CN105004809B - 蜈蚣药材的质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蜈蚣药材的质量检测方法，该方法以蜈蚣中3，8‑二羟基喹啉为指标成分，采用高效液相色谱法或薄层色谱法对蜈蚣药材进行质量检测。本发明技术方案首次将3，8‑二羟基喹啉作为蜈蚣药材质量检测的指标成分。该方法操作简便，条件可控，专属性强，稳定性和重现性好，可有效弥补中国药典中蜈蚣药材质量检测方法的不足，具有很强的实用性。
Description
技术领域
本发明涉及一种蜈蚣药材的质量检测方法，属于中药领域。
背景技术
蜈蚣为蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣Scolopendra subspinipes mutilans L.Koch的干燥体。春、夏二季捕捉，用竹片插入头尾，绷直，干燥。具有熄风镇痉，通络止痛，攻毒散结之功效，用于肝风内动，痉挛抽搐，小儿惊风，中风口半身不遂，破伤风，风湿顽痹，偏正头痛，疮疡，瘰疬，蛇虫咬伤。
蜈蚣主要含组织胺样物质及溶血性蛋白质，此外尚含氨基酸、脂肪酸、胆固醇及微量元素(苗明三.现代实用中药质量控制技术[M].北京：人民卫生出版社，2000：1055)。《中国药典》2010年版一部中蜈蚣的质量检测项目仅有性状、水分、总灰分、浸出物(国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].2010年版一部.化学工业出版社，2010：335-336)，缺乏专属性强的薄层色谱鉴别或含量测定等质量检测项目，使得蜈蚣药材的质量难以得到有效地保证。
国内有报道对蜈蚣中氨基酸类成分(吴刚.少棘蜈蚣研究[J].生物化学杂志，1992，24(11)：650)和组织胺(邓芳，方红.蜈蚣药材中毒性成分组织胺的含量测定[J].中草药，1997，28(8)：472)进行测定，氨基酸类成分及组织胺在多数动植物组织中广泛存在，此类成分专属性不强，难以有效检测蜈蚣的质量。韩国学者从蜈蚣中分离得到喹啉类化合物3，8-二羟基喹啉，具有抗肿瘤活性(Surk-Sik Moon等.Jineol，a Cytotoxic Alkaloidfrom the Centipede Scolopendra subspinipes[J].Nat.Prod.1996，59:777-779)，但未见以对蜈蚣中的3，8-二羟基喹啉为指标成分建立测定方法的报道。本发明人从蜈蚣中分离得到了3，8-二羟基喹啉，其为黄绿色粉末，以此成分作为蜈蚣的指标成分，首次建立了蜈蚣药材的质量检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种蜈蚣药材的质量检测方法。该方法是以蜈蚣中的3，8-二羟基喹啉为指标成分，采用高效液相色谱法检测蜈蚣中指标性成分3，8-二羟基喹啉的重量百分比或用薄层色谱法鉴别蜈蚣中3，8-二羟基喹啉。
本发明技术方案以高效液相色谱法测定蜈蚣中的3，8-二羟基喹啉，包括下列步骤：
1)对照品溶液制备：精密称取3，8-二羟基喹啉对照品，用甲醇溶解，配制成对照品溶液；
2)供试品溶液的制备：取蜈蚣药材粉末，精密称定，加25倍量甲醇，称重，超声处理30分钟，取出，放冷，补重，摇匀，滤过，作为供试品溶液；
3)样品的测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，色谱条件：进样体积5μL；流速：0.6-1.0mL/min；检测波长252nm；柱温：35-50℃；流动相：甲醇-10mmol/L磷酸二氢钾溶液＝28-36：72-64。
优选地，步骤1)所述3，8-二羟基喹啉对照品浓度为0.00362mg/mL。
优选地，步骤3)所述色谱条件为：进样体积5μL；流速：0.6mL/min；检测波长：252nm；柱温：40℃；流动相：甲醇-10mmol/L磷酸二氢钾溶液＝28：64。
本发明技术方案已薄层色谱法鉴别蜈蚣中3，8-二羟基喹啉，包括以下步骤：
1)对照品溶液的制备：取3，8-二羟基喹啉对照品适量，加甲醇溶解，配制成浓度为0.1mg/mL-1.0mg/mL的3，8-二羟基喹啉对照品溶液；
2)供试品溶液的制备：取蜈蚣药材粉末，精密称定，加10倍量甲醇，超声处理30分钟，取出，滤过，水浴蒸干，残渣加水溶散，用乙酸乙酯提取1次，分取乙酸乙酯层，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，作为供试品溶液；
3)点样、展开：分别吸取对照品溶液、供试品溶液点于同一薄层板上，以氯仿：甲醇：甲酸＝10：0.8-1.5：1为展开剂，展开，取出，晾干，254nm紫外光灯下检视。
优选地，步骤1)所述3，8-二羟基喹啉对照品溶液的浓度为为0.8mg/mL。
优选地，步骤3)所述展开剂最佳为三氯甲烷：甲醇：甲酸＝10：1.2：1。
与现有技术比较，本发明蜈蚣药材的质量检测方法首次将3，8-二羟基喹啉作为蜈蚣药材质量检测的指标成分，采用高效液相色谱法和薄层色谱法对蜈蚣药材进行质量检测，操作简便，条件可控，专属性强，稳定性和重现性好，可有效弥补中国药典中蜈蚣药材质量检测方法的不足，具有很强的实用性。本发明技术方案也可为中药制剂中蜈蚣的质量检测提供参考。
附图说明
图1是3，8-二羟基喹啉对照品的HPLC图；
图2是蜈蚣药材的HPLC图，其中峰1是3，8-二羟基喹啉；
图3是不同批次的蜈蚣的薄层色谱图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
实施例1蜈蚣药材质量检测方法
1)对照品溶液的制备：精密称取3，8-二羟基喹啉，用甲醇溶解，配制成0.00362mg/mL的3，8-二羟基喹啉对照品溶液；
2)供试品溶液的制备：取蜈蚣药材粉末1g，精密称定，加甲醇25mL，称重，超声处理30min，取出，放冷，补重，摇匀，滤过，作为供试品溶液；
3)样品的测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，色谱条件：色谱柱：Kromasil C18(4.6mm×250mm，5μm)流速：0.6mL/min；检测波长252nm；柱温：35℃；进样体积5μL；流动相：甲醇-10mmol/L磷酸二氢钾＝28：64。
4)标准曲线的绘制：精密吸取浓度为0.00362mg/mL的3，8-二羟基喹啉对照品溶液1μL、2μL、4μL、8μL、10μL、12μL，按上述色谱条件测定的峰面积，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程Y＝7774.301X-44.053，r＝9994，线性范围0.00362μg—0.04344μg。
5)精密度试验：按照《中国药典》2010年版一部附录记载的方法，分别精密吸取同一对照品溶液5μL，连续进样6次，按上述条件测定3，8-二羟基喹啉的峰面积，其RSD为0.657％。
6)稳定性试验：按照《中国药典》2010年版一部附录记载的方法，精密吸取同一供试品溶液5μL，分别在0，2，4，6，8h进样，按上述色谱条件测定3，8-二羟基喹啉的峰面积，其RSD为0.785％。
7)重复性试验：按照《中国药典》2010年版一部附录记载的方法，取蜈蚣6份，精密称定，按照供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定3，8-二羟基喹啉的含量，其RSD为0.536％。
8)回收率试验：按照《中国药典》2010年版一部附录记载的方法，取6份已知含量的药材粉末约0.5g，精密称定，分别精密加入0.34mg的3，8-二羟基喹啉，按照供试品溶液的制备方法制成加样供试品溶液，按上述色谱条件测定含量，计算回收率，结果平均回收率为99.22％，RSD为0.373％。
实施例2蜈蚣药材质量检测方法
1)对照品溶液的制备：精密称取3，8-二羟基喹啉，用甲醇溶解，配制成0.00362mg/mL的3，8-二羟基喹啉对照品溶液；
2)供试品溶液的制备：取蜈蚣药材粉末1g，精密称定，加甲醇25mL，称重，超声处理30min，取出，放冷，补重，摇匀，滤过，作为供试品溶液；
3)样品的测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，色谱条件：色谱柱：Kromasil C18(4.6mm×250mm，5μm)流速：0.8ml/min；检测波长252nm；柱温：40℃；进样体积5μL；流动相：甲醇-10mmol/L磷酸二氢钾＝32：68。
其他步骤同实施例1。
实施例3蜈蚣药材质量检测方法
1)对照品溶液的制备：精密称取3，8-二羟基喹啉，用甲醇溶解，配制成0.00362mg/mL的3，8-二羟基喹啉对照品溶液；
2)供试品溶液的制备：取蜈蚣药材粉末1g，精密称定，加甲醇25mL，称重，超声处理30min，取出，放冷，补重，摇匀，滤过，作为供试品溶液；
3)样品的测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，色谱条件：色谱柱：Kromasil C18(4.6mm×250mm，5μm)流速：0.9mL/min；检测波长252nm；柱温：45℃；进样体积5μL；流动相：甲醇-10mmol/L磷酸二氢钾＝34：67。
其他步骤同实施例1。
实施例4蜈蚣药材质量检测方法
1)对照品溶液的制备：精密称取3，8-二羟基喹啉，用甲醇溶解，配制成0.00362mg/mL的3，8-二羟基喹啉对照品溶液；
2)供试品溶液的制备：取蜈蚣药材粉末1g，精密称定，加甲醇25mL，称重，超声处理30min，取出，放冷，补重，摇匀，滤过，作为供试品溶液；
3)样品的测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，色谱条件：色谱柱：Kromasil C18(4.6mm×250mm，5μm)流速：1.0mL/min；检测波长252nm；柱温：50℃；进样体积5μL；流动相：甲醇-10mmol/L磷酸二氢钾＝36：72。
其他步骤同实施例1。
实施例5蜈蚣中质量检测方法
采用实施例1所述方法测定的不同批次的蜈蚣中3，8-二羟基喹啉的含量，结果见表1。
表1不同批次的蜈蚣中的3，8-二羟基喹啉含量
| 批次 | 批号 | 3，8-二羟基含量(％) |
| 1 | 120322-1 | 0.0625 |
| 2 | 120407-1(霉变) | 0.0175 |
| 3 | 120414-1 | 0.0476 |
| 4 | 120713-1 | 0.0504 |
| 5 | 121105-1 | 0.0957 |
| 6 | 130601-1 | 0.0641 |
| 7 | 130705-1 | 0.1719 |
| 8 | 131207-1 | 0.1316 |
| 9 | 140321-1 | 0.1199 |
| 10 | 140425-1 | 0.0539 |
| 11 | 140425-2 | 0.0821 |
结果3，8-二羟基喹啉的含量多在0.040％以上，仅有一批霉变的蜈蚣含量较低，表明以3，8-二羟基喹啉为指标可以检测蜈蚣的质量，建立的HPLC法测定蜈蚣中的3，8-二羟基喹啉切实可行。
实施例6蜈蚣药材质量检测方法
1)对照品溶液的制备：取3，8-二羟基喹啉对照品适量，加甲醇溶解，配制成浓度为0.1mg/mL对照品溶液；
2)供试品溶液的制备：取蜈蚣药材粉末1g，精密称定，加甲醇，超声处理30分钟，取出，滤过，水浴蒸干，残渣加水10mL溶散，用乙酸乙酯10mL提取1次，分取乙酸乙酯层，水浴蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。
3)点样、展开、检视：分别吸取3，8-二羟基对照品溶液、供试品溶液5μL，点样于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷：甲醇：甲酸＝10：0.8：1为展开剂，展距8cm，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视。
4)结果：图3不同批次的蜈蚣的薄层色谱图，结果表明：不同批次的蜈蚣在与对照品色谱对应的位置上，显相同颜色的斑点。色谱分离良好，蜈蚣的特征斑点突出，建立的TLC方法可以作为蜈蚣的质量检测方法。
实施例7蜈蚣药材质量检测方法
1)对照品溶液的制备：取3，8-二羟基喹啉对照品适量，加甲醇溶解，配制成浓度为0.5mg/mL对照品溶液；
2)供试品溶液的制备：取蜈蚣药材粉末1g，精密称定，加甲醇，超声处理30分钟，取出，滤过，水浴蒸干，残渣加水10mL溶散，用乙酸乙酯10mL提取1次，分取乙酸乙酯层，水浴蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。
3)点样、展开、检视：分别吸取3，8-二羟基对照品溶液、供试品溶液5μL，点样于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷：甲醇：甲酸＝10：1：1为展开剂，展距8cm，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视。
4)结果：图3不同批次的蜈蚣的薄层色谱图，结果表明：不同批次的蜈蚣在与对照品色谱对应的位置上，显相同颜色的斑点。色谱分离良好，蜈蚣的特征斑点突出，建立的TLC方法可以作为蜈蚣的质量检测方法。
实施例8蜈蚣药材质量检测方法
1)对照品溶液的制备：取3，8-二羟基喹啉对照品适量，加甲醇溶解，配制成浓度为0.8mg/mL对照品溶液；
2)供试品溶液的制备：取蜈蚣药材粉末1g，精密称定，加甲醇，超声处理30分钟，取出，滤过，水浴蒸干，残渣加水10mL溶散，用乙酸乙酯10mL提取1次，分取乙酸乙酯层，水浴蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。
3)点样、展开、检视：分别吸取3，8-二羟基对照品溶液、供试品溶液5μL，点样于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷：甲醇：甲酸＝10：1.2：1为展开剂，展距8cm，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视。
4)结果：图3不同批次的蜈蚣的薄层色谱图，结果表明：不同批次的蜈蚣在与对照品色谱对应的位置上，显相同颜色的斑点。色谱分离良好，蜈蚣的特征斑点突出，建立的TLC方法可以作为蜈蚣的质量检测方法。
实施例9蜈蚣药材质量检测方法
1)对照品溶液的制备：取3，8-二羟基喹啉对照品适量，加甲醇溶解，配制成浓度为0.9mg/mL对照品溶液；
2)供试品溶液的制备：取蜈蚣药材粉末1g，精密称定，加甲醇，超声处理30分钟，取出，滤过，水浴蒸干，残渣加水10mL溶散，用乙酸乙酯10mL提取1次，分取乙酸乙酯层，水浴蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。
3)点样、展开、检视：分别吸取3，8-二羟基对照品溶液、供试品溶液5μL，点样于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷：甲醇：甲酸＝10：1.4：1为展开剂，展距8cm，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视。
4)结果：图3不同批次的蜈蚣的薄层色谱图，结果表明：不同批次的蜈蚣在与对照品色谱对应的位置上，显相同颜色的斑点。色谱分离良好，蜈蚣的特征斑点突出，建立的TLC方法可以作为蜈蚣的质量检测方法。
实施例10蜈蚣药材质量检测方法
1)对照品溶液的制备：取3，8-二羟基喹啉对照品适量，加甲醇溶解，配制成浓度为1.0mg/mL对照品溶液；
2)供试品溶液的制备：取蜈蚣药材粉末1g，精密称定，加甲醇，超声处理30分钟，取出，滤过，水浴蒸干，残渣加水10mL溶散，用乙酸乙酯10mL提取1次，分取乙酸乙酯层，水浴蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。
3)点样、展开、检视：分别吸取3，8-二羟基对照品溶液、供试品溶液5μL，点样于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷：甲醇：甲酸＝10：1.5：1为展开剂，展距8cm，取出，晾干，置254nm紫外光灯下检视。
4)结果：图3不同批次的蜈蚣的薄层色谱图，结果表明：不同批次的蜈蚣在与对照品色谱对应的位置上，显相同颜色的斑点。色谱分离良好，蜈蚣的特征斑点突出，建立的TLC方法可以作为蜈蚣的质量检测方法。
Claims (6)
1.一种蜈蚣药材的质量检测方法，其特征在于，该方法采用高效液相色谱法检测蜈蚣中指标性成分3，8-二羟基喹啉的重量百分比或采用薄层色谱法鉴别蜈蚣中3，8-二羟基喹啉；
所述高效液相色谱法包括以下步骤：
1)对照品溶液制备：精密称取3，8-二羟基喹啉对照品，用甲醇溶解，配制成对照品溶液；
2)供试品溶液的制备：取蜈蚣药材粉末，精密称定，加25倍量甲醇，称重，超声处理30分钟，取出，放冷，补重，摇匀，滤过，作为供试品溶液；
3)样品的测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，色谱条件：进样体积5μL；流速：0.6-1.0mL/min；检测波长252nm；柱温：35-50℃；流动相：甲醇：10mmol/L磷酸二氢钾溶液＝28-36：72-64；
所述薄层色谱法包括以下步骤：
1)对照品溶液的制备：取3，8-二羟基喹啉对照品适量，加甲醇溶解，配制成浓度为0.1mg/mL-1.0mg/mL的3，8-二羟基喹啉对照品溶液；
2)供试品溶液的制备：取蜈蚣药材粉末，精密称定，加10倍量甲醇，超声处理30分钟，取出，滤过，水浴蒸干，残渣加水溶散，用乙酸乙酯提取1次，分取乙酸乙酯层，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，作为供试品溶液；
3)点样、展开：分别吸取对照品溶液、供试品溶液点于同一薄层板上，以氯仿：甲醇：甲酸＝10：0.8-1.5：1为展开剂，展开，取出，晾干，254nm紫外光灯下检视。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，高效液相色谱法步骤1)所述3，8-二羟基喹啉对照品溶液的浓度为0.00362mg/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，薄层色谱法步骤1)所述3，8-二羟基喹啉对照品溶液的浓度为0.8mg/mL。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述色谱条件为：进样体积5μL；流速：0.6mL/min；检测波长：252nm；柱温：35℃；流动相：甲醇：10mmol/L磷酸二氢钾溶液＝28：64。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，展开剂为三氯甲烷：甲醇：甲酸＝10：1.2：1。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，展开剂为三氯甲烷：甲醇：甲酸＝10：1.2：1。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20151028 Assignee: Lunan Pharmaceutical Co., Ltd. Assignor: Lunan Pharmaceutical Group Co., Ltd. Contract record no.: 2019370000023 Denomination of invention: Centipede medicinal material quality detection method Granted publication date: 20170208 License type: Exclusive License Record date: 20190321 |
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| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |