CN103424480B - 可食性动物组织中红霉素残留检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明为可食性动物组织中红霉素残留检测方法，属于兽药残留检测技术领域，具体涉及动物组织中红霉素残留高效液相色谱柱前衍生化反应分析方法。红霉素药物含有羟基基团与9-芴代甲氧苯酰氯发生反应，产物具有较高紫外信号响应。在偏碱性的磷酸二氢钾缓冲溶液中，用衍生化试剂9-芴代甲氧苯酰氯在水浴45℃下衍生红霉素1h，反应结束后冷却至室温上HPLC分析检测，得到比较稳定的衍生产物，对红霉素标准衍生物溶液用二极管阵列检测器进行紫外光谱扫描，在264nm处有最大吸收。本方法的灵敏度为4μg/kg，在0.1～2μg/mL范围内对峰面积呈线性响应，结果重现性良好，批内、批间变异系数CV≤15％。本发明各项指标均能满足红霉素药物残留分析的要求，灵敏度有较大提高。

Description

可食性动物组织中红霉素残留检测方法

技术领域

本发明属于兽药残留分析技术领域，涉及动物组织中可食性组织中红霉素残留检测方法。

背景技术

红霉素（Erythromycin,EM）又名威霉素，分子式C₃₇H₆₇NO₁₃，分子量为733.93，熔点为138～140℃，呈弱碱性。红霉素为白色或类白色结晶或粉末；无臭；味苦；微有引湿性。红霉素在甲醇、乙醇或丙酮中易溶，在水中有极微溶解。0.066%水溶液的pH值应为8.0～10.5。红霉素的干燥状态或在中性和弱碱性液中较为稳定，而在酸性条件下不稳定，pH值低于4时迅即破坏。其结构式如下：

红霉素是一种动物专用的大环內酯类抗生素，在临床中主要用于耐青霉素金黄葡萄球菌及其他敏感菌所致的各种感染，如肺炎、子宫炎、乳腺炎、败血症等。对鸡支原体病（慢性呼吸道病）和传染性鼻炎也有相当疗效。也可配成眼膏或软膏用于皮肤和眼部感染。对鱼类白头白嘴病、烂鳃病及肾脏病有良好的疗效，红霉素可作为青霉素过敏动物的替代药物。红霉素具有菌谱广、疗效显著、耐药性少，各种途径给药均易吸收和分布等特点，因而广泛用于医学临床。

国外对红霉素的毒性以及在动物体内的药物动力学已有研究。据报道，红霉素在体内代谢早、排泄快，即使长时间使用也无蓄积性毒性。但对红霉素作为饲料添加剂使用，引起许多争论，认为其存在潜在危险：易引起胃肠道反应，可有恶心、呕吐、腹痛及腹泻，反应与剂量大小有关。过敏反应，可有荨麻疹及药物热。可引起肝脏损害，如血清丙氨酸氨基转移酶升高，出现黄疸等。静注或静滴乳糖酸红霉素可引起血栓性静脉炎，静注发生的可能性较多。肌注局部刺激性大，可引起疼痛及硬结，因此不宜肌注。

由于红霉素的毒、副作用以及滥用抗生素给人带来的危害，世界各国对红霉素的使用和在食品中的残留量进行了规定。欧盟、美国和日本等主要国家（或组织）都制定了动物性食品中红霉素最高残留限量。中国农业部也颁布了《动物性食品中兽药最高残留限量》，见表1。

表1中国农业部规定的大环内酯类在动物组织中的最高残留限量

目前中国国内主要是采用液相色谱串联质谱法检测水产品中的红霉素。中华人民共和国国家标准GB/T20762-2006规定了畜禽肉中林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉它霉素和交沙霉素残留量的测定（采用液相色谱串联质谱法）；中华人民共和国国家标准GB/T22946-2008规定了蜂王浆和蜂王浆冻干粉中林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、克林霉素、吉他霉素和交沙霉素残留量的测定（采用液相色谱-串联质谱法）；中华人民共和国国家标准GB/T22988-2008.中规定了牛奶和奶粉中螺旋霉素、吡利霉素、竹桃霉素、替米卡星、红霉素和泰乐菌素残留量的测定（采用液相色谱-串联质谱法）。由此可见液相色谱串联质谱法检测红霉素残留尤其是大环内酯一类药物残留的报道较多，上述三个国家标准都是确证方法，筛选方法相对较少，牛、羊、猪、禽的肌肉、脂肪、肝脏、肾脏及牛奶、鸡蛋中红霉素的残留检测HPLC筛选法未见报道。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种反应快速高效、操作简便的动物性食品中红霉素残留分析方法，本发明以9-芴代甲氧苯酰氯溶液作为衍生化试剂，与含羟基的红霉素药物进行衍生化反应，然后通过高效液相色谱进行分离，紫外分光光度计测定表明，含羟基的红霉素药物与9-芴代甲氧苯酰氯反应产物在264nm处有最大吸收，紫外信号响应较高，具有灵敏度高，反应快速高效，操作简便等特点。

本发明的方法为牛、羊、猪、禽的肌肉、脂肪、肝脏、肾脏及牛奶、鸡蛋各组织中的红霉素残留检测提供了一种灵敏、可靠的检测和监测方法，对于提高畜禽产品的质量、增加出口创汇、保障人类健康，均具有十分重要的意义和实用价值。

9-芴代甲氧苯酰氯中含有活性基团，可以与药物中的羟基相互作用，得到的产物在264nm处有最大吸收波长，紫外信号响应较高。

本发明衍生化试剂为9-芴代甲氧苯酰氯溶液，该物质与含羟基的红霉素药物发生衍生化反应具有反应速度快、反应产物紫外信号响应高等特点，在反应温度45℃时，反应时间为60min，其衍生产物在波长264nm时具有最大的紫外吸收强度。

实现本发明的技术方案是：

一种红霉素药物残留的分析方法，在偏碱性的磷酸二氢钾缓冲溶液中，用衍生化试剂9-芴代甲氧苯酰氯在水浴条件下与含羟基的红霉素药物进行衍生化反应，生成比较稳定的红霉素的衍生产物，然后通过高效液相色谱进行分离检测，衍生化反应方程式如下：

我们确立了羟基化合物标样与9-芴代甲氧苯酰氯进行衍生化反应的条件→衍生产物高效液相色谱（HPLC）分离检测方法的建立→样本的分析检测的技术路线。

本发明的具体步骤是：

1、羟基化合物与9-芴代甲氧苯酰氯的衍生化反应

将净化后氮气吹干后的样本残渣，用600μL乙腈溶解，加入300μL0.1mol/L KH2PO4溶液（pH7.5）和100μL0.5mg/mL FMOC-CL，混合均匀后于45℃下反应1h。反应结束后，冷至室温，在室温放置20min后，取20μL，供高效液相色谱测定。

2、技术条件如下：

色谱柱：Agilent extend-C18柱，250mm×4.6mm×5μm。

柱温：40℃；

流动相：A:磷酸氢二钾缓冲溶液0.03mol/L（pH6.5）B：乙腈

流速：0.8mL/min；

检测器：紫外检测器，波长：264nm；

上述衍生反应的具体条件为：衍生化反应体系中9-芴代甲氧苯酰氯与含羟基的红霉素药的最佳摩尔比为1:5～10；反应体系最佳pH值为7.5，最佳反应温度为45℃；最佳反应时间60min。

本发明克服了液相法柱后反应检测不易找到合适的流动相及反应过程难以控制的缺陷，较现有的检测方法灵敏度提高了10倍，更适合残留痕量分析。

附图说明

图1：牛奶红霉素空白样品色谱图。

图2：牛奶红霉素添加样品4μg/kg色谱图。

图3：牛奶红霉素添加样品40μg/kg色谱图。

图4：牛奶中红霉素添加样品80μg/kg色谱图。

图5：鸡蛋红霉素空白样品色谱图。

图6：鸡蛋红霉素添加样品10μg/kg色谱图。

图7：鸡蛋红霉素添加样品200μg/kg色谱图。

图8：鸡蛋红霉素添加样品400μg/kg色谱图。

图9：猪肌肉红霉素空白样品色谱图。

图10：猪肌肉红霉素添加样品10μg/kg色谱图。

图11：猪肌肉红霉素添加样品200μg/kg色谱图。

图12：猪肌肉红霉素添加样品400μg/kg色谱图。

图13：牛肌肉红霉素空白样品色谱图。

图14：牛肌肉红霉素添加样品10μg/kg色谱图。

图15：牛肌肉红霉素添加样品200μg/kg色谱图。

图16：牛肌肉红霉素添加样品400μg/kg色谱图。

图17：羊肌肉红霉素空白样品色谱图。

图18：羊肌肉红霉素添加样品10μg/kg色谱图。

图19：羊肌肉红霉素添加样品200μg/kg色谱图。

图20：羊肌肉红霉素添加样品400μg/kg色谱图。

图21：鸡肌肉红霉素空白样品色谱图。

图22：鸡肌肉红霉素添加样品10μg/kg色谱图。

图23：鸡肌肉红霉素添加样品200μg/kg色谱图。

图24：鸡肌肉红霉素添加样品400μg/kg色谱图。

图25：猪肝脏红霉素空白样品色谱图。

图26：猪肝脏红霉素添加样品10μg/kg色谱图。

图27：猪肝脏红霉素添加样品200μg/kg色谱图。

图28：猪肝脏红霉素添加样品400μg/kg色谱图。

图29：猪肾脏红霉素空白样品色谱图。

图30：猪肾脏红霉素添加样品10μg/kg色谱图。

图31：猪肾脏红霉素添加样品200μg/kg色谱图。

图32：猪肾脏红霉素添加样品400μg/kg色谱图。

图33：猪脂肪红霉素空白样品色谱图。

图34：猪肾脏红霉素添加样品10μg/kg色谱图。

图35：猪肾脏红霉素添加样品200μg/kg色谱图。

图36：猪肾脏红霉素添加样品400μg/kg色谱图。

图37：牛肝脏红霉素空白样品色谱图。

图38：牛肝脏红霉素添加样品10μg/kg色谱图。

图39：牛肝脏红霉素添加样品200μg/kg色谱图。

图40：牛肝脏红霉素添加样品400μg/kg色谱图。

图41：羊肝脏红霉素空白样品色谱图。

图42：羊肝脏红霉素添加样品10μg/kg色谱图。

图43：羊肝脏红霉素添加样品200μg/kg色谱图。

图44：羊肝脏红霉素添加样品400μg/kg色谱图。

图45：羊肾脏红霉素空白样品色谱图。

图46：羊肾脏红霉素添加样品10μg/kg色谱图。

图47：羊肾脏红霉素添加样品200μg/kg色谱图。

图48：羊肾脏红霉素添加样品400μg/kg色谱图。

图49：鸡肝脏红霉素空白样品色谱图。

图50：鸡肝脏红霉素添加样品10μg/kg色谱图。

图51：鸡肝脏红霉素添加样品200μg/kg色谱图。

图52：鸡肝脏红霉素添加样品400μg/kg色谱图。

图53：牛肾脏红霉素空白样品色谱图。

图54：牛肾脏红霉素添加样品10μg/kg色谱图。

图55：牛肾脏红霉素添加样品200μg/kg色谱图。

图56：牛肾脏红霉素添加样品400μg/kg色谱图。

图57：牛脂肪红霉素空白样品色谱图。

图58：牛脂肪红霉素添加样品10μg/kg色谱图。

图59：牛脂肪红霉素添加样品200μg/kg色谱图。

图60：牛脂肪红霉素添加样品400μg/kg色谱图。

图61：羊脂肪红霉素空白样品色谱图。

图62：羊脂肪红霉素添加样品10μg/kg色谱图。

图63：羊脂肪红霉素添加样品200μg/kg色谱图。

图64：羊脂肪红霉素添加样品400μg/kg色谱图。

具体实施方式

实施例1：羟基化合物与9-芴代甲氧苯酰氯的衍生化反应

（1）红霉素与9-芴代甲氧苯酰氯衍生化反应

精确称取红霉素10.0mg，用甲醇溶解，定容至10mL，配成1mg/mL的标准贮备液。准确移取红霉素标准储备液适量，用乙腈依次稀释成浓度分别为10μg/L、50μg/L、100μg/L、250μg/L、500μg/L、1000μg/L、2000μg/L、4000μg/L的标准工作液，用600μL标准溶液，加入300μL0.1mol/L KH2PO4溶液（pH7.5）和100μL0.5mg/mL FMOC—CL，混合均匀后于45℃下反应1h。反应结束后，冷至室温，在室温放置20min后，取20μL，供高效液相色谱测定。

（2）衍生产物HPLC检测

按如下HPLC检测条件进行测定：高效液相色谱柱-Agilent extend-C18色谱柱（250mm×4.6mm×5μm）；柱温-40℃；流动相-A:磷酸氢二钾缓冲溶液0.03mol/L（pH6.5），B：乙腈；流速-0.8mL/min；洗脱梯度-见表2；紫外检测器波长-264nm。梯度洗脱程序见表2。

表2梯度洗脱程序（V_A+V_B）

（3）衍生产物检测结果分析

每个浓度重复3次，将测得的峰面积与相对应浓度绘制标准曲线（参考文献），求回归方程和相关系数。本发明中红霉素溶液线性范围为0.1～2μg/mL，标准曲线回归方程y=2E+0.7x-452290，R2＝0.9997，表明分析方法和仪器条件合理可用。

实施例2：样本测定、分析

（1）样本的处理

选择牛、羊、猪、禽的肌肉、肝脏、肾脏、脂肪和牛奶、鸡蛋为实验样本，对红霉素进行添加回收实验（试验方法参见文献：）。将不同浓度红霉素标准溶液添加到空白组织样品中，使样品中的红霉素浓度分别为4、200和400μg/kg，（牛奶中的红霉素浓度为4、40和80μg/kg），按样品处理方法，提取、净化、衍生化，然后进行HPLC分析（试验方法参见文献：）。每个浓度5个重复，进行5次单独试验，用外标法计算回收率和日间（或批间）变异系数。

1）样品提取：准确称取上述牛、羊、猪、禽的肌肉、肝脏、肾脏、脂肪和牛奶、鸡蛋5g试样（精确到0.01g）置于50mL塑料离心管中，加入2g无水硫酸钠，匀质1min；加入10mL乙腈，混合漩涡1min，室温下超声10min，在6000rpm下离心10min，将上清液倒入另一50mL塑料离心管中，残渣按上法再加入5mL乙腈重复提取一次，合并两次提取液，向提取液中加入5mL正己烷，充分振荡5min，在4000rpm下离心5min，除去正己烷层，将乙腈层在45℃水浴下氮气吹干。

2）净化：

a)牛、羊、猪、禽的肌肉、肝脏、肾脏：向上述处理过的已经吹干的离心管中加入5mL水溶解其残留物；依次用5mL甲醇和5mL水活化固相萃取柱，将待净化的水溶解液加入固相萃取柱中，依靠重力过柱，试样液过柱完毕后，用5mL水淋洗，再用3mL0.1mol/L磷酸氢二钾溶液（pH9.3）洗柱，弃去淋洗液，再用泵抽干5min，用3mL甲醇洗脱，将洗脱液接收至10mL离心管中，40℃水浴下氮气吹干；

b)牛奶、鸡蛋：不过磺酸型阳离子（oasis MCX）固相萃取柱；

c)脂肪：向上述处理过的已经吹干的离心管中加入5mL水溶解其残留物；依次用5mL甲醇和5mL水活化固相萃取柱，将待净化的水溶解液加入固相萃取柱中，依靠重力过柱，试样液过柱完毕后，用5mL水淋洗，然后加入3mL0.1mol/LK₂HPO₄溶液（pH9.3）加入到经氮气吹干的10mL离心管中，向其加入2mL二氯甲烷，震荡萃取2min，于4000rpm下离心5min，将二氯甲烷层取至另一10mL离心管中，重复萃取3次，合并二氯甲烷层，40℃水浴下氮气吹干；

3）衍生化：用600μL乙腈溶解残渣，加入300μL0.1mol/L KH₂PO₄溶液（pH7.5）和100μL0.5mg/mL9-芴代甲氧苯酰氯，混合均匀后于45℃下反应1h，反应结束后，冷至室温，在室温放置20min后，取20μL用高效液相色谱分析。

（2）样本的测定

采用高效液相色谱-紫外检测器检测，按如下HPLC检测条件进行测定：高效液相色谱柱-Agilent extend-C18色谱柱（250mm×4.6mm×5μm）；柱温-40℃；流动相-A:磷酸氢二钾缓冲溶液0.03mol/L（pH6.5），B：乙腈；流速-0.8mL/min；洗脱梯度-见表2；紫外检测器波长-264nm。（3）测定结果分析

本发明在牛、羊、猪、禽的肌肉、肝脏、肾脏、脂肪和牛奶、鸡蛋组织中的检测限为2μg/kg，定量限为4μg/kg，在牛、羊、猪、禽的肌肉、肝脏、肾脏、脂肪和鸡蛋组织中添加4μg/kg、100μg/kg、200μg/kg浓度的回收率为70%～110%，牛奶组织中添加4μg/kg、40μg/kg、80μg/kg浓度的回收率为70%～110%。本发明在牛、羊、猪、禽的肌肉、肝脏、肾脏、脂肪和牛奶、鸡蛋组织中，批内、批间变异系数CV≤15%。可以满足残留检测要求。

本发明建立的畜禽可食性组织样品中的红霉素残留的检测方法，其灵敏度、准确度和精密度均符合中国农业部规定的兽药残留检测要求，亦可试用于其它动物性食品中泰乐菌素的残留检测，具有检测的范围广、检测成本、低操作简单、耗时较短、重复性好、回收率高、灵敏度高的优势，在牛、羊、猪、禽的肌肉、脂肪、肝脏、肾脏及牛奶、鸡蛋的检测限均为4μg/kg。

Claims (1)

1.一种动物性食品中红霉素药物残留的分析方法，其特征在于下列步骤：

(1)样本的处理

准确称取牛、羊、猪、禽的肌肉、肝脏、肾脏、脂肪和牛奶、鸡蛋5g试样，置于50mL塑料离心管中，加入2g无水硫酸钠，匀质1min；再加入10mL乙腈，混合漩涡1min，室温下超声10min，在6000rpm下离心10min，将上清液倒入另一50mL塑料离心管中，残渣按上述方法再加入5mL乙腈重复提取一次，合并两次提取液，向提取液中加入5mL正己烷，充分振荡5min，在4000rpm下离心5min，除去正己烷层，将乙腈层在45℃水浴下氮气吹干；

(2)净化：

a)牛、羊、猪、禽的肌肉、肝脏、肾脏：向处理过的已经吹干的离心管中加入5mL水溶解其残留物；依次用5mL甲醇和5mL水活化固相萃取柱，将待净化的水溶解液加入固相萃取柱中，依靠重力过柱，试样液过柱完毕后，用5mL水淋洗，再用3mL浓度为0.1mol/L，pH值为9.3的洗柱，弃去淋洗液，再用泵抽干5min，用3mL甲醇洗脱，将洗脱液接收至10mL离心管中，40℃水浴下氮气吹干；

b)牛奶、鸡蛋：不需要过磺酸型阳离子固相萃取柱，直接进行衍生化；

c)脂肪：向处理过的已经吹干的离心管中加入5mL水溶解其残留物；依次用5mL甲醇和5mL水活化固相萃取柱，将待净化的水溶解液加入固相萃取柱中，依靠重力过柱，试样液过柱完毕后，用5mL水淋洗，再用3mL浓度为0.1mol/L，pH值为9.3的K₂HPO₄溶液淋洗，抽干；用甲醇洗脱，将洗脱液加入到经氮气吹干的10mL离心管中，向其中加入2mL二氯甲烷，震荡萃取2min，于4000rpm下离心5min，将二氯甲烷层取至另一10mL离心管中，重复萃取3次，合并二氯甲烷层，在40℃水浴下用氮气吹干；

(3)衍生化：用600μL乙腈溶解残渣，加入300μL浓度为0.1mol/L，pH值为7.5的KH₂PO₄溶液和100μL浓度为0.5mg/mL的9-芴代甲氧苯酰氯，混合均匀后于45℃下反应1h，反应结束后，冷至室温，在室温下放置20min后，取20μL用高效液相色谱分析；

(4)样本的测定

高效液相色谱-紫外检测器检测按如下HPLC检测条件进行测定：

250mm×4.6mm×5μm的高效液相色谱柱-Agilent extend-C18；柱温为40℃；

流动相A:pH值为6.5的磷酸氢二钾缓冲溶液0.03mol/L，流动相B：乙腈；流速0.8mL/min；柱温-40℃；紫外检测器波长-264nm；

A相：B相的梯度洗脱程序如下：