CN101846661B - 同时测定蜂王浆中林可霉素和大环内酯类残留量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种采用液相色谱串联质谱而同时测定蜂王浆中林可霉素和大环内酯类残留量的方法，目前该方法还达不到检测成本低，检测限小于1μg/kg的目的。本发明包括标准溶液制备、蜂王浆样品处理、标准曲线制作和蜂王浆样品检测工序；蜂王浆样品处理工序中使用体积浓度为97％的乙腈氨水做为提取液，将50ml玻璃离心瓶中经减压浓缩后的残渣用磷酸盐缓冲溶液来转移，再向乙酸乙酯混合进行提取；最后将上机检测样液通过高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪测得蜂王浆中林可霉素和大环内酯类的残留量。本发明检测成本低，检测效率高，检测限达到0.2-0.9μg/kg，线性相关系数在0.9914-0.9994。

Description

同时测定蜂王浆中林可霉素和大环内酯类残留量的方法

技术领域

本发明涉及一种同时测定蜂王浆中林可霉素和大环内酯类残留量的方法，尤其是涉及一种采用液相色谱串联质谱而同时测定蜂王浆中林可霉素和大环内酯类残留量的方法。

背景技术

林可霉素(Lincomycin，LIN)是由链霉菌Streptomyces lincolnensis产生的一类碱性抗生素，对大多数革兰氏阳性菌以及某些厌氧的革兰氏阴性菌有效，可致转氨酶升高及黄疸，可引起过敏反应，可引起低血压或心脏骤停，可引起耳鸣、眩晕等反应。大环内酯类(Macrolides，MALs)是一类具有14元或16元碳内酯环共同化学结构的抗菌药，主要作用于需氧革兰氏阳性菌和阴性球菌、厌氧菌，以及军团菌、胎儿弯曲菌、衣原体和支原体等，大环内酯类及其代谢产物在动物的组织及器官内蓄积达到一定的浓度后，可造成前庭和耳蜗神经的损害，导致眩晕和听力减退，严重者会造成肝肾的损害。

蜂王浆的主要进口国日本和欧盟对林可霉素和大环内酯类这两种药物的最大残留限量(MRLs)一般以最低检测限(LOD)10μg/kg为标准，检测方法主要有LC/MS/MS法、GC/MS法、HPLC-ECD法、微生物杯蝶法；例如SN/T 2062-2008中的进出口蜂王浆中大环内酯类抗生素残留量的检测方法，GB/T20762-2006中的畜禽肉中林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉它霉素、交沙霉素残留量的测定，GB/T 22941-2008中的蜂蜜中林可霉素、红霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素、交沙霉素、吉他霉素、竹桃霉素残留量的测定均属于LC/MS/MS法，由于刚发表在华中农业大学硕士学位论文第2007年版第45-66页上的动物性食品中大环内酯类和林可胺类多残留定量与确证方法研究属于GC/MS法，由刘素英和赵东豪发表在中国动物检疫第2006年第23卷第12期第28-30页中的HPLC-ECD对尿中10种大环内酯类抗生素的多残留检测，由刘晔发表在江南大学硕士学位论文第2008年版上的动物性食品中大环内酯类抗生素残留的HPLC分析均属于HPLC-ECD法，SN 0671-1997中的出口肉及肉制品中林可霉素残留量检验方法属于微生物杯蝶法。

由上可知，液相色谱-串联质谱方法作为确证方法已经广泛被国内外政府监督检验机构所运用，但由于不同种类的样品成分不一样，在使用液相色谱-串联质谱方法进行检测时，并非对所有样品都能够达到符合要求的检出限，比如蜂王浆的基质复杂，样品净化困难，SN/T 2062-2008中的进出口蜂王浆中大环内酯类抗生素残留量的检测方法为蜂王浆中大环内酯类药物进出口行业检测标准，其检测限为10μg/kg，但由于目前企业如要出口蜂王浆冻干粉，其所用原料蜂王浆中大环内酯类抗生素残留量必需控制在3μg/kg以下，这样才能够满足蜂王浆冻干粉的出口要求，由此导致SN/T 2062-2008中的进出口蜂王浆中大环内酯类抗生素残留量的检测方法远远不能满足要求，其他文献报道的检测方法有的采用了固相萃取技术，如由岳振峰、陈小霞、谢丽琪等发表在分析化学第2007年第35卷第9期第1290-1294页中的高效液相色谱串联质谱法测定动物组织中林可酰胺类和大环内酯类抗生素残留，从而提高了检测成本；而有的单纯用乙腈等溶剂作简单提取，导致样液中的杂质较多，基质效应大，达不到蜂王浆中对大环内酯类抗生素残留量的要求检测限，因此不适用于检测蜂王浆中大环内酯类抗生素的残留量。

综上所述，目前还没有一种方法简单，检测成本低，检测效率高，检测限小于1μg/kg的用于同时测定蜂王浆中林可霉素和大环内酯类残留量的方法，在蜂王浆检测中难以满足国外对林可霉素、大环内酯类残留限量的要求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，而提供一种方法简单，检测成本低，检测效率高，检测限小于1μg/kg的同时测定蜂王浆中林可霉素和大环内酯类残留量的方法。

本发明解决上述问题所采用的技术方案是：该同时测定蜂王浆中林可霉素和大环内酯类残留量的方法的特点在于：该方法所用到的原料包括纯度＞99.5％的林可霉素盐酸盐，纯度＞92.2％的红霉素，纯度＞95.0％的泰乐菌素酒石酸盐，纯度＞96.5％的竹桃霉素磷酸盐，纯度＞98.5％的替米考星，纯度＞72.0％的吉他霉素，纯度＞96.0％的螺旋霉素，纯度＞97.5％的罗红霉素，纯度＞98.0％的交沙霉素，为农残级的乙酸乙酯，为分析纯的氨水、磷酸二氢钠、氢氧化钠和无水Na₂SO₄，为优级纯的正己烷，为液相色谱纯的乙腈和乙酸铵，磷酸盐缓冲溶液，初始流动相，水；所述磷酸盐缓冲溶液通过13.8g磷酸二氢钠溶解于950mL水中，再用0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值到8.0，最后用水稀释至1L制备而成；所述初始流动相中的有机相为乙腈，水相中含有体积浓度为0.1％的甲酸和浓度为0.5mmol/L的乙酸铵，所述有机相与水相的体积比为5∶95；

该方法所用到的设备包括三重四极杆串联质谱仪，配有二元泵、在线脱气机、自动进样器、数据处理软件的高效液相色谱仪，旋转蒸发器；所述三重四极杆串联质谱仪中的离子源温度为600℃，辅助加热气GS1为70psi，干燥气GS2为70psi，气帘气CUR为20psi，碰撞气CAD为2psi，电喷雾电压IS为4700V，离子化法为正离子模式；所述高效液相色谱仪为Agilent 1200series，色谱柱为Inertsil C8-3，色谱柱的规格为2.1×150mm，3μm，进样量为20μl；

该方法包括标准溶液制备工序、蜂王浆样品处理工序、标准曲线制作工序和蜂王浆样品检测工序；所述标准溶液制备工序如下：a、混合贮备标准溶液配制步骤：各称取净含量为10mg的林可霉素盐酸盐、红霉素、泰乐菌素酒石酸盐、竹桃霉素磷酸盐、替米考星、吉他霉素、螺旋霉素和交沙霉素，分别采用乙腈定容至10ml而配制成浓度均为1000mg/L的林可霉素盐酸盐标准混合贮备液、红霉素标准混合贮备液、泰乐菌素酒石酸盐标准混合贮备液、竹桃霉素磷酸盐标准混合贮备液、替米考星标准混合贮备液、吉他霉素标准混合贮备液、螺旋霉素标准混合贮备液和交沙霉素标准混合贮备液，将上述林可霉素盐酸盐标准混合贮备液、红霉素标准混合贮备液、泰乐菌素酒石酸盐标准混合贮备液、竹桃霉素磷酸盐标准混合贮备液、替米考星标准混合贮备液、吉他霉素标准混合贮备液、螺旋霉素标准混合贮备液和交沙霉素标准混合贮备液置于-18℃以下保存待用；b、混合中间标准液配制步骤：分别取a中的林可霉素盐酸盐标准混合贮备液、红霉素标准混合贮备液、泰乐菌素酒石酸盐标准混合贮备液、竹桃霉素磷酸盐标准混合贮备液、替米考星标准混合贮备液、吉他霉素标准混合贮备液、螺旋霉素标准混合贮备液和交沙霉素标准混合贮备液各100μl，分别采用乙腈定容至10ml而配制成浓度均为10mg/L的林可霉素盐酸盐混合中间标准液、红霉素混合中间标准液、泰乐菌素酒石酸盐混合中间标准液、竹桃霉素磷酸盐混合中间标准液、替米考星混合中间标准液、吉他霉素混合中间标准液、螺旋霉素混合中间标准液和交沙霉素混合中间标准液；c、罗红霉素内标配制步骤：称取净含量为10mg的罗红霉素并用乙腈定容至10ml而配制成浓度为1000mg/L的罗红霉素标准混合贮备液，取罗红霉素标准混合贮备液100μl用乙腈定容至10ml而配制成浓度为10mg/L的罗红霉素内标中间溶液；d、临时标准使用液配制步骤：取林可霉素盐酸盐混合中间标准液、红霉素混合中间标准液、泰乐菌素酒石酸盐混合中间标准液、竹桃霉素磷酸盐混合中间标准液、替米考星混合中间标准液、吉他霉素混合中间标准液、螺旋霉素混合中间标准液和交沙霉素混合中间标准液分别用乙腈配制成浓度为100μg/kg的一号林可霉素盐酸盐临时标准使用液、一号红霉素临时标准使用液、一号泰乐菌素酒石酸盐临时标准使用液、一号竹桃霉素磷酸盐临时标准使用液、一号替米考星临时标准使用液、一号吉他霉素临时标准使用液、一号螺旋霉素临时标准使用液和一号交沙霉素临时标准使用液，再取林可霉素盐酸盐混合中间标准液、红霉素混合中间标准液、泰乐菌素酒石酸盐混合中间标准液、竹桃霉素磷酸盐混合中间标准液、替米考星混合中间标准液、吉他霉素混合中间标准液、螺旋霉素混合中间标准液和交沙霉素混合中间标准液分别用乙腈配制成浓度为1000μg/kg的二号林可霉素盐酸盐临时标准使用液、二号红霉素临时标准使用液、二号泰乐菌素酒石酸盐临时标准使用液、二号竹桃霉素磷酸盐临时标准使用液、二号替米考星临时标准使用液、二号吉他霉素临时标准使用液、二号螺旋霉素临时标准使用液和二号交沙霉素临时标准使用液，再取罗红霉素内标中间溶液用乙腈配制成浓度为200μg/kg的罗红霉素内标临时标准使用液；

所述蜂王浆样品处理工序中，a、先称取蜂王浆样品5g加入10ml水制得蜂王浆样品液；b、然后将蜂王浆样品液置于100ml离心塑料瓶中，再向100ml离心塑料瓶中加入浓度为200μg/kg的罗红霉素内标临时标准使用液100μl并旋涡混合3min，然后静置15min后再向100ml离心塑料瓶中加入40ml体积浓度为97％的乙腈氨水提取液并混合均匀，然后对置于100ml离心塑料瓶中的液体进行超声提取10min，再在转速为3000rpm下离心5min得到一号上清液；吸取25ml一号上清液置于50ml一号离心瓶中，再向50ml一号离心瓶中缓缓加入10g无水Na₂SO₄后立即用力振荡脱水，然后在转速为3000rpm下离心2min得到二号上清液，将二号上清液置于50ml玻璃离心瓶中，再将5ml体积浓度为97％的乙腈氨水提取液置于50ml一号离心瓶中，然后向50ml一号离心瓶中缓缓加入10g无水Na₂SO₄后立即用力振荡脱水，然后在转速为3000rpm下离心2min得到三号上清液，将三号上清液置于50ml玻璃离心瓶中；将50ml玻璃离心瓶中的液体置于旋转蒸发器上于35℃以下减压浓缩至干得到残渣，然后用5ml磷酸盐缓冲溶液将残渣移到15ml塑料离心管中，再向15ml塑料离心管中加入5ml乙酸乙酯并充分混合，然后提取1min，再对15ml塑料离心管中的液体在转速为3000rpm下离心5min后分层，然后取乙酸乙酯层置于10ml离心管中并用氮气吹干，再向10ml离心管中加入初始流动相1ml并进行超声溶解，然后加入2ml正己烷并用力手动振摇充分混合去脂，再在转速为800rpm下离心2min而得到下层样液，将下层样液过0.22μm滤膜而制得上机检测样液；

所述标准曲线制作工序中，先称取5份重量均为5.0g的阴性蜂王浆样品分别置于一号试剂瓶、二号试剂瓶、三号试剂瓶、四号试剂瓶和五号试剂瓶中，然后向一号试剂瓶中加入一号林可霉素盐酸盐临时标准使用液、一号红霉素临时标准使用液、一号泰乐菌素酒石酸盐临时标准使用液、一号竹桃霉素磷酸盐临时标准使用液、一号替米考星临时标准使用液、一号吉他霉素临时标准使用液、一号螺旋霉素临时标准使用液和一号交沙霉素临时标准使用液各250μl制得一号阴性蜂王浆液；向二号试剂瓶中加入一号林可霉素盐酸盐临时标准使用液、一号红霉素临时标准使用液、一号泰乐菌素酒石酸盐临时标准使用液、一号竹桃霉素磷酸盐临时标准使用液、一号替米考星临时标准使用液、一号吉他霉素临时标准使用液、一号螺旋霉素临时标准使用液和一号交沙霉素临时标准使用液各500μl制得二号阴性蜂王浆液；向三号试剂瓶中加入二号林可霉素盐酸盐临时标准使用液、二号红霉素临时标准使用液、二号泰乐菌素酒石酸盐临时标准使用液、二号竹桃霉素磷酸盐临时标准使用液、二号替米考星临时标准使用液、二号吉他霉素临时标准使用液、二号螺旋霉素临时标准使用液和二号交沙霉素临时标准使用液各250μl制得三号阴性蜂王浆液；向四号试剂瓶中加入二号林可霉素盐酸盐临时标准使用液、二号红霉素临时标准使用液、二号泰乐菌素酒石酸盐临时标准使用液、二号竹桃霉素磷酸盐临时标准使用液、二号替米考星临时标准使用液、二号吉他霉素临时标准使用液、二号螺旋霉素临时标准使用液和二号交沙霉素临时标准使用液各400μl制得四号阴性蜂王浆液；向五号试剂瓶中加入二号林可霉素盐酸盐临时标准使用液、二号红霉素临时标准使用液、二号泰乐菌素酒石酸盐临时标准使用液、二号竹桃霉素磷酸盐临时标准使用液、二号替米考星临时标准使用液、二号吉他霉素临时标准使用液、二号螺旋霉素临时标准使用液和二号交沙霉素临时标准使用液各500μl制得五号阴性蜂王浆液；然后分别用一号阴性蜂王浆液、二号阴性蜂王浆液、三号阴性蜂王浆液、四号阴性蜂王浆液和五号阴性蜂王浆液来代替蜂王浆样品处理工序中的蜂王浆样品液，并重复蜂王浆样品处理工序中的b步骤而分别制得一号标准液、二号标准液、三号标准液、四号标准液和五号标准液，该一号标准液、二号标准液、三号标准液、四号标准液和五号标准液的系列浓度为5μg/kg、10μg/kg、50μg/kg、80μg/kg和100μg/kg；将一号标准液、二号标准液、三号标准液、四号标准液和五号标准液通过高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪得到标准曲线；

所述蜂王浆样品检测工序中，将蜂王浆样品处理工序中制得的上机检测样液通过高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪，并结合标准曲线而测得蜂王浆中林可霉素和大环内酯类的残留量；该方法的检测限达0.2-0.9μg/kg。

本发明所述蜂王浆样品处理工序中所用的蜂王浆样品为蜂王浆冻干粉，该蜂王浆样品加入10ml水混合后再静置12-16h，然后再按照蜂王浆样品处理工序中的b步骤进行。

本发明所使用的水均为双重蒸馏水。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：能够同时测定蜂王浆中的林可霉素、大环内酯类药物残留，与固相萃取方法相比不增加溶剂用量，不采用固相萃取小柱，净化后的样品无色透明，在质谱图上无干扰，连续进样50次后，三重四极杆串联质谱仪中的离子源气帘板仍保持干净，样品净化效果良好。

由于基质效应的存在，会给方法定量带来困难，本发明采用罗红霉素为内标，用阴性基质样品添加标准品绘制标准曲线来消除基质的影响，定量结果准确。本方法的检测限达到0.2-0.9μg/kg，线性相关系数在0.9914-0.9994，回收率在76.7％-119％，相对标准偏差在6.7％-14.1％，精密度良好，完全满足进口国对蜂王浆中林可霉素、大环内酯类药物残留限量的要求。本发明也能够适用于同时测定蜂蜜中林可霉素和大环内酯类残留量。

本发明充分发挥了质谱的优势，利用一种样品净化方法，同时检测多种残留，提高了检测效率，利于原料收购筛选、及时指导生产加工。本发明的方法简单，快速，准确，试剂用量少，检测成本低；能够节约人力，提高效率。

附图说明

图1是本发明实施例中蜂王浆阴性样品添加80μg/kg标准浓度时，蜂王浆LC-MS/MS测定的八种药物残留的总离子流图；

图2是本发明实施例中蜂王浆阴性样品添加80μg/kg标准浓度时，蜂王浆LC-MS/MS测定的八种药物残留的提取离子流图。

具体实施方式

下面结合附图并通过实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。

实施例：

参见图1和图2，本实施例里同时测定蜂王浆中林可霉素和大环内酯类残留量的方法包括标准溶液制备工序、蜂王浆样品处理工序、标准曲线制作工序和蜂王浆样品检测工序。

本实施例中所用到的原料包括均来自德国Dr.Ehrenstorfer公司的纯度＞99.5％的林可霉素盐酸盐(Lincomycin hydrochloride)、纯度＞92.2％的红霉素(Erythromycin)、纯度＞95.0％的泰乐菌素酒石酸盐(Tylosin tartrate)、纯度＞96.5％的竹桃霉素磷酸盐(Oleandomycin phosphate dihydrate)、纯度＞98.5％的替米考星(Tilmicosin)、纯度＞72.0％的吉他霉素(Kitasamycin)、纯度＞96.0％的螺旋霉素(Spiramycin)和纯度＞97.5％的罗红霉素(Roxithromycin)；来自德国Sigma公司的纯度＞98.0％的交沙霉素(Josamycin)；为农残级的乙酸乙酯；为分析纯的氨水、磷酸二氢钠、氢氧化钠和无水Na₂SO₄；为优级纯的正己烷；为液相色谱纯的乙腈和乙酸铵；磷酸盐缓冲溶液；初始流动相；水。其中，磷酸盐缓冲溶液通过13.8g磷酸二氢钠溶解于950mL水中，再用0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值到8.0，最后用水稀释至1L制备而成；初始流动相中的有机相为乙腈，水相中含有体积浓度为0.1％的甲酸和浓度为0.5mmol/L的乙酸铵，所述有机相与水相的体积比为5∶95；所使用的水均为双重蒸馏水。

本实施例中所用到的设备包括API3200三重四极杆串联质谱仪；安捷伦1200高效液相色谱仪：配有二元泵、在线脱气机、自动进样器、Analyst数据处理软件；Sartorius BS224S分析天平；PHS-3C雷磁精密pH计；无锡市瑞江分析仪器有限公司制造的RJ-TDL-40B低速台式大容量离心机；Organomation N-EVAP 111氮吹仪；上海亚荣生化仪器厂制造的RE-52A旋转蒸发器；昆山超声仪器有限公司制造的KQ-100超声波清洗器。其中，API3200三重四极杆串联质谱仪中的离子源温度为600℃，辅助加热气GS1为70psi，干燥气GS2为70psi，气帘气CUR为20psi，碰撞气CAD为2psi，电喷雾电压IS为4700V，离子化法为正离子模式；高效液相色谱仪为Agilent 1200series，色谱柱为Inertsil C8-3，色谱柱的规格为2.1×150mm，3μm，进样量为20μl。

本实施例中的标准溶液制备工序如下：a、混合贮备标准溶液配制步骤：各称取净含量为10mg的林可霉素盐酸盐、红霉素、泰乐菌素酒石酸盐、竹桃霉素磷酸盐、替米考星、吉他霉素、螺旋霉素和交沙霉素，可以通过这些标准品说明书中所标示的纯度折算实际需要称取的净含量值，然后分别采用乙腈定容至10ml而配制成浓度均为1000mg/L的林可霉素盐酸盐标准混合贮备液、红霉素标准混合贮备液、泰乐菌素酒石酸盐标准混合贮备液、竹桃霉素磷酸盐标准混合贮备液、替米考星标准混合贮备液、吉他霉素标准混合贮备液、螺旋霉素标准混合贮备液和交沙霉素标准混合贮备液；将上述林可霉素盐酸盐标准混合贮备液、红霉素标准混合贮备液、泰乐菌素酒石酸盐标准混合贮备液、竹桃霉素磷酸盐标准混合贮备液、替米考星标准混合贮备液、吉他霉素标准混合贮备液、螺旋霉素标准混合贮备液和交沙霉素标准混合贮备液置于-18℃以下保存待用。b、混合中间标准液配制步骤：分别取a中的林可霉素盐酸盐标准混合贮备液、红霉素标准混合贮备液、泰乐菌素酒石酸盐标准混合贮备液、竹桃霉素磷酸盐标准混合贮备液、替米考星标准混合贮备液、吉他霉素标准混合贮备液、螺旋霉素标准混合贮备液和交沙霉素标准混合贮备液各100μl，分别采用乙腈定容至10ml而配制成浓度均为10mg/L的林可霉素盐酸盐混合中间标准液、红霉素混合中间标准液、泰乐菌素酒石酸盐混合中间标准液、竹桃霉素磷酸盐混合中间标准液、替米考星混合中间标准液、吉他霉素混合中间标准液、螺旋霉素混合中间标准液和交沙霉素混合中间标准液。c、罗红霉素内标配制步骤：称取净含量为10mg的罗红霉素并用乙腈定容至10ml而配制成浓度为1000mg/L的罗红霉素标准混合贮备液，取罗红霉素标准混合贮备液100μl用乙腈定容至10ml而配制成浓度为10mg/L的罗红霉素内标中间溶液；净含量为10mg的罗红霉素可以通过标准品说明书中所标示的纯度折算实际需要称取的毫克数。d、临时标准使用液配制步骤：取b步骤中制备而成的林可霉素盐酸盐混合中间标准液、红霉素混合中间标准液、泰乐菌素酒石酸盐混合中间标准液、竹桃霉素磷酸盐混合中间标准液、替米考星混合中间标准液、吉他霉素混合中间标准液、螺旋霉素混合中间标准液和交沙霉素混合中间标准液分别用乙腈配制成浓度为100μg/kg的一号林可霉素盐酸盐临时标准使用液、一号红霉素临时标准使用液、一号泰乐菌素酒石酸盐临时标准使用液、一号竹桃霉素磷酸盐临时标准使用液、一号替米考星临时标准使用液、一号吉他霉素临时标准使用液、一号螺旋霉素临时标准使用液和一号交沙霉素临时标准使用液；再取b步骤中制备而成的林可霉素盐酸盐混合中间标准液、红霉素混合中间标准液、泰乐菌素酒石酸盐混合中间标准液、竹桃霉素磷酸盐混合中间标准液、替米考星混合中间标准液、吉他霉素混合中间标准液、螺旋霉素混合中间标准液和交沙霉素混合中间标准液分别用乙腈配制成浓度为1000μg/kg的二号林可霉素盐酸盐临时标准使用液、二号红霉素临时标准使用液、二号泰乐菌素酒石酸盐临时标准使用液、二号竹桃霉素磷酸盐临时标准使用液、二号替米考星临时标准使用液、二号吉他霉素临时标准使用液、二号螺旋霉素临时标准使用液和二号交沙霉素临时标准使用液；再取c步骤中制备而成的罗红霉素内标中间溶液用乙腈配制成浓度为200μg/kg的罗红霉素内标临时标准使用液。

本实施例的蜂王浆样品处理工序中，a、先称取蜂王浆样品5g加入10ml水制得蜂王浆样品液，若本发明中所使用的蜂王浆样品为蜂王浆冻干粉，则应该将蜂王浆样品加入10ml水混合后再静置12-16h。b、将蜂王浆样品液置于100ml离心塑料瓶中，再向100ml离心塑料瓶中加入浓度为200μg/kg的罗红霉素内标临时标准使用液100μl并旋涡混合3min，然后静置15min后再向100ml离心塑料瓶中加入40ml体积浓度为97％的乙腈氨水提取液并混合均匀，采用体积浓度为97％的乙腈氨水做为提取液使得整个样品净化过程都无需使用固相萃取小柱；然后对置于100ml离心塑料瓶中的液体采用超声波仪进行超声提取10min，再采用离心机在转速为3000rpm下离心5min得到一号上清液。然后吸取25ml一号上清液置于50ml一号离心瓶中，再向50ml一号离心瓶中缓缓加入10g无水Na₂SO₄后立即用力振荡脱水，然后采用离心机在转速为3000rpm下离心2min得到二号上清液，将二号上清液置于50ml玻璃离心瓶中；再将5ml体积浓度为97％的乙腈氨水提取液置于50ml一号离心瓶中，然后向50ml一号离心瓶中缓缓加入10g无水Na₂SO₄后立即用力振荡脱水，也就是对残留在50ml一号离心瓶中的物质进行重复脱水操作，然后采用离心机在转速为3000rpm下离心2min得到三号上清液，将三号上清液置于50ml玻璃离心瓶中，从而得到二号上清液和三号上清液的混合物。接下来将装有二号上清液和三号上清液混合物的50ml玻璃离心瓶置于旋转蒸发器上并于35℃以下进行减压浓缩至干而得到残渣。然后用5ml磷酸盐缓冲溶液将减压浓缩而成的残渣移到15ml塑料离心管中，再向15ml塑料离心管中加入5ml乙酸乙酯并充分混合，然后提取1min，再对15ml塑料离心管中的液体采用离心机在转速为3000rpm下离心5min后分层，然后取乙酸乙酯层置于10ml离心管中并采用氮吹仪进行氮气吹干，再向10ml离心管中加入初始流动相1ml并进行超声溶解，然后加入2ml正己烷并用力手动振摇充分混合去脂，再采用离心机在转速为800rpm下离心2min而得到下层样液，将下层样液过0.22μm滤膜而制得上机检测样液。

本实施例的标准曲线制作工序中，先称取5份重量均为5.0g的阴性蜂王浆样品分别置于一号试剂瓶、二号试剂瓶、三号试剂瓶、四号试剂瓶和五号试剂瓶中，阴性蜂王浆样品对本领域技术人员来说为公知常识；然后向一号试剂瓶中加入一号林可霉素盐酸盐临时标准使用液、一号红霉素临时标准使用液、一号泰乐菌素酒石酸盐临时标准使用液、一号竹桃霉素磷酸盐临时标准使用液、一号替米考星临时标准使用液、一号吉他霉素临时标准使用液、一号螺旋霉素临时标准使用液和一号交沙霉素临时标准使用液各250μl制得一号阴性蜂王浆液；向二号试剂瓶中加入一号林可霉素盐酸盐临时标准使用液、一号红霉素临时标准使用液、一号泰乐菌素酒石酸盐临时标准使用液、一号竹桃霉素磷酸盐临时标准使用液、一号替米考星临时标准使用液、一号吉他霉素临时标准使用液、一号螺旋霉素临时标准使用液和一号交沙霉素临时标准使用液各500μl制得二号阴性蜂王浆液；向三号试剂瓶中加入二号林可霉素盐酸盐临时标准使用液、二号红霉素临时标准使用液、二号泰乐菌素酒石酸盐临时标准使用液、二号竹桃霉素磷酸盐临时标准使用液、二号替米考星临时标准使用液、二号吉他霉素临时标准使用液、二号螺旋霉素临时标准使用液和二号交沙霉素临时标准使用液各250μl制得三号阴性蜂王浆液；向四号试剂瓶中加入二号林可霉素盐酸盐临时标准使用液、二号红霉素临时标准使用液、二号泰乐菌素酒石酸盐临时标准使用液、二号竹桃霉素磷酸盐临时标准使用液、二号替米考星临时标准使用液、二号吉他霉素临时标准使用液、二号螺旋霉素临时标准使用液和二号交沙霉素临时标准使用液各400μl制得四号阴性蜂王浆液；向五号试剂瓶中加入二号林可霉素盐酸盐临时标准使用液、二号红霉素临时标准使用液、二号泰乐菌素酒石酸盐临时标准使用液、二号竹桃霉素磷酸盐临时标准使用液、二号替米考星临时标准使用液、二号吉他霉素临时标准使用液、二号螺旋霉素临时标准使用液和二号交沙霉素临时标准使用液各500μl制得五号阴性蜂王浆液。然后分别用一号阴性蜂王浆液、二号阴性蜂王浆液、三号阴性蜂王浆液、四号阴性蜂王浆液和五号阴性蜂王浆液来代替蜂王浆样品处理工序中的蜂王浆样品液，并重复蜂王浆样品处理工序中的b步骤而分别制得一号标准液、二号标准液、三号标准液、四号标准液和五号标准液，例如用一号阴性蜂王浆液来代替蜂王浆样品处理工序中的蜂王浆样品液，并重复蜂王浆样品处理工序中的b步骤而制得一号标准液。本实施例中的一号标准液、二号标准液、三号标准液、四号标准液和五号标准液的系列浓度为5μg/kg、10μg/kg、50μg/kg、80μg/kg和100μg/kg；将一号标准液、二号标准液、三号标准液、四号标准液和五号标准液通过高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪得到标准曲线。本实施例中的高效液相色谱仪采用液相梯度程序，表1为高效液相色谱仪的液相梯度洗脱程序表，三重四极杆串联质谱仪对林可霉素、红霉素、泰乐菌素、竹桃霉素、替米考星、吉他霉素、螺旋霉素和交沙霉素这八种药物残留及罗红霉素内标的质谱参考条件参见表2，表1和表2的内容如下：

表1高效液相色谱仪的液相梯度洗脱程序表

表2三重四极杆串联质谱仪对八种药物残留及内标的质谱参考条件表

注：表中带下划线黑体字为定量离子。

需要说明的是，本发明中的高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪均为现有技术，高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪的操作对本领域技术人员来说为公知常，故此处均不再详述。

本实施例的蜂王浆样品检测工序中，将蜂王浆样品处理工序中制得的上机检测样液通过高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪，并结合标准曲线而测得蜂王浆中林可霉素和大环内酯类的残留量；该方法的检测限达0.2-0.9μg/kg。

本发明中对样品的净化方法进行了优化，文献报道的药物残留检测方法和现行标准检测方法大多采用先液液萃取再固相萃取的方法来达到样品净化的目的，有的则只用有机溶剂直接液液萃取来净化样品，也有的用酸性溶液来沉淀样品中的蛋白质。由于林可霉素(Lincomycin，LIN)和大环内酯类(Macrolides，MALs)均为弱碱性化合物，在干燥状态下相当稳定，易溶于酸性水溶液。林可霉素盐酸盐水溶液的pH＝3.5-5.5，林可霉素的PKa是7.6；大环内酯类在酸性条件下(pH＜4)苷键水解，在碱性条件(pH＞9)内酯环开裂，在pH＝6-8的中性水溶液中较稳定，并易溶于乙酸乙酯等有机溶剂。此为液液萃取净化样品提供了理论支持，可以不用固相萃取技术，降低检测成本，而溶剂消耗并没有增加。

本发明研究了直接用乙腈、甲醇、乙酸乙酯等有机溶剂提取净化蜂王浆样品，结果发现处理后的样液中杂质多，颜色呈黄色，进样达到10个以上时，气帘板(curtain plate)即染上黄色，说明样品脏，影响仪器寿命，因而不适宜做大量的样品。研究了用酸先沉淀蛋白质，达到净化样品的目的，结果发现林可霉素和MALs的绝对回收率仅为10.2％-12.6％，这可能是因为蜂王浆的pH值在3.5-4.5之间时，其本身性质偏酸，再加入酸溶液，其样液的pH值必然小于4，易引起药物降解，导致回收率偏低。

蜂王浆含有大量的有机酸、蛋白质、氨基酸等物质，呈酸性，因此，本方法采用了乙腈-氨水溶液体系，提取药物残留。一方面，可以使样品溶液呈弱碱性，使药物呈稳定的分子状态，易被乙腈所提取；另一方面，可以使蜂王浆中的酸类物质呈盐，增加极性，从而不会被有机溶剂所溶解，达到净化目的。采用乙腈-氨水体系同时可以沉淀蛋白质。

研究了乙腈-氨水的混合比例，发现乙腈∶氨水＝97∶3(体积比)时，提取液的pH值最接近6-8，提取离心后分层明显。蜂王浆经过乙腈-氨水(97+3，体积比)溶液体系提取后，过无水硫酸钠脱水后蒸干，发现仍有少量杂质，故将蒸干后的试样用pH＝8.0的磷酸盐缓冲溶液溶解，用极性比乙腈更弱的乙酸乙酯再次反萃取净化。为了进一步净化样品，我们对进样前的样液进行脱脂处理，本方法采用了常用的烃类正己烷作为脱脂溶剂。

通过上述方法对样品进行净化，得到了无色澄明的进样样液，基质效应低，色谱图上目标峰无干扰，连续进样50次以上气帘板(curtain plate)仍无可见的污染，说明样品净化良好。

本发明对高效液相色谱仪的液相色谱条件进行优化，为了保证不同性质的多残留在色谱柱上的分离效率，在本方法的研究中，我们拟选用Hypersil、Akasil、Venusil MP、Shim-pack VP、Inertsil、Atlantis、Agilent等型号的色谱柱，寻找分离度及保留时间稳定性好、灵敏度高、峰形窄而对称、定量离子无干扰、性价比优良的色谱柱，经过试验，发现InertsilC8-3色谱柱的灵敏度最好，峰形尖锐，性价比高，故被本方法采用。

本方法的流动相采用了常用的酸性水相和有机相并作梯度洗脱，以提高分离度和灵敏度，常用酸主要有甲酸、乙酸，我们根据实际情况，研究流动相中不同浓度的甲酸或乙酸对分离效果的影响，分别用体积浓度为0.1％、0.2％、0.4％、1.0％(V/V)的甲酸或乙酸，并选择合适的挥发性盐类，提高离子化效率，以获得分离良好，峰形对称、信号强度大、灵敏度高的色谱图，结果体积浓度为0.1％甲酸溶液的色谱峰信号最强。

为了提高被测化合物的离子化效率，研究了流动相中挥发性盐类乙酸铵的最适浓度，发现流动相水相中含有50mmol/L的乙酸铵时色谱信号得到最大幅度的增强，提高了灵敏度。但是，流动相中高浓度的盐类对色谱柱、质谱仪均会产生污染，影响设备的使用寿命。故在样液中的水相添加50mmol/L的乙酸铵，而流动相中水相仍含0.5mmol/L的乙酸铵，经过试验，表明这样仍能保证足够的灵敏度。

采用不同的梯度条件，分析色谱柱对多残留的色谱行为，优选出最佳梯度条件。同时优化流动相流速、柱温，以取得最优的色谱图，优化结果参见表1。

本发明对三重四极杆串联质谱仪的质谱条件进行优化，配制1ppm浓度的各种残留标准溶液，用针泵以5μL/mL的流速进入质谱仪，以正离子模式进行Q1MS(Q1)全扫描，确定分子离子峰，调节离子源电压、DP、EP参数，再以分子离子峰作为母离子，进行子离子扫描，调节CE参数，使母离子的强度占子离子强度的1/3～1/4为最佳，从质谱图中选择2-4个信号较强的子离子作为定性离子，离子丰度最强的子离子为定量离子，采用针泵流动注射标准溶液，手动运行RAMP进行参数优化。

质谱参数确定后，连接液相色谱进样，由于各种残留的离子源温度、辅助加热气、干燥气、气帘气、电喷雾电压等参数在单纯质谱条件下是不一样的，因此选择适中的一组参数在液相条件下再进行优化，在液相条件下进样10μg/kg的混标，再逐个进行优化与微调，使各种物质的灵敏度、峰形达到最佳。经过多次调整得到目前最佳质谱条件参见表2。

下面来对本发明的线性范围、检出限、回收率和精密度进行分析，配制八种残留的系列阴性样品基质混合标准溶液，按照本方法设定的色谱条件进样测定。以y表示峰面积(A)，x表示浓度C(μg/kg)，运用EXCEL软件，求得回归方程和线性相关系数，得到线性范围，八种残留线性范围为5μg/kg-100μg/kg，线性相关系数为0.9914-0.9994，检出限(以信噪比S/N＝3计)为0.2-0.9μg/kg，定量限(以信噪比S/N＝10计)为0.6-2.6μg/kg。在蜂王浆阴性样品中，分别添加三个浓度的残留标准品，每个浓度做三次平行试验，按本方法进行样品的处理与测定，确定本方法的回收率和相对标准偏差，结果参见表3。

表3方法的线性范围、检出限、回收率、精密度和检测限表(n＝3)

本发明能够同时测定蜂王浆中的林可霉素、大环内酯类药物残留，与固相萃取方法相比不增加溶剂用量，不采用固相萃取小柱，净化后的样品无色透明，在质谱图上无干扰，连续进样50次，离子源气帘板(curtin plate)仍保持干净，样品净化效果良好。

本发明的检测限达到0.2-0.9μg/kg，相关系数在0.9914-0.9994，回收率在76.7％-119％，相对标准偏差在6.7％-14.1％，精密度良好，完全满足进口国对蜂王浆中药物残留限量的要求。

本发明充分发挥了质谱的优势，利用一种样品净化方法，同时检测多种残留，提高了检测效率，利于原料收购筛选、及时指导生产加工。由于基质效应的存在，给方法定量带来困难，本方法采用罗红霉素为内标，用阴性基质样品添加标准品绘制标准曲线来消除基质的影响，定量结果准确。

本发明的方法简单，快速，准确，试剂用量少，检测成本低；能够节约人力，提高效率；检测限小于1μg/kg，能够充分满足目前国外对蜂王浆中林可霉素、大环内酯类残留限量的要求。

虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该项技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更动与润饰，均应属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种同时测定蜂王浆中林可霉素和大环内酯类残留量的方法，其特征在于：该方法所用到的原料包括纯度＞99.5％的林可霉素盐酸盐，纯度＞92.2％的红霉素，纯度＞95.0％的泰乐菌素酒石酸盐，纯度＞96.5％的竹桃霉素磷酸盐，纯度＞98.5％的替米考星，纯度＞72.0％的吉他霉素，纯度＞96.0％的螺旋霉素，纯度＞97.5％的罗红霉素，纯度＞98.0％的交沙霉素，为农残级的乙酸乙酯，为分析纯的氨水、磷酸二氢钠、氢氧化钠和无水Na₂SO₄，为优级纯的正己烷，为液相色谱纯的乙腈和乙酸铵，磷酸盐缓冲溶液，初始流动相，水；所述磷酸盐缓冲溶液通过13.8g磷酸二氢钠溶解于950mL水中，再用0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值到8.0，最后用水稀释至1L制备而成；所述初始流动相中的有机相为乙腈，水相中含有体积浓度为0.1％的甲酸和浓度为0.5mmol/L的乙酸铵，所述有机相与水相的体积比为5∶95；所述大环内酯类抗生素为红霉素、泰乐菌素、竹桃霉素、替米考星、吉他霉素、螺旋霉素和交沙霉素；

该方法所用到的设备包括三重四极杆串联质谱仪，配有二元泵、在线脱气机、自动进样器、数据处理软件的高效液相色谱仪，旋转蒸发器；所述三重四极杆串联质谱仪中的离子源温度为600℃，辅助加热气GS1为70psi，干燥气GS2为70psi，气帘气CUR为20psi，碰撞气CAD为2psi，电喷雾电压IS为4700V，离子化法为正离子模式；所述高效液相色谱仪为Agilent 1200 series，色谱柱为Inertsil C8-3，色谱柱的规格为2.1×150mm，3μm，进样量为20μl；

该方法包括标准溶液制备工序、蜂王浆样品处理工序、标准曲线制作工序和蜂王浆样品检测工序；所述标准溶液制备工序如下：a、混合贮备标准溶液配制步骤：各称取净含量为10mg的林可霉素盐酸盐、红霉素、泰乐菌素酒石酸盐、竹桃霉素磷酸盐、替米考星、吉他霉素、螺旋霉素和交沙霉素，分别采用乙腈定容至10ml而配制成浓度均为1000mg/L的林可霉素盐酸盐标准混合贮备液、红霉素标准混合贮备液、泰乐菌素酒石酸盐标准混合贮备液、竹桃霉素磷酸盐标准混合贮备液、替米考星标准混合贮备液、吉他霉素标准混合贮备液、螺旋霉素标准混合贮备液和交沙霉素标准混合贮备液，将上述林可霉素盐酸盐标准混合贮备液、红霉素标准混合贮备液、泰乐菌素酒石酸盐标准混合贮备液、竹桃霉素磷酸盐标准混合贮备液、替米考星标准混合贮备液、吉他霉素标准混合贮备液、螺旋霉素标准混合贮备液和交沙霉素标准混合贮备液置于-18℃以下保存待用；b、混合中间标准液配制步骤：分别取a中的林可霉素盐酸盐标准混合贮备液、红霉素标准混合贮备液、泰乐菌素酒石酸盐标准混合贮备液、竹桃霉素磷酸盐标准混合贮备液、替米考星标准混合贮备液、吉他霉素标准混合贮备液、螺旋霉素标准混合贮备液和交沙霉素标准混合贮备液各100μl，分别采用乙腈定容至10ml而配制成浓度均为10mg/L的林可霉素盐酸盐混合中间标准液、红霉素混合中间标准液、泰乐菌素酒石酸盐混合中间标准液、竹桃霉素磷酸盐混合中间标准液、替米考星混合中间标准液、吉他霉素混合中间标准液、螺旋霉素混合中间标准液和交沙霉素混合中间标准液；c、罗红霉素内标配制步骤：称取净含量为10mg的罗红霉素并用乙腈定容至10ml而配制成浓度为1000mg/L的罗红霉素标准混合贮备液，取罗红霉素标准混合贮备液100μl用乙腈定容至10ml而配制成浓度为10mg/L的罗红霉素内标中间溶液；d、临时标准使用液配制步骤：取林可霉素盐酸盐混合中间标准液、红霉素混合中间标准液、泰乐菌素酒石酸盐混合中间标准液、竹桃霉素磷酸盐混合中间标准液、替米考星混合中间标准液、吉他霉素混合中间标准液、螺旋霉素混合中间标准液和交沙霉素混合中间标准液分别用乙腈配制成浓度为100μg/kg的一号林可霉素盐酸盐临时标准使用液、一号红霉素临时标准使用液、一号泰乐菌素酒石酸盐临时标准使用液、一号竹桃霉素磷酸盐临时标准使用液、一号替米考星临时标准使用液、一号吉他霉素临时标准使用液、一号螺旋霉素临时标准使用液和一号交沙霉素临时标准使用液，再取林可霉素盐酸盐混合中间标准液、红霉素混合中间标准液、泰乐菌素酒石酸盐混合中间标准液、竹桃霉素磷酸盐混合中间标准液、替米考星混合中间标准液、吉他霉素混合中间标准液、螺旋霉素混合中间标准液和交沙霉素混合中间标准液分别用乙腈配制成浓度为1000μg/kg的二号林可霉素盐酸盐临时标准使用液、二号红霉素临时标准使用液、二号泰乐菌素酒石酸盐临时标准使用液、二号竹桃霉素磷酸盐临时标准使用液、二号替米考星临时标准使用液、二号吉他霉素临时标准使用液、二号螺旋霉素临时标准使用液和二号交沙霉素临时标准使用液，再取罗红霉素内标中间溶液用乙腈配制成浓度为200μg/kg的罗红霉素内标临时标准使用液；

所述蜂王浆样品处理工序中，a、先称取蜂王浆样品5g加入10ml水制得蜂王浆样品液；b、然后将蜂王浆样品液置于100ml离心塑料瓶中，再向100ml离心塑料瓶中加入浓度为200μg/kg的罗红霉素内标临时标准使用液100μl并旋涡混合3min，然后静置15min后再向100ml离心塑料瓶中加入40ml体积浓度为97％的乙腈氨水提取液并混合均匀，然后对置于100ml离心塑料瓶中的液体进行超声提取10min，再在转速为3000rpm下离心5min得到一号上清液；吸取25ml一号上清液置于50ml一号离心瓶中，再向50ml一号离心瓶中缓缓加入10g无水Na₂SO₄后立即用力振荡脱水，然后在转速为3000rpm下离心2min得到二号上清液，将二号上清液置于50ml玻璃离心瓶中，再将5ml体积浓度为97％的乙腈氨水提取液置于50ml一号离心瓶中，然后向50ml一号离心瓶中缓缓加入10g无水Na₂SO₄后立即用力振荡脱水，然后在转速为3000rpm下离心2min得到三号上清液，将三号上清液置于50ml玻璃离心瓶中；将50ml玻璃离心瓶中的液体置于旋转蒸发器上于35℃以下减压浓缩至干得到残渣，然后用5ml磷酸盐缓冲溶液将残渣移到15ml塑料离心管中，再向15ml塑料离心管中加入5ml乙酸乙酯并充分混合，然后提取1min，再对15ml塑料离心管中的液体在转速为3000rpm下离心5min后分层，然后取乙酸乙酯层置于10ml离心管中并用氮气吹干，再向10ml离心管中加入初始流动相1ml并进行超声溶解，然后加入2ml正己烷并用力手动振摇充分混合去脂，再在转速为800rpm下离心2min而得到下层样液，将下层样液过0.22μm滤膜而制得上机检测样液；

所述标准曲线制作工序中，先称取5份重量均为5.0g的阴性蜂王浆样品分别置于一号试剂瓶、二号试剂瓶、三号试剂瓶、四号试剂瓶和五号试剂瓶中，然后向一号试剂瓶中加入一号林可霉素盐酸盐临时标准使用液、一号红霉素临时标准使用液、一号泰乐菌素酒石酸盐临时标准使用液、一号竹桃霉素磷酸盐临时标准使用液、一号替米考星临时标准使用液、一号吉他霉素临时标准使用液、一号螺旋霉素临时标准使用液和一号交沙霉素临时标准使用液各250μl制得一号阴性蜂王浆液；向二号试剂瓶中加入一号林可霉素盐酸盐临时标准使用液、一号红霉素临时标准使用液、一号泰乐菌素酒石酸盐临时标准使用液、一号竹桃霉素磷酸盐临时标准使用液、一号替米考星临时标准使用液、一号吉他霉素临时标准使用液、一号螺旋霉素临时标准使用液和一号交沙霉素临时标准使用液各500μl制得二号阴性蜂王浆液；向三号试剂瓶中加入二号林可霉素盐酸盐临时标准使用液、二号红霉素临时标准使用液、二号泰乐菌素酒石酸盐临时标准使用液、二号竹桃霉素磷酸盐临时标准使用液、二号替米考星临时标准使用液、二号吉他霉素临时标准使用液、二号螺旋霉素临时标准使用液和二号交沙霉素临时标准使用液各250μl制得三号阴性蜂王浆液；向四号试剂瓶中加入二号林可霉素盐酸盐临时标准使用液、二号红霉素临时标准使用液、二号泰乐菌素酒石酸盐临时标准使用液、二号竹桃霉素磷酸盐临时标准使用液、二号替米考星临时标准使用液、二号吉他霉素临时标准使用液、二号螺旋霉素临时标准使用液和二号交沙霉素临时标准使用液各400μl制得四号阴性蜂王浆液；向五号试剂瓶中加入二号林可霉素盐酸盐临时标准使用液、二号红霉素临时标准使用液、二号泰乐菌素酒石酸盐临时标准使用液、二号竹桃霉素磷酸盐临时标准使用液、二号替米考星临时标准使用液、二号吉他霉素临时标准使用液、二号螺旋霉素临时标准使用液和二号交沙霉素临时标准使用液各500μl制得五号阴性蜂王浆液；然后分别用一号阴性蜂王浆液、二号阴性蜂王浆液、三号阴性蜂王浆液、四号阴性蜂王浆液和五号阴性蜂王浆液来代替蜂王浆样品处理工序中的蜂王浆样品液，并重复蜂王浆样品处理工序中的b步骤而分别制得一号标准液、二号标准液、三号标准液、四号标准液和五号标准液，该一号标准液、二号标准液、三号标准液、四号标准液和五号标准液的系列浓度为5μg/kg、10μg/kg、50μg/kg、80μg/kg和100μg/kg；将一号标准液、二号标准液、三号标准液、四号标准液和五号标准液通过高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪得到标准曲线；所述高效液相色谱仪中的流动相成分、流速和比例如下：

所述蜂王浆样品检测工序中，将蜂王浆样品处理工序中制得的上机检测样液通过高效液相色谱仪和三重四极杆串联质谱仪，并结合标准曲线而测得蜂王浆中林可霉素和大环内酯类的残留量；该方法的检测限达0.2-0.9μg/kg。

2.根据权利要求1所述的同时测定蜂王浆中林可霉素和大环内酯类残留量的方法，其特征在于：所述蜂王浆样品处理工序中所用的蜂王浆样品为蜂王浆冻干粉，该蜂王浆样品加入10ml水混合后再静置12-16h，然后再按照蜂王浆样品处理工序中的b步骤进行。

3.根据权利要求1所述的同时测定蜂王浆中林可霉素和大环内酯类残留量的方法，其特征在于：该方法所使用的水均为双重蒸馏水。

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