CN113189185B - 金针菇中β-烟酰胺单核苷酸的毛细管电泳测定方法 - Google Patents

金针菇中β-烟酰胺单核苷酸的毛细管电泳测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及成分分析技术领域，具体涉及金针菇中β‑烟酰胺单核苷酸的毛细管电泳测定方法。本发明的测定方法的建立基于对以下条件的筛选和考察研究：样品提取方法、缓冲液种类、缓冲液pH值、操作电压、测定波长、进样时间以及活性剂的添加种类等重要的电泳条件技术参数，高效毛细管电泳运行过程中不需要有机溶剂，缓冲液为无机盐溶液，没有挥发性可以减少有机溶剂的污染，对人和环境都比较友好，为金针菇中β‑烟酰胺单核苷酸含量的测定提供新的方法，也可以将此方法应用到其它的食用菌品种中去。

Description

金针菇中β-烟酰胺单核苷酸的毛细管电泳测定方法
技术领域
本发明涉及成分分析技术领域，具体涉及金针菇中β-烟酰胺单核苷酸的毛细管电泳测定方法。
背景技术
金针菇(Flammulina velutiper(Fr.)Sing.)学名毛柄金钱菌，又称毛柄小火菇、构菌、朴菇、冬菇、朴菰、冻菌、金菇、智力菇等。因其菌柄细长，似金针菜，故称金针菇，属伞菌目白蘑科金针菇属，是一种菌藻地衣类。金针菇氨基酸的含量非常丰富，高于一般菇类，尤其是赖氨酸的含量特别高，赖氨酸具有促进儿童智力发育的功能，因此被称为“增智菇”，是广为人知的药食用菌。金针菇干品中含蛋白质8.87％，碳水化合物60.2％，粗纤维达7.4％。金针菇既是一种美味食品，又是较好的保健食品，金针菇的国内外市场日益广阔。
目前被发现的“长寿药”β-烟酰胺单核苷酸(NMN)是一种单核苷类化合物，有研究发现NMN能够显著改善小鼠的生理机能的衰退，可以增强能量代谢，改善胰岛素敏感性和血浆中脂质的分布情况，并且改善眼部功能。据报道现在NMN主要存在于西蓝花、毛豆等蔬菜中，未见有关于金针菇中β-烟酰胺单核苷酸含量的研究报道。
目前样品测定方法主要是以高效液相电泳HPLC为主，HPLC分析对象广，它只要求样品能制成溶液,而不需要汽化，因此不受样品挥发性的约束。HPLC是以经典液相色谱法为基础,引入GC的理论与实验方法发展而成的分离分析方法。但是如果样品纯度不够，容易造成色谱柱中毒是高效液相色谱法测定有效成分的缺点。
毛细管电泳技术(HPCE)源自传统电泳技术，是传统电泳技术和现代微柱分离技术相结合的产物，其柱效可比HPLC高1-2个数量级，复杂样品的特征性也远远高于HPLC。具有微量、准确、成本低、污染少、分析时间快、自动化程度高等优点，在临床医药、环境监测及一些中药的活性成分检测上发挥了一定的作用。但有关利用毛细管电泳技术测定β-烟酰胺单核苷酸的毛细管电泳研究与应用报道较少。
发明内容
鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的在于是提供一种金针菇中β-烟酰胺单核苷酸的毛细管电泳测定方法，该测定方法的建立基于对以下条件的筛选和考察研究：样品提取方法、缓冲液种类、缓冲液pH值、操作电压、测定波长、进样时间以及活性剂的添加种类等重要的电泳条件技术参数，为金针菇中β-烟酰胺单核苷酸含量的测定提供新的方法，也可以将此方法应用到其它的食用菌品种中去。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
一种金针菇中β-烟酰胺单核苷酸的毛细管电泳测定方法，该方法具体包括以下步骤。
步骤1、金针菇的预处理：取金针菇60℃烘干，粉碎，过400目筛，得到菌粉。
步骤2、样品溶液的制备：步骤1制得菌粉按照1克干重加水15毫升提取，65℃超声30min，过滤后取上清液，将处理好的提取物的上清液用0.22μm孔径的水系滤膜滤过，4℃保存待用。
步骤3、毛细管电泳分离条件如下：高效毛细管电泳仪，毛细管有效检测长度57cm，内径为30μm，电泳缓冲液为30mmol/L硼砂和10mmol/L磷酸二氢钠缓冲，p H：9.0-9.2，电泳温度为25℃，进样时间为5-8s，进样压力为0.5psi，电压25-35k V，紫外检测波长218-254nm。
步骤4、β-烟酰胺单核苷酸的配制：精密称定5mgβ-烟酰胺单核苷酸到1.5mL的离心管中，用1.0mL超纯水溶解，配成5mg/mL的对照品母液，用0.22μm孔径的水系滤膜过滤备用，剩余放入冰箱4℃避光保存。将β-烟酰胺单核苷酸对照品母液配成浓度为0.03mg/ml、0.2mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml分别进行进样测定。以对照品浓度x(mg/mL)为横坐标，峰面积y为纵坐标进行线性回归。
步骤5、实验前用0.1mol/L NaOH溶液活化毛细管柱30min，再分别依次用超纯水、甲醇、超纯水、1mol/LHCl溶液、超纯水、0.1mol/LNaOH溶液、超纯水及运行缓冲液清洗毛细管5min。
步骤6、吸取5mg/mL的对照品β-烟酰胺单核苷酸母液10μL加到金针菇提取物上清液100μL，配成β-烟酰胺单核苷酸5μg/mL浓度；将NMN、金针菇、以及金针菇加NMN分别进样。
步骤7、β-烟酰胺单核苷酸标准品峰面积与浓度在0.03-2mg/ml范围内呈现良好的线性关系，得到回归方程，将目的峰的峰面积带入方程，计算得到β-烟酰胺单核苷酸的含量。
进一步地，步骤3中所述高效毛细管电泳仪为BECKMAN高效毛细管电泳仪。
进一步地，步骤4中的β-烟酰胺单核苷酸采用的是专用色谱的标准对照品，纯度大于95％以上。
进一步地，上述金针菇中β-烟酰胺单核苷酸的毛细管电泳测定方法对桑黄和鹿茸菇进行NMN含量的测定，均未检测出NMN。
与现有技术比，本发明的有益效果如下。
现有技术中关于β-烟酰胺单核苷酸含量测定方法比较常用的是液相色谱方法，但是该方法需要用到色谱柱需要经常的维护，成本高，并且全程使用有机溶剂，在测定过程中溶剂挥发会影响操作者的健康，测定结束后的有机废液也需要特殊处理，但排放的过程也会有污染。本发明提供的金针菇中β-烟酰胺单核苷酸含量的毛细管电泳测定方法，毛细管运行过程中不需要有机溶剂，缓冲液为无机盐溶液，没有挥发性可以减少有机溶剂的污染，对人和环境都比较友好。
液相色谱需要的上样量比较大，且样品处理比较复杂，若样品的粘稠度过高经常堵塞色谱柱。而有的食用菌野生的资源采集的样本量比较少，经常达不到液相色谱的上样条件，这样对食用菌品种的有效成分的测定就不全面。本发明提供的金针菇中β-烟酰胺单核苷酸含量的毛细管电泳测定方法可以减少这一现象。毛细管电泳一次进样量是微克级别，一般食用菌都可以达到，对于一些比较珍贵的样本可行性更高。
本发明提供的金针菇中β-烟酰胺单核苷酸含量的毛细管电泳测定方法除了测定金针菇中的β-烟酰胺单核苷酸的含量，也可以将此方法应用到其它的食用菌品种中去。
附图说明
图1是对金针菇中β-烟酰胺单核苷酸测定的高效毛细管电泳图，金针菇(上)，金针菇加NMN(中)，NMN(下)。
图2是不同浓度的NMN毛细管电泳图谱(由上到下分别是2mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml，0.1mg/ml，0.03mg/ml)。
图3是β-烟酰胺单核苷酸的标准曲线。
图4是用本发明提供的对金针菇中β-烟酰胺单核苷酸测定方法测定桑黄中NMN含量的高效毛细管电泳图。
图5是用本发明提供的对金针菇中β-烟酰胺单核苷酸测定方法测定鹿茸菇中NMN含量的高效毛细管电泳图。
图6是放置不同时间的NMN的毛细管电泳图谱(由上到下为放置0,2,4,6,8小时后进样)。
具体实施方式
为使本技术领域的技术人员能更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例和附图对本发明技术方案进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1高效毛细管电泳对金针菇中β-烟酰胺单核苷酸定性测定方法的筛选试验。
1、β-烟酰胺单核苷酸的配制。
β-烟酰胺单核苷酸采用的是专用色谱的标准对照品，纯度大于95％以上。称重β-烟酰胺单核苷酸5mg到1.5mL的离心管中，用1.0mL超纯水溶解，配成5mg/mL的对照品母液。用0.22μm孔径的水系滤膜过滤备用，剩余放入冰箱4℃避光保存。
2、金针菇的预处理。
高效毛细管电泳中样品的处理很简单，不需要大量的有机溶剂，提取过程也十分环保。金针菇60℃烘干，粉碎，过筛子。得到的菌粉按照1:15加水，65℃超声30min，过滤后取上清液。将处理好的提取物用0.22μm孔径的水系滤膜滤过，4℃保存待用。
3、毛细管电泳分离条件确定。
采用BECKMAN高效毛细管电泳仪，分离条件包括缓冲液，电压及毛细管规格等，其中缓冲液最重要。缓冲液的优化包括pH值，电解质浓度等。分别对不同的缓冲液进行了筛选：1)30mmol/L硼砂缓冲液pH值分别为8.0、8.5、9.0、9.5；2)50mmol/L柠檬酸缓冲液pH值分别为5.5、6.0、6.5；3)20mmol/L磷酸缓冲液pH值分别为7.0、7.5。
结果表明在pH≤7.0时，样品的个成分的电流淌度差别不大无法分离样品组分。当缓冲液pH增加时，样品中各成分的电流淌度的差别开始明显，分离效果增加。在pH值9.0～9.5时，缓冲液分离能力较强，分离效果相对较好。经过不同条件的优化得出最佳分离条件为：电泳缓冲液为30mmol/L硼砂和10mmol/L磷酸二氢钠缓冲；p H为9.0-9.2；电泳温度为25℃；进样时间为5-8s；进样压力为0.5psi；电压为25-35k V；紫外检测波长218-254nm。
一种金针菇中β-烟酰胺单核苷酸的毛细管电泳测定方法，该方法具体包括以下步骤。
步骤1、金针菇的预处理：取金针菇60℃烘干，粉碎，过400目筛，得到菌粉。
步骤2、样品溶液的制备：步骤1制得菌粉按照1克干重加水15毫升提取，65℃超声30min，过滤后取上清液，将处理好的提取物的上清液用0.22μm孔径的水系滤膜滤过，4℃保存待用。
步骤3、毛细管电泳分离条件如下：高效毛细管电泳仪(BECKMAN)，毛细管(BECKMAN)，有效检测长度57cm，内径为30μm，电泳缓冲液为30mmol/L硼砂和10mmol/L磷酸二氢钠缓冲，p H：9.0-9.2，电泳温度为25℃，进样时间为5-8s，进样压力为0.5psi，电压25-35k V，紫外检测波长218-254nm。
步骤4、β-烟酰胺单核苷酸的配制：精密称定5mgβ-烟酰胺单核苷酸到1.5mL的离心管中，用1.0mL超纯水溶解，配成5mg/mL的对照品母液，用0.22μm孔径的水系滤膜过滤备用，剩余放入冰箱4℃避光保存。将β-烟酰胺单核苷酸对照品母液配成浓度为0.03mg/ml、0.2mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml分别进行进样测定。以对照品浓度x(mg/mL)为横坐标，峰面积y为纵坐标进行线性回归。
步骤5、实验前用0.1mol/L NaOH溶液活化毛细管柱30min，再分别依次用超纯水、甲醇、超纯水、1mol/LHCl溶液、超纯水、0.1mol/LNaOH溶液、超纯水及运行缓冲液清洗毛细管5min。
步骤6、吸取5mg/mL的对照品β-烟酰胺单核苷酸母液10μL加到金针菇提取物上清液100μL，配成β-烟酰胺单核苷酸5μg/mL浓度；将NMN、金针菇、以及金针菇加NMN分别进样。
步骤7、β-烟酰胺单核苷酸标准品峰面积与浓度在0.03-2mg/ml范围内呈现良好的线性关系，将目的峰的峰面积带入回归方程，得β-烟酰胺单核苷酸的含量。
进一步地，步骤3中所述高效毛细管电泳仪为BECKMAN高效毛细管电泳仪。
进一步地，步骤4中的β-烟酰胺单核苷酸采用的是专用色谱的标准对照品，纯度大于95％以上。
高效毛细管电泳对金针菇中β-烟酰胺单核苷酸(NMN)的测定采用内标法，将NMN配成5μg/mL加入到处理好的金针菇样品中，将NMN、金针菇、以及金针菇加NMN分别进样，金针菇中β-烟酰胺单核苷酸测定的高效毛细管电泳图如图1所示，结果看出：NMN的对照品7.571-8.083左右时有特征峰出现，而在金针菇样品中也有相同时间的特征峰，所以表明在金针菇样品中含有β-烟酰胺单核苷酸。
将β-烟酰胺单核苷酸配成5mg/ml的母液，用超纯水溶解。将β-烟酰胺单核苷酸标准品配成浓度为0.03mg/ml、0.2mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml分别进行进样测定。以对照品浓度x(mg/mL)为横坐标，峰面积y为纵坐标进行线性回归，得回归方程，y＝2E+06x-345.69，R2＝0.9994，表明该曲线的线性关系良好，结果见图2-3。将样品峰的峰面积带入方程，得β-烟酰胺单核苷酸的含量为27.57μg/ml。
用上述金针菇中β-烟酰胺单核苷酸的毛细管电泳测定方法对桑黄和鹿茸菇进行NMN含量的测定，结果均未检测出NMN,桑黄中NMN含量测定电泳图如图4所示,鹿茸菇中NMN含量测定电泳图如图5所示。
实施例2高效毛细管电泳对金针菇中β-烟酰胺单核苷酸定量测定方法的方法学验证实验。
1、线性关系考察。
将β-烟酰胺单核苷酸配成5mg/ml的母液，用超纯水溶解。将β-烟酰胺单核苷酸标准品配成浓度为0.03mg/ml、0.2mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml分别进行进样测定。以对照品浓度x(mg/mL)为横坐标，峰面积y为纵坐标进行线性回归，得回归方程，y＝2E+06x-345.69，R2＝0.9994，表明该曲线的线性关系良好，结果见图2-3。
2、精密度考察。
精密度是指规定条件下对样品多次取样进行一系列检测结果有相近程度。取β-烟酰胺单核苷酸对照品溶液按照供试品溶液的制备和检测方法进行检测5次，考察色谱峰保留时间的一致性，记录出峰时间和峰面积，计算β-烟酰胺单核苷酸出峰时间RSD为0.68％；峰面积的RSD为1.44％，这表明该方法的精密度良好。
3、样品稳定性试验。
将同一份β-烟酰胺单核苷酸(NMN)对照品，按照配制方法溶解后，分别在0,2,4,6,8小时不同的时间点进行检测，以主要峰面积计算，考察样品的稳定性。记录β-烟酰胺单核苷酸位置的出峰时间RSD为1.26％；峰面积RSD为2.82％。结果见图6，这表明样品在8小时内是稳定的。
4、金针菇中β-烟酰胺单核苷酸回收率的测定。
将已知含量的针菇样品中按照测定的浓度分别加入300％,100％,30％三种不同量β-烟酰胺单核苷酸的标准溶液，按照制备方法配制并进行高效毛细管电泳进样测定，计算加样的回收率，回收率(％)＝实测添加量/标准添加量。结果见表1，β-烟酰胺单核苷酸平均回收率在89％-94％。表明该方法规范，误差小。
表1金针菇样品中添加β-烟酰胺单核苷酸回收率试验结果。
Figure BDA0003046968120000071
5、定量限。
选择线性最小浓度10ug/ml的样品进样，进样后主峰峰高是20mV，定量限浓度为浓度/峰高，也就是0.5ug/ml。
6、检测限。
用标准品添加到样品中的方式来考察灵敏度。检测限浓度为定量限/3，测得β-烟酰胺单核苷酸在金针菇提取物中的LOD为0.17μg/ml。

Claims (5)

1.一种金针菇中β-烟酰胺单核苷酸的毛细管电泳测定方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：
步骤1、金针菇的预处理：取金针菇烘干，粉碎，过筛，得到菌粉；
步骤2、样品溶液的制备：步骤1制得菌粉按照1克干重加水15毫升提取，65℃超声30min，过滤后取上清液，将处理好的提取物的上清液用0.22μm孔径的水系滤膜滤过，4℃保存待用；
步骤3、毛细管电泳分离条件如下：高效毛细管电泳仪，电泳缓冲液为 30mmol/L 硼砂和10mmol/L 磷酸二氢钠缓冲，p H：9.0-9.2，电泳温度为 25℃，进样时间为5-8s，进样压力为0.5psi，电压25-35k V，紫外检测波长218-254nm；
步骤4、β-烟酰胺单核苷酸的配制：精密称定5mg β-烟酰胺单核苷酸到1.5mL的离心管中，用1.0mL超纯水溶解，配成5mg/mL的对照品母液，用0.22μm孔径的水系滤膜过滤备用，剩余放入冰箱4℃避光保存；将β-烟酰胺单核苷酸对照品母液配成浓度为0.03mg/ml、0.2mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml分别进行进样测定，以对照品浓度x为横坐标，浓度单位mg/mL，峰面积y为纵坐标进行线性回归；
步骤5、实验前用0.1mol/L NaOH溶液活化毛细管柱30min，再分别依次用超纯水、甲醇、超纯水、1mol/L HCl溶液、超纯水、0.1mol/L NaOH溶液、超纯水及运行缓冲液清洗毛细管5min；
步骤6、吸取5mg/mL的对照品β-烟酰胺单核苷酸母液10μL加到金针菇提取物上清液100μL，配成β-烟酰胺单核苷酸5μg/mL浓度；将NMN、金针菇、以及金针菇加NMN分别进样；
步骤7、β-烟酰胺单核苷酸标准品峰面积与浓度在0.03-2mg/ml范围内呈现良好的线性关系，得到回归方程，将目的峰的峰面积带入方程，计算得到β-烟酰胺单核苷酸的含量。
2.如权利要求1所述的一种金针菇中β-烟酰胺单核苷酸的毛细管电泳测定方法，其特征在于，步骤1中烘干温度为60℃，过400目筛。
3.如权利要求1所述的一种金针菇中β-烟酰胺单核苷酸的毛细管电泳测定方法，其特征在于，步骤3中所述高效毛细管电泳仪为BECKMAN高效毛细管电泳仪，毛细管有效检测长度57cm，内径为30μm。
4.如权利要求1所述的一种金针菇中β-烟酰胺单核苷酸的毛细管电泳测定方法，其特征在于，步骤4中的β-烟酰胺单核苷酸是专用色谱的标准对照品，纯度大于95%以上。
5.如权利要求1所述的一种金针菇中β-烟酰胺单核苷酸的毛细管电泳测定方法，其特征在于，用权利要求1所述的金针菇中β-烟酰胺单核苷酸的毛细管电泳测定方法对桑黄和鹿茸菇进行β-烟酰胺单核苷酸含量的测定，均未检测出β-烟酰胺单核苷酸。
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高效毛细管电泳法测定羊肚菌(Morchella sextelata)菌丝中单核苷类化合物含量的研究;马晓颖;吕立涛;曹君;李跃;王红;;食品工业科技(15);全文 *

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