CN110967432A - 一种测定根系分泌物中有机酸含量的方法 - Google Patents

一种测定根系分泌物中有机酸含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种测定根系分泌物中有机酸含量的方法，属于化学分析技术领域。本发明构建了一种同时微量定量分析根系分泌物中多种有机酸的HPLC方法，首先采用水培法收集植物的根系分泌物，收集的根系分泌物进行冻干，得到根系分泌物粉末，整个收集和冻干过程所用的仪器工具溶剂等都事先进行灭菌处理，这样可以减少微生物的影响，便于长期储存。定量分析根系分泌物中有机酸时，取根系分泌物粉末溶于甲醇，静置震荡后加入无菌水，再次震荡后进行过滤，最后对滤液进行HPLC分析。本发明的HPLC方法可以同时定量12种有机酸，并在10min内测定完毕，定量限普遍低于1mg/L，适用于微量定量分析根系分泌物中的有机酸。

Description

一种测定根系分泌物中有机酸含量的方法
技术领域
本发明涉及一种测定根系分泌物中有机酸含量的方法，属于化学分析技术领域。
背景技术
根系分泌物是植物生长发育过程中通过根系向外界分泌的所有有机化合物的总称，其即能加快有机质矿化，增加土壤养分，又能提高污染物的生物利用性。根系分泌物对于植物、微生物和土壤(或营养液)之间营养物质的吸收和转化也发挥着重要的作用，是响应病虫害以及环境胁迫的重要信号。此外，根系分泌物还可以为根际微生物提供碳源、氮源和能源，具备调控根际微生物的功能，当根系分泌物组分发生改变时，会影响根际微生物的数量、种类及种群分布等。因此，了解并分析根系分泌物的组成具有重要的意义。
有机酸是根系分泌物的重要组成部分，其不仅能影响植物对营养物质的吸收利用，决定植物的生长力，还能提高植物对于环境的适应能力，因而，对根系分泌物中的有机酸进行定量分析有其重要性和必要性。目前，有机酸的分析方法主要有化学法、离子色谱法、毛细管电泳法、气相色谱法和液相色谱法等。其中，化学法主要采用滴定法，该方法分析误差大，且只能测定有机酸的总量，并不能定量分析具体某一种有机酸的含量；离子色谱法虽一次能分离测定多种有机酸，但其定量限较高，很难进行微量定量分析；毛细电泳法分离有机酸的效果好，但其操作困难，因而应用不广泛；气相色谱法检测有机酸的步骤较为繁琐，对有机酸的预处理方法要求严格，需要将有机酸进行衍生化处理；高效液相色谱法(HPLC)因其高效、敏捷、自动化强的特点而被广泛应用，是目前有机酸的主要测定方法。
经过检索，目前应用于植物或根系分泌物中有机酸分析的HPLC方法专利包括：(1)一种同时测定半夏中6种有机酸含量的HPLC方法，该方法先称取2g的半夏块茎粉末，经乙酸乙酯提取后，提取液旋转蒸发至干，最后用超纯水定容至25mL上机进行测定；(2)一种同时测定半夏中7种有机酸的HPLC方法(申请号201910577492)，该方法先称取半夏块茎粉末0.5g，经乙酸乙酯超声提取后，提取液减压浓缩至干，最后用1％的磷酸水溶液重新定容至5mL，上机进行测定；(3)一种同时测定虎掌南星中7中有机酸的HPLC方法(申请号201910577384.6)，该方法与专利(2)类似，先称取虎掌南星块茎粉末0.5g，同样用乙酸乙酯超声提取，提取液减压浓缩至干后用1％的磷酸水溶液重新定容至5mL，上机进行测定；(4)植物根系分泌物低分子量有机酸的检测方法(申请号200410011404.7)，该方法是将根系分泌物收集液先后经过阳离子树脂和阴离子树脂进行纯化，接着用20～30mL 1M HCI洗脱阴离子树脂，洗脱液在40℃条件下旋转蒸干，最后用1mL流动相重新溶解后上机进行测定。专利(1)、(2)和(3)都是针对植物体内有机酸含量的检测，该方法需要样品的量较多，并不适合微量样品中有机酸的定量分析(如根系分泌物)，且经过预处理后的样品需要及时测定不能长时间保存；专利(4)采用的测定方法虽能测定根系分泌物中7种有机酸，但其浓缩方法(40℃旋转蒸发浓缩)并不适合微量样品，因为在此过程中，温度和微生物可能会对样品存在较大影响，且浓缩后重新定容的样品并不适合长期保存。因此，需要建立一种不易改变根系分泌物组分、无需及时分析、又能同时微量定量多种有机酸的HPLC方法。
发明内容
为解决在根系分泌物有机酸测定过程中存在的根系分泌物成分易改变、样本不易储存、不能同时微量定量分析多种有机酸的问题，本发明旨在提供一种同时微量定量分析根系分泌物中多种有机酸的HPLC方法。本发明的HPLC方法可以同时定量12种有机酸，并在10min内测定完毕，定量限普遍低于1mg/L，适用于微量定量分析根系分泌物中的有机酸。
本发明的第一个目的是提供一种测定根系分泌物中有机酸含量的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)冻干：采用水培法收集植物的根系分泌物，收集的根系分泌物进行冻干，冻干后的根系分泌物粉末储存在棕色样瓶品中，存放于-20℃冰箱待测，整个收集和冻干过程所用的仪器工具溶剂等都事先进行灭菌处理，这样可以减少微生物的影响，便于长期储存。
(2)预处理：将步骤(1)得到的根系分泌物粉末溶于甲醇，静置震荡后加入无菌水，再次震荡后进行过滤，得到滤液；
(3)HPLC分析：对步骤(2)得到的滤液进行HPLC分析，测定根系分泌物中有机酸含量。
在本发明的一种实施方式中，所述的有机酸包括草酸、L-乳酸、丙二酸、丙酸、琥珀酸、柠檬酸、L-酒石酸、L-苹果酸、乙酸、富马酸、奎尼酸和反乌头酸。
在本发明的一种实施方式中，所述根系分泌物真空冷冻干燥方法为先用水培法收集根系分泌物，然后将收集液倒入玻璃培养皿并封上保鲜膜，而后放于-80℃冰箱中快速冷冻，冷冻完成后经冻干机真空干燥，于-60～-50℃下，冷冻干燥48～72h至水分完全蒸发，最后将根系分泌物粉末收集于棕色样品瓶并储存在-20℃冰箱中待测。所述的根系分泌物收集和干燥过程中用到的器具和溶剂等都先经过灭菌处理。
在本发明的一种实施方式中，所述根系分泌物粉末与甲醇的质量体积比为0.5～2mg：0.1mL。
在本发明的一种实施方式中，所述根系分泌物预处理方法为称取0.5～2mg根系分泌物粉末先溶于100μL甲醇，静置30min后加入400μL无菌水震荡10s，经0.22μm膜过滤后上机待测。
在本发明的一种实施方式中，HPLC分析过程中流动相pH为2.5-2.6。
在本发明的一种实施方式中，所述流动相的配置方法为先配置10mmol/L磷酸二氢钾缓冲液并用H3PO4调pH值至2.5-2.6，再将其与甲醇按体积比97:3混合，经0.45μm的滤膜过滤后超声脱气3～5min。
在本发明的一种实施方式中，所述HPLC的色谱条件为采用ZORBAX SB-AQ色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温为33-36℃；检测波长为210nm；用上述配置好的流动相洗脱，流速为1～3mL/min；进样量为10～20μL。
在本发明的一种实施方式中，优选地，柱温为34-35℃。
在本发明的一种实施方式中，采用外标法对根系分泌物中有机酸含量进行定量分析。
在本发明的一种实施方式中，所述标准曲线的建立方法为先准确配置12种浓度为100mg/L的有机酸单标溶液，对有机酸单标溶液进行HPLC分析，确定各自出峰时间；
所述HPLC中流动相的配置方法为先配置10mmol/L磷酸二氢钾缓冲液并用H3PO4调pH值至2.55，再将其与甲醇按体积比97:3混合，经0.45μm的滤膜过滤后超声脱气3～5min；
色谱条件为采用ZORBAX SB-AQ色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温为34.5℃；检测波长为210nm；用上述配置好的流动相洗脱，流速为1ml/min；进样量为20μL；最终以进样浓度作为横坐标，峰面积作为纵坐标，得到相应有机酸的标准曲线和检测限。
在本发明的一种实施方式中，草酸的标准曲线为Y＝0.3209X-0.0853；L-酒石酸的标准曲线为Y＝0.0309X+0.142；奎尼酸的标准曲线为Y＝0.0094X-0.0560；L-苹果酸的标准曲线为Y＝0.0170X；丙二酸的标准曲线为Y＝0.0200X-0.0021；L-乳酸的标准曲线为Y＝0.0140X；乙酸的标准曲线为Y＝0.0117X+0.0032；柠檬酸的标准曲线为Y＝0.0223X+0.0068；琥珀酸的标准曲线为Y＝0.0123X+0.0022；丙酸的标准曲线为Y＝0.0108X+0.0012；富马酸的标准曲线为Y＝3.2179X+0.0104；反乌头酸的标准曲线为Y＝1.1238X+0.0071。
本发明的第二个目的是提供一种根系分泌物的预处理方法，所述方法是采用水培法收集植物的根系分泌物，收集的根系分泌物进行冻干，得到根系分泌物粉末。
本发明的第三个目的是提供一种方法在植物或根系分泌物检测方面的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明根系分泌物的干燥采用真空冷冻干燥处理方法，此方法能减少干燥过程中微生物和温度的影响，且干燥后的根系分泌物粉末便于长期储存。
(2)本发明能够很好地测定微量样品(根系分泌物)中有机酸的含量，且测定有机酸的种类较多，定量限低，可同时定量分析12种有机酸，拟合优度R2均大于0.999，线性关系好且定量限普遍低于1mg/L，适用于微量定量分析根系分泌物中的有机酸。
(3)本发明高效、敏捷，测定的12种有机酸不仅分泌效果好，而且分离时间短，10min内12种有机酸全部分离完毕。
附图说明
图1是HPLC方法优化完成后(流动相pH＝2.55，柱温为34.5℃)，12种有机酸混合标准品溶液分离效果图；
图2是HPLC方法pH为2.55，柱温为33℃时，12种有机酸混合标准品溶液分离效果图；
图3是HPLC方法pH为2.55，柱温为36℃时，12种有机酸混合标准品溶液分离效果图；
图4是HPLC方法pH为2.55，柱温为25℃时，12种有机酸混合标准品溶液分离效果图；
图5是HPLC方法pH为2.55，柱温为27℃时，12种有机酸混合标准品溶液分离效果图；
图6是HPLC方法pH为2.55，柱温为30℃时，12种有机酸混合标准品溶液分离效果图；
图7是HPLC方法pH为2.4，柱温为34.5℃时，12种有机酸混合标准品溶液分离效果图；
图8是HPLC方法pH为2.5，柱温为34.5℃时，12种有机酸混合标准品溶液分离效果图；
图9是HPLC方法pH为2.6，柱温为34.5℃时，12种有机酸混合标准品溶液分离效果图；
图10是HPLC方法pH为2.7，柱温为34.5℃时，12种有机酸混合标准品溶液分离效果图；
图中数字分别表示：1.草酸、2.L-酒石酸、3.奎尼酸、4.L-苹果酸、5.丙二酸、6.L-乳酸、7.乙酸、8.柠檬酸、9.琥珀酸、10.丙酸、11.富马酸和12.反乌头酸。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
实施例1：标准曲线的建立
标准曲线的建立方法如下：
(1)先准确配置12种浓度为100mg/L的有机酸单标溶液，对有机酸单标溶液进行HPLC分析，确定各自出峰时间；
所述HPLC中流动相的配置方法为先配置10mmol/L磷酸二氢钾缓冲液并用H3PO4调pH值至2.55，再将其与甲醇按体积比97:3混合，经0.45μm的滤膜过滤后超声脱气3～5min；
色谱条件为采用ZORBAX SB-AQ色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温为34.5℃；检测波长为210nm；用上述配置好的流动相洗脱，流速为1ml/min；进样量为20μL。
(2)然后配置12种有机酸的混合标准储备液，并将其稀释成6个级别的混合标准液(见表1)，混合标准液中有机酸的浓度并不统一，根据HPLC信号值的强弱而定；最终以进样浓度作为横坐标X(mg/L)，峰面积作为纵坐标Y，得到相应有机酸的标准曲线和检测限。
表1混合标准液配置浓度
Figure BDA0002336464860000051
表2 12种有机酸标准曲线的建立结果
Figure BDA0002336464860000052
实施例2：幼苗期芦苇根系分泌物中有机酸的测定
幼苗期芦苇根系分泌物的收集是采用水培法在温室条件下(温度25℃，光照强度10000Lux，光照时间16/8h(白天/夜晚)，相对湿度75％)收集2小时，其根系分泌物的收集液共有800mL，经冻干机真空冷冻干燥，于-60～-50℃下冷冻干燥36小时后，将根系分泌物粉末收集于棕色样品瓶中，并放于-20℃冰箱保存。然后称取干燥后的幼苗期芦苇根系分泌物粉末1mg溶于100μL的甲醇，静置30min后，加入400μL无菌水震荡10s，经0.22μm的滤膜过滤后采用优化后的HPLC法测定有机酸的含量。优化后HPLC法的流动相由pH值为2.55的10mmol/L磷酸二氢钾水溶液和甲醇组成，二者比例为97∶3；色谱条件为ZORBAX SB-AQ色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温为34.5℃，检测波长为210nm，流动相流速为1ml/min，进样量为20μL。该方法草酸、富马酸、反乌头酸和奎尼酸的线性范围分别为0.16～16mg/L、0.08～8mg/L、0.08～8mg/L和5～500mg/L、其他有机酸的线性范围均为1～100mg/L。
结果与分析：表2是12种有机酸标准曲线的建立结果，12种有机酸标准曲线的拟合优度(R2)都在0.999以上，表明这12种有机酸的线性关系良好，达到有机酸的定量要求，且定量限普遍在1mg/L以下；表3是幼苗期芦苇根系分泌物中有机酸的检测结果，结果表明本发明能够定量分析幼苗期芦苇根系分泌物中的10种有机酸。
表3幼苗期芦苇根系分泌物经真空冷冻干燥后有机酸的测定结果
Figure BDA0002336464860000061
实施例3：HPLC方法柱温的优化
当流动相pH为2.55，温度分别为25℃、27℃、30℃、33℃、34.5℃和36℃时，比较分析12种有机酸的分离效果。结果表明：当温度为25℃、27℃和30℃时，只能分离10种有机酸，丙二酸和L-乳酸出峰时间完全重合，未得到分离(图4-6)；当温度为33℃、34.5℃和36℃时，12种有机酸都得以分离(图2、1和3)；当温度大于36℃时，丙酸和富马酸分离效果变差，因此，流动相温度设为33℃-36℃。
实施例4：HPLC方法流动相pH的优化
当柱温为34.5℃，流动相pH分别为2.4、2.5、2.55、2.6和2.7时，分析12种有机酸的分离效果。结果表明：当pH为2.4和2.7时，只有10种有机酸得以分离，而丙二酸和L-乳酸未得到分离，其二者的出峰时间完全重合(图7和10)；当pH为2.5、2.55和2.6时，12种有机酸分离效果较好(图8、图1和图9)，因此，最终确定流动相的pH为2.5-2.6。
对比例1：幼苗期芦苇根系分泌物收集液采用旋转蒸发浓缩
与实施例1相比，本对比例800mL幼苗期芦苇根系分泌物收集液采用40℃条件下旋转蒸发浓缩至干，然后用1mL超纯水重新定容，并将定容后的溶液过0.45μm的滤膜，然后经过优化后有机酸的HPLC方法测定。测定结果如表4，结果表明，幼苗期芦苇根系分泌物中只检测到6种有机酸，分别是L-酒石酸、奎尼酸、L-苹果酸、乙酸、琥珀酸和丙酸，且检测到的含量显然低于实施例中有机酸的含量，这是因为重新定容时，根系分泌物的残留量较多而且旋转蒸发浓缩的过程中，温度和微生物对根系分泌物中有机酸的降解产生影响。
表4幼苗期芦苇根系分泌物经旋转蒸发干燥后有机酸的测定结果
Figure BDA0002336464860000071
综上所述，本发明使用的真空冷冻干燥技术更适合于根系分泌物中有机酸的检测，而且本发明的HPLC方法经优化后，12种有机酸在10分钟内都得到了很好地分离，且峰形良好，检测限低，达到微量样品(根系分泌物)中有机酸的定量分析的要求。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种测定根系分泌物中有机酸含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)冻干：采用水培法收集植物的根系分泌物，收集的根系分泌物进行冻干，得到根系分泌物粉末；
(2)预处理：将步骤(1)得到的根系分泌物粉末溶于甲醇，静置震荡后加入无菌水，再次震荡后进行过滤，得到滤液；
(3)HPLC分析：对步骤(2)得到的滤液进行HPLC分析，测定根系分泌物中有机酸含量。
2.根据权利要求1所述的一种测定根系分泌物中有机酸含量的方法，其特征在于，所述根系分泌物粉末与甲醇的质量体积比为(0.5～2)：0.1。
3.根据权利要求1所述的一种测定根系分泌物中有机酸含量的方法，其特征在于，HPLC分析过程中流动相pH为2.5-2.6。
4.根据权利要求1所述的一种测定根系分泌物中有机酸含量的方法，其特征在于，所述HPLC的色谱条件为：采用ZORBAX SB-AQ色谱柱，柱温为33-36℃。
5.根据权利要求1-4任一所述的一种测定根系分泌物中有机酸含量的方法，其特征在于，所述的根系分泌物收集、冻干和预处理过程中用到的器具和溶剂都先经过灭菌处理。
6.根据权利要求1所述的一种测定根系分泌物中有机酸含量的方法，其特征在于，采用外标法对根系分泌物中有机酸含量进行定量分析。
7.根据权利要求1-6任一所述的一种测定根系分泌物中有机酸含量的方法，其特征在于，所述的有机酸包括草酸、L-乳酸、丙二酸、丙酸、琥珀酸、柠檬酸、L-酒石酸、L-苹果酸、乙酸、富马酸、奎尼酸和反乌头酸。
8.一种根系分泌物的预处理方法，其特征在于，所述预处理方法是采用水培法收集植物的根系分泌物，收集的根系分泌物进行冻干，得到根系分泌物粉末。
9.根据权利要求1或8所述的方法，其特征在于，所述冻干为真空冷冻干燥；所述真空冷冻干燥是在于-60～-50℃下干燥48～72h。
10.权利要求1-9任一所述的一种测定根系分泌物中有机酸含量的方法在植物或根系分泌物检测方面的应用。
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