程和相关系数

离子对	线性方程	相关系数
			螺旋霉素	Y=1.49x10⁴X–1.23x10⁴	0.9992
替米考星	Y=1.7x10⁴X – 6.7x10³	0.9990
			竹桃霉素	Y=1.52x10⁵X + 8.46x10⁴	0.9991
泰乐菌素	Y=7.49x10⁴X + 2.26x10⁴	0.9992
			红霉素	Y=1.54x10⁵X + 1.11x10⁵	0.9978
罗红霉素	Y=1.6x10⁵X + 5.08x10⁴	0.9998
			交沙霉素	Y=5.8x10⁴X + 4.68x10⁴	0.9994

6、回收率和精密度：以不含大环内酯类药物残留的肠衣为空白样品，分别添加7种大环内酯混合标准溶液,添加浓度为20 μg/kg、100 μg/kg、200 μg/kg三个浓度水平，每个浓度水平进行6次重复实验，测得7种大环内酯类药物的回收率和精密度, 结果见表4。

表4 肠衣中7种大环内酯类药物的回收率和精密度数据

Figure DEST_PATH_16578DEST_PATH_IMAGE004

由表4结果可见：方法的回收率范围为：螺旋霉素71.4～78.8、替米考星75.7～85.6、竹桃霉素81.1～85.8、泰乐菌素78.9～83.0、红霉素87.1～89.6、罗红霉素83.7～85.4、交沙霉素75.6～81.8。室内相对标准偏差为：螺旋霉素7.7～11.1、替米考星8.0～15.7、竹桃霉素10.5～16.4、泰乐菌素8.1～12.5、红霉素10.5～12.4、罗红霉素10.6～14.4、交沙霉素7.8～18.0。

7、检测低限：以肠衣的空白样品进行添加试验，以3倍信噪比求得方法对待测的7种大环内酯类药物的检测低限（LOD）均为20 μg/kg，满足国内和国际对大环内酯类药物残留监控的要求。

8、方法优化过程

①提取方法:大环内酯类兽药属于极性物质，易溶于甲醇、乙腈。试验结果表明，用乙腈、甲醇提取样品，大环内酯类兽药的回收率大于70%，两者没有显著差异。

②萃取净化柱淋洗条件：试验了C₁₈ 、Oasis(HLB)和MCX固相萃取小柱对肠衣样品中大环内酯类兽药残留的净化效果。在固相萃取小柱加入1 mL100 ng/mL标准水溶液之后，分别用5 mL不同比例的甲醇-水溶液（1+9， 2+8，3+7，4+6， 5+5，6+4，7+3，8+2，V/V）淋洗固相萃取小柱，分别收集洗液，直接用LC-MS/MS检测。结果表明：对Oasis(HLB) 小柱，甲醇-水淋洗溶液中甲醇浓度50%以下时，7种大环内酯类兽药都没有损失；对C₁₈小柱，甲醇-水淋洗溶液中甲醇浓度60%以下时，7种大环内酯类兽药都没有损失。这两种净化柱用甲醇洗脱时回收率在70-110％之间。对MCX小柱，交沙霉素不能洗脱下来，其他6种大环内酯类兽药的回收率在30-121％之间。根据以上研究结果，在实际样品检测时C₁₈和Oasis(HLB) 小柱净化效果好，样品添加回收稳定。综合考虑，确定HLB柱和C₁₈柱的淋洗条件为：5 mL水和5 mL甲醇－水（2+8,V/V）依次洗涤小柱，然后用6 mL甲醇洗脱。

③色谱柱和流动相选择：分别选用ZORBAX Eclipse XDB-C_8（（4.6mm×150mm、5μm）,ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈（4.6mm×150mm，5μm），结果表明两种色谱柱均适合大环内酯类兽药的检测。比较了甲醇－0.15％甲酸和乙腈－0.15％甲酸溶液两种流动相的色谱分离效果，结果表明乙腈－0.15％甲酸溶液作为流动相效果最好。

④质谱条件的优化：采用7种大环内酯类兽药标准溶液一流动注射的方式在正离子模式下进行母离子全扫描,.再对其子离子进行全扫描，对其质谱条件进行了一系列的优化，确定定性定量离子对，兼顾各成分灵敏度的不同而对离子源条件有所偏重，建立了最佳质谱条件，见表2。

⑤上机样液溶解稀释液的选择：试验了7种大环内酯混合标准溶液液相色谱峰面积和甲醇含量的关系，得出当采用甲醇含量为50％时, 7种大环内酯峰面积最大，因此选择甲醇+水（1+1，V/V）作为上机样液溶解稀释液。

Claims

1. 一种肠衣中多种大环内酯类兽药残留量的检测方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

（1）样品提取：

称取5 g肠衣样品置于50 mL具塞离心管中，加25 mL提取溶剂，涡旋，于4000 r/min离心3 min，将提取液收集于50mL容量瓶中，再加20 mL提取溶剂，重复上述操作，合并提取液，加提取溶剂定容至50 mL，精密量取10 mL提取液于20mL离心管中，在45℃以下水浴减压浓缩至近干，用10 mL缓冲溶液分次溶解残渣；

（2）固相萃取柱净化

将提取液转移过固相萃取柱，弃去流出液，用5 mL水和5 mL淋洗溶液依次洗涤离心管，洗涤液过C₁₈柱，弃去流出液，负压抽干，用6 mL甲醇洗脱，收集全部洗脱液，在45℃以下水浴减压浓缩至近干，加2 mL样液溶解稀释液溶解，混匀，过0.22 μm 针筒滤膜，进行LC-MS/MS分析；

（3）液相色谱-质谱/质谱仪测定

按照色谱条件测定样品和标准溶液，质谱分离采用在正离子模式下进行母离子全扫描，再对其子离子进行全扫描，通过被测样品的质谱和相关信息，得到其定性和定量结果；定性时应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物；定量测定时采用标准曲线法。

2.根据权利要求1所述的肠衣中多种大环内酯类兽药残留量的检测方法，其特征在于步骤（1）中所述提取溶剂为甲醇或乙腈。

3.根据权利要求1所述的肠衣中多种大环内酯类兽药残留量的检测方法，其特征在于步骤（1）中所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，配置方法为溶解13.8 g磷酸二氢钠于950 mL水中，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节溶液pH值到8.0，最后用水稀释至1。

4.根据权利要求1所述的肠衣中多种大环内酯类兽药残留量的检测方法，其特征在于步骤（2）中所述中所述固相萃取柱为C18净化柱（500 mg/6 mL，或相当者）或HLB净化柱（Oasis ，500 mg/6 mL，或相当者）；C18净化柱和HLB净化柱使用前依次用5 mL甲醇、5 mL水预淋洗。

5.根据权利要求1所述的肠衣中多种大环内酯类兽药残留量的检测方法，其特征在于步骤（2）中所述淋洗溶液为甲醇－水混合溶液（2+8,V/V）。

6.根据权利要求1所述的肠衣中多种大环内酯类兽药残留量的检测方法，其特征在于步骤（2）中所述样液溶解稀释液为甲醇－水混合溶液（1+1,V/V）。

7.根据权利要求1所述的肠衣中多种大环内酯类兽药残留量的检测方法，其特征在于步骤（3）中所述色谱分析条件为：

液相色谱条件：

色谱柱: ZORBAX Eclipse C₈柱, 150mm×4.6 mm(i.d) ,5μm；

流动相A:乙腈, 流动相B: 0.15%甲酸水溶液，梯度洗脱；

流速: 400 μL/min；

进样量:20μL；

串联质谱条件：

离子源:电喷雾离子源；

扫描方式:正离子扫描；

检测方式:多反应监测；

电喷雾电压(IS):4800 V；

雾化气压力(GS1):42 psi；

气帘气压力(CUR):25 psi；

辅助气流速(GS2):45 psi；

离子源温度(TEM):540 ℃；

碰撞气(CAD):6 psi；

分别设定母离子、子离子、去簇电压（DP）、碰撞室入口电压（EP）、碰撞室出口电压（CXP）、碰撞气能量（CE）。

8.根据权利要求1所述的肠衣中多种大环内酯类兽药残留量的检测方法，其特征在于步骤（3）中所述标准溶液的配置方法为：配置单个标准储备液时选用甲醇为溶剂，配置混合标准储备液时选用空白样品溶液稀释或定容。

9.根据权利要求7所述的肠衣中多种大环内酯类兽药残留量的检测方法，其特征在于所述梯度洗脱程序为：

0～3.5分钟，流动相A30～70%，流动相B70～30%；

3.5～8分钟，流动相A70%，流动相B30%；

8～10分钟，流动相A70～30%，流动相B30～70%；

10～16分钟，流动相A30%，流动相B70%。

10.根据权利要求1至9任一所述的肠衣中多种大环内酯类兽药残留量的检测方法，其特征在于所述所述大环内酯类兽药包括螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素、泰乐菌素、红霉素、罗红霉素、交沙霉素等七种兽药至少一种。