CN104777243A

CN104777243A - 一种同时测定半夏中有机酸、核苷和麻黄碱的hplc方法

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Publication number: CN104777243A
Application number: CN201510052217.1A
Authority: CN
Inventors: 赵华; 张严方; 张景勍; 雷婷婷
Original assignee: Chongqing Medical University
Current assignee: Chongqing Medical University
Priority date: 2015-01-29
Filing date: 2015-01-29
Publication date: 2015-07-15
Anticipated expiration: 2035-01-29
Also published as: CN104777243B

Abstract

本发明属于中药成分分析测定技术领域，涉及一种HPLC法同时测定半夏药材和制剂中六种有机酸、三种核苷和麻黄碱含量的方法。本发明的特征是：色谱柱为Boston Green ODS(4.6mm×150mm，5μm)色谱柱，流动相为磷酸缓冲液-甲醇溶液，梯度洗脱，流速1mL/min，进样量20μL，柱温30℃，检测波长210nm。草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、尿苷、腺苷、鸟苷和麻黄碱在适用浓度范围内线性关系良好。该方法准确、快速、可靠，能有效地同时测定半夏提取物中草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、尿苷、腺苷、鸟苷和麻黄碱的含量。

Description

一种同时测定半夏中有机酸、核苷和麻黄碱的HPLC方法

技术领域

本发明属于医药领域，涉及半夏药材和制剂中同时测定六种有机酸、三种核苷和麻黄碱的分析技术。六种有机酸分别是草酸，甲酸，苹果酸，乙酸，柠檬酸和琥珀酸；三种核苷分别是尿苷，腺苷和鸟苷。

背景技术

半夏为天南星科植物半夏Pinelia temate(thumb.)Breit.的干燥块茎，具有燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结之功效，临床应用非常的广泛。

半夏含有多种化学成分，主要包括有机酸类、核苷类、生物碱类等。其中总游离有机酸具有止咳、祛痰、抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡等作用，2010年版中国药典以半夏中总游离有机酸的含量作为评价半夏质量的指标，其中所含有机酸主要有草酸、甲酸、乙酸、苹果酸、柠檬酸和琥珀酸等。半夏中所含的核苷类也是其中药及制剂的重要有效成分，并把其作为复方中半夏的水溶性指标成分进行检测，作为判别半夏药材及制剂质量优劣的重要依据，含量较高的有尿苷、鸟苷和腺苷等。麻黄碱是半夏含有的总生物碱中主要成分之一，具有平喘、止咳等作用，且麻黄碱含量的高低与镇咳祛痰作用密切相关。

近几年，半夏在组织培养、种属鉴定、药理、临床研究等方面取得了重大进展，但在有效成分的含量测定及质量控制等研究较少，药典对半夏的鉴别除了显微鉴别外，仅检查精氨酸、丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸是否存在，《中国药典》2010版中半夏药材的质量控制是采取电位滴定法对醇提取物中有机总酸进行测定，且所含总酸仅以琥珀酸计，这对于半夏的质量控制是远远不足的。由于半夏所含有效成分较多，且针对不同疾病所需要的有效成分不同，故本发明采用HPLC法同时测定半夏药材及饮片中的六种有机酸、三种核苷和麻黄碱的含量，较电位滴定法具有更高灵敏度、高效能和高专属性，且可为控制半夏药材及饮片质量提供重要的参考依据。

目前将这六种有机酸，三种核苷和麻黄碱同时进行检测定量的未见文献报道。

发明内容

本发明采用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)对半夏提取物中的六种有机酸、三种核苷和麻黄碱成分同时进行测定。本发明所述的同时测定半夏提取物中六种有机酸、三种核苷和麻黄碱成分的HPLC方法高效、快速，重复性和精密度良好，且样品前处理简便、操作快速，可为半夏药材和制剂的质量控制提供依据。

本发明所提供的技术方案可以是：

采用高效液相色谱法进行测定，该高效液相色谱法的色谱条件如下：Boston GreenODS(4.6mm×150mm，5μm)色谱柱，流动相为流动相为磷酸缓冲液(0.01mol/LKH₂PO₄用磷酸调pH为2.3)-甲醇溶液，梯度洗脱(0-5min，甲醇2％；5-15min，甲醇2％→20％；15-20min，甲醇20％)，流速1mL/min，进样量20μL，柱温30℃，检测波长210nm。所述方法包括标准溶液制备、标准曲线制作、样品处理和样品含量测定。

标准溶液制备：分别精密称取草酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、尿苷、鸟苷、腺苷、麻黄碱标准品各50mg、60mg、63mg、60mg、10mg、12mg、16mg、20mg，加水溶解并稀释后，得草酸、柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、尿苷、鸟苷、腺苷、麻黄碱浓度分别为74μg·mL^-1，178μg·mL^-1，189μg·mL^-1，178μg·mL^-1，12μg·mL^-1，11μg·mL^-1，14μg·mL^-1，3μg·mL^-1。分别精密吸取0.1ml甲酸、乙酸标准溶液，加水稀释后，得甲酸、乙酸浓度为226μg·mL^-1、373μg·mL^-1对照品溶液。精密吸取各对照储备液5ml于50mL量瓶中，摇匀，得混合对照品溶液。

标准曲线制作：精密吸取混合标准品溶液0.1mL，0.5mL，1mL，2mL，4mL于10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，制得混合对照品溶液系列。按以上色谱条件测定，以峰面积Y对浓度X(μg·mL^-1)进行线性回归。草酸的回归方程为：y＝18441x+36058(r＝0.9998)；甲酸的回归方程为：y＝1111.3x-81.483(r＝1)；苹果酸的回归方程为：y＝2185.4x-7346.5(r＝0.9996)；乙酸的回归方程为：y＝765.01x-1663.6(r＝0.9999)；柠檬酸的回归方程为：y＝1143.9x+3644.4(r＝0.9999)；琥珀酸的回归方程为：y＝703.38x+67.395(r＝0.9997)；尿苷的回归方程为：y＝24267x-162.75(r＝0.9998)；腺苷的回归方程为：y＝18427x-48315(r＝0.9999)；鸟苷的回归方程为：y＝43746x-7200.1(r＝0.9999)；麻黄碱的回归方程为：y＝69378x-4330.1(r＝0.9995)。结果表明，草酸浓度在3～75μg·mL^-1范围内与峰面积呈良好的线性关系；甲酸浓度在11～181μg·mL^-1范围内与峰面积呈良好的线性关系；苹果酸浓度在9～189μg·mL^-1范围内与峰面积呈良好的线性关系；乙酸浓度在18～373μg·mL^-1范围内与峰面积呈良好的线性关系；柠檬酸浓度在8～142μg·mL^-1范围内与峰面积呈良好的线性关系；琥珀酸浓度在5～71μg·mL^-1范围内与峰面积呈良好的线性关系；尿苷浓度在0.3～12μg·mL^-1范围内与峰面积呈良好的线性关系；腺苷浓度在0.5～11μg·mL^-1范围内与峰面积呈良好的线性关系；鸟苷浓度在0.7～14μg·mL^-1范围内与峰面积呈良好的线性关系；麻黄碱浓度在0.09～3μg·mL^-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。

样品处理(以半夏药材为例)：称取半夏药材粉末2g，用40mL超纯水超声提取2次，每次2h，提取液用砂芯布什漏斗过滤，用超纯水定容至100mL，0.22μm微孔滤膜滤过取续滤液即得供试品溶液。

样品含量测定：取供试品溶液，按上述的色谱条件测定，用外标法以峰面积计算，结果草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、尿苷、腺苷、鸟苷和麻黄碱的平均含量分别为3.04(mg/g)、8.74(mg/g)、10.57(mg/g)、15.90(mg/g)、1.95(mg/g)、1.21(mg/g)、0.21(mg/g)、0.55(mg/g)、0.018(mg/g)、0.007(mg/g)，RSD分别为1.16％、2.73％、1.52％、2.08％、1.03％、3.11％、2.31％、1.41％、2.38％和1.08％。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1、本发明首次应用高效液相色谱紫外检测法，同时测定半夏中六种有机酸(草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸)、三种核苷(尿苷、腺苷和鸟苷)和麻黄碱的含量。

2、本发明操作简便，分离快速，在较大的线性范围内十种物质标准曲线方程的R值均大于0.9995，表明线性关系较好。

3、本发明实用范围广，可对半夏药材、制剂及不同炮制品中的有机酸、核苷和麻黄碱成分进行同时测定，为半夏药材和制剂的质量控制提供重要的参考依据。

附图说明

图1为本发明实施例中六中有机酸、三种核苷和麻黄碱标准物质的色谱图。该色谱图中对应序号为：1草酸，2甲酸，3苹果酸，4乙酸，5柠檬酸，7琥珀酸，8尿苷，9腺苷，10鸟苷，11麻黄碱。

图2为本发明实施例中六中有机酸、三种核苷和麻黄碱的样品色谱图。

具体实施方式

为了进一步说明本发明及其优点，给出了下列特定的实施例，应理解这些实施例仅用于具体说明而不是作为本发明范围的限制。

实施例：

标准曲线制作：精密吸取混合标准品溶液0.1mL，0.5mL，lmL，2mL，4mL于10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，制得混合对照品溶液系列。按以上色谱条件测定，以峰面积Y对浓度X(μg·mL^-1)进行线性回归。草酸的回归方程为：y＝18441x+36058(r＝0.9998)；甲酸的回归方程为：y＝1111.3x-81.483(r＝1)；苹果酸的回归方程为：y＝2185.4x-7346.5(r＝0.9996)；乙酸的回归方程为：y＝765.01x-1663.6(r＝0.9999)；柠檬酸的回归方程为：y＝1143.9x+3644.4(r＝0.9999)；琥珀酸的回归方程为：y＝703.38x+67.395(r＝0.9997)；尿苷的回归方程为：y＝24267x-162.75(r＝0.9998)；腺苷的回归方程为：y＝18427x-48315(r＝0.9999)；鸟苷的回归方程为：y＝43746x-7200.1(r＝0.9999)；麻黄碱的回归方程为：y＝69378x-4330.1(r＝0.9995)。结果表明，草酸浓度在3～75μg·mL^-1范围内与峰面积呈良好的线性关系；甲酸浓度在11～181μg·mL^-1范围内与峰面积呈良好的线性关系；苹果酸浓度在9～189μg·mL^-1范围内与峰面积呈良好的线性关系；乙酸浓度在18～373μg·mL^-1范围内与峰面积呈良好的线性关系；柠檬酸浓度在8～142μg·mL^-1范围内与峰面积呈良好的线性关系；琥珀酸浓度在5～71μg·mL^-1范围内与峰面积呈良好的线性关系；尿苷浓度在0.3～12μg·mL^-1范围内与峰面积呈良好的线性关系；腺苷浓度在0.5～11μg·mL^-1范围内与峰面积呈良好的线性关系；鸟苷浓度在0.7～14μg·mL^-1范围内与峰面积呈良好的线性关系；麻黄碱浓度在0.09～3μg·mL^-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。

精密度考察：取混合对照品溶液，按以上色谱方法连续进样6次，测定峰面积。结果草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、尿苷、腺苷、鸟苷和麻黄碱的RSD分别为0.82％、0.96％、2.53％、2.61％、0.88％、1.02％、1.38％、1.19％和2.49％。符合精密度实验要求。

稳定性考察：取混合对照品溶液，室温下放置0，2，4，8，12，24，48小时，按以上色谱条件分别进样20μL测定峰面积。结果峰面积基本不变，草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、尿苷、腺苷、鸟苷和麻黄碱的RSD分别为3.49％、1.18％、1.78％、1.25％、2.29％、3.91％、0.78％、1.17％、1.98％、1.61％，表明溶液在48小时内基本稳定。

重复性考察：按供试品配制方法平行配制6份，按以上色谱方法进样分析，按外标法以峰面积计算含量，草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、尿苷、腺苷、鸟苷和麻黄碱的平均含量分别为3.04(mg/g)、8.74(mg/g)、10.57(mg/g)、15.90(mg/g)、1.95(mg/g)、1.21(mg/g)、0.21(mg/g)、0.55(mg/g)、0.018(mg/g)、0.007(mg/g)，RSD分别为1.16％、2.73％、1.52％、2.08％、1.03％、3.11％、2.31％、1.41％、2.38％和1.08％。

加样回收率考察：精密量取已测知含量的半夏提取物各5ml，共30份，置10mL量瓶中，分别精密加入提取物中草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、尿苷、腺苷、鸟苷和麻黄碱含量的80％、100％和120％的对照储备液，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，按上述色谱条件进样20μL，按外标法计算回收率。结果草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、尿苷、腺苷、鸟苷和麻黄碱的平均回收率分别为94.10％、91.72％、96.93％、101.11％、93.35％、94.72％、94.17％、100.29％、96.31％和98.57％，RSD分别为2.38％、1.72％、0.72％、1.61％、0.83％、1.88％、0.84％、2.84％、1.79％和1.1４％。

供试品溶液的制备：称取贵州威宁半夏药材粉末2g，用40mL超纯水超声提取2次，每次2h，提取液用砂芯布什漏斗过滤，用超纯水定容至100mL，0.22μm微孔滤膜滤过取续滤液即得供试品溶液。

半夏药材中六种有机酸、三种核苷类和麻黄碱成分的含量测定：取供试品溶液，按上述的色谱条件(Boston Green ODS(4.6mm×150mm，5μm)色谱柱，流动相为流动相为磷酸缓冲液(0.01mol/LKH₂PO₄用磷酸调pH为2.3)-甲醇溶液，梯度洗脱(0-5min，甲醇2％；5-15min，甲醇2％→20％；15-20min，甲醇20％)，流速1mL/min，进样量20μL，柱温30℃，检测波长210nm)测定，用外标法以峰面积计算，结果草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、尿苷、腺苷、鸟苷和麻黄碱的平均含量分别为3.04(mg/g)、8.74(mg/g)、10.57(mg/g)、15.90(mg/g)、1.95(mg/g)、1.21(mg/g)、0.21(mg/g)、0.55(mg/g)、0.018(mg/g)、0.007(mg/g)，RSD分别为1.16％、2.73％、1.52％、2.08％、1.03％、3.11％、2.31％、1.41％、2.38％和1.08％。

Claims

1.一种同时测定半夏中有机酸、核苷和麻黄碱的HPLC方法，其特征在于采用高效液相色谱法同时测定六种有机酸(草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸)、三种核苷(尿苷、腺苷和鸟苷)和麻黄碱的含量，该高效液相色谱法的色谱条件为：Boston Green ODS(4.6mm×150mm，5μm)色谱柱，流动相为磷酸缓冲液(0.01mol/LKH₂PO₄用磷酸调pH为2.3)-甲醇溶液，梯度洗脱(0-5min，甲醇2％；5-15min，甲醇2％→20％；15-20min，甲醇20％)，流速1mL/min，进样量20μL，柱温30℃，检测波长210nm。