CN102103123A - 主流烟气中5-羟甲基-2-糠醛的毛细管电泳测定方法 - Google Patents
主流烟气中5-羟甲基-2-糠醛的毛细管电泳测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种主流烟气中5-羟甲基-2-糠醛的毛细管电泳测定方法，属于卷烟化学分析技术领域。所述测定方法：(1)对待测原样进行前处理；(2)具体测定条件如下：A、毛细管(75μm×57cm)，有效长度50cm；B、运行时的电泳介质为10～40mmol·l-1Na2HPO4(pH＝4.0～10.0)-20～80mmol·l-1十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5psi压力下进样10s；C、20kV恒压电泳，检测波长286nm，运行温度25℃；D、溶液和样品均用0.45μm滤膜过滤，并超声脱气15min。本发明创立了胶束毛细管电泳(MEKC)测定主流烟气中5-HMF的方法，为烟气成分分析提供了一种新的、高效、简便、环保的检测手段。
Description
技术领域
本发明属于卷烟化学分析技术领域，具体涉及应用胶束毛细管电泳(MEKC)对主流烟气中5-羟甲基-2-糠醛(5-HMF)进行测定的方法。
背景技术
现有技术中，5-羟甲基-2-糠醛(5-HMF)通常被认为是淀粉，纤维素以及多糖的降解产物，普遍存在于食品、香精香料、中药和注射液中。5-HMF也是烟用香精香料的香味成分之一，能有效地掩盖卷烟杂气，使烟气柔和，香气细腻，具有较明显的改进烟气质量的作用。文献报道称，该化合物对人体横纹肌和内脏有毒副作用，常被作为葡萄糖输液中的有害物质对其含量加以控制。但近年来研究发现，5-HMF不仅具有增强鼠红细胞变形活性及抗氧化、改变血液流变学等有益作用，而且可能通过抗氧化机制，起到保护肝组织和血管内皮细胞等作用。因此，5-HMF可能是一种被人们忽视的隐藏的活性成分。所以，对烟气中5-HMF测定是必要的。
常见的5-HMF检测方法有紫外分光光度法(UV)和高效液相色谱法(HPLC)。但两种方法均存在一定缺陷。紫外分光光度法的缺点是精密度较低，而且紫外吸收相近的物质之间存在较大干扰；与高效液相色谱法比较，毛细管电泳方法简便，溶剂和样品消耗少、经济环保，分离效率高于高效液相色谱。
在烟草成分分析中，胶束毛细管电泳(MEKC)一般用来检测生物碱，胺类和激素，未见毛细管电泳技术测定5-HMF的报道。现有技术对本发明的测定物质5-HMF的检测方法均存在缺陷，在烟草中5-HMF的含量很微量，胶束毛细管电泳方法需要的样品量少，适于检测微量的5-HMF。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明要解决的技术问题是提供一种主流烟气中5-羟甲基-2-糠醛的毛细管电泳测定方法，能对主流烟气中5-HMF进行微量、简便、灵敏的检测，从而弥补现有技术方法的不足。
本发明的技术方案是：主流烟气中5-羟甲基-2-糠醛的毛细管电泳测定方法，首先，用现有技术的方法，用自动吸烟机采集主流烟气待测物质于剑桥滤片上，所述测定方法依以下步骤及条件进行：
(1)对待测原样进行前处理
把采样后的剑桥滤片转移至提取瓶中，用50ml二氯甲烷超声提取3次，每次30min，提取完毕后合并提取液，过滤除去不溶残渣，滤液分三次于45℃下用旋转蒸发器挥去二氯甲烷，每次均加入5ml左右Na2HPO4缓冲液(pH＝5.0-7.0)，最后用Na2HPO4缓冲液定容到25mL，用0.45μm滤膜过滤，所得滤液为供试品溶液；
(2)对供试品溶液进行毛细管电泳测定，具体测定条件如下：
A、未涂层弹性石英毛细管(75μm×57cm)，有效长度50cm；
B、运行时的电泳介质为10～40mmol·l-1 Na2HPO4(pH＝4.0～10.0)-20～80mmol·l-1十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5psi压力下进样10s；
C、20kV恒压电泳，检测波长286nm，运行温度25℃；
D、实验用溶液和样品均用0.45μm滤膜过滤，并超声脱气15min。
B款所述的进样之前，依次使用0.5mol·l-1盐酸溶液、0.5mol·l-1氢氧化钠溶液、水，各冲洗毛细管2min，Na2HPO4缓冲液冲洗毛细管5min；再用B款所述的电泳介质平衡毛细管5min。
本发明创立了胶束毛细管电泳(MEKC)测定主流烟气中5-HMF的方法，为烟气成分分析提供了一种新的、高效、简便、环保的检测手段。本发明检测5-HMF方法的积极效果在于：
1.操作简单，成本低，环境友好
胶束毛细管电泳检测5-HMF只需少量实验室常用的酸、碱、盐分析纯和一台毛细管电泳仪即可完成任务。与其他方法相比，操作比较简单，不需要昂贵的色谱纯等试剂，也不产生污染环境的有机溶剂废液。
2.灵敏度较低，方法稳定
本方法的检测灵敏度与高效液相色谱法相当，大大高于紫外分光光度法。并且本方法的精密度试验中相对标准偏差低于5％，回收率在80％和120％之间，能够稳定完成对烟气中5-HMF的检测。
附图说明
附图1是5-羟甲基-2-糠醛标准样品最佳电泳条件下的电泳图谱；
附图2是某烟气样品在最佳电泳条件下的电泳图谱。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的相关技术问题作进一步详细的描述。附图1所显示的电泳图谱，其5-羟甲基-2-糠醛标准样品的最佳电泳条件是：50mmol·l-1SDS-20mmol·l-1 Na2HPO4(pH＝6.0)为电泳介质，温度25℃，电压20Kv，检测波长286nm，其中5-HMF标准品的浓度为20μg·ml-1。附图2所显示的电泳图谱，其烟气样品的最佳电泳条件是：50mmol·l-1 SDS-20mmol·l-1 Na2HPO4(pH＝6.0)为电泳介质，温度25℃，电压20Kv，检测波长286nm。
本申请人在创定本方法时所用仪器装置为：内径75μm的未涂层弹性石英毛细管，P/ACE System MDQ高效毛细管电泳仪。检测器为二极管阵列紫外检测器。所用试剂为：磷酸氢二钠，十二烷基硫酸钠，二氯甲烷，磷酸，盐酸，氢氧化钠和5-羟甲基-2-糠醛标准品；所用试剂为分析纯，所有溶液均用超纯水配制。本发明的方法中，就整体而言，还使用了与现有技术相同或相当的措施或条件，下面对本发明具体操作步骤简述如下：
[1]缓冲液的配置
(1)4.0≤pH≤10.0的Na2HPO4缓冲溶液配制：
先配制浓度为10～40mmol·l-1的Na2HPO4溶液和浓度为1.0mol·l-1的H3PO4溶液，然后用1.0mol·l-1的H3PO4溶液将pH调节至4.0～10.0。
(2)实验运行时的背景电解质配制：
以上述10～40mmol·l-1的Na2HPO4溶液(4.0≤pH≤10.0)为溶剂，配制浓度为20～80mmol·l-1十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，作为电泳运行的电泳介质。
[2]标准溶液的配制：
精密称取100mg 5-HMF标准品粉末置于50ml容量瓶中，用超纯水溶解并稀释至刻度，所得对照品贮备溶液于4℃冰箱中保存。
[3]供试品溶液制备：
烟支的选取及抽吸条件：选取市售卷烟烟支，在温度22℃±1℃、湿度60±1％的恒温恒湿箱中平衡48h，将调节好水分的卷烟样品取100支称重，求出烟支平均重量，选取平均重量在±0.02g范围内的烟支为重量合格烟支。按标准方法(GB/T 16450-2004，卷烟，常规分析用吸烟机定义和标准条件)进行卷烟抽吸及样品收集。在其烟嘴端以标准烟蒂长度画线，准确至0.5mm，标准烟蒂长度为下述三种长度中最大者：23mm，滤嘴长+8mm，卷烟纸+3mm。将卷烟插入SM450型20孔道自动吸烟机(这是本申请人实验用机，并非限定只有此机型)，在标准抽吸条件下(每口抽吸2s，抽吸体积35ml，每口间隔58s)抽吸卷烟，将主流烟气中总颗粒物收集于剑桥滤片上。每种卷烟采集三个平行样。
[4]样品前处理：
把采样后的剑桥滤片转移至提取瓶中，用50ml二氯甲烷超声提取3次，每次30min，提取完毕后合并提取液，过滤除去不溶残渣，滤液分三次于45℃下旋转蒸发挥去二氯甲烷，每次均加入5ml左右Na2HPO4缓冲液(pH＝6.0)，最后用Na2HPO4缓冲液定容到25mL，用0.45μm滤膜过滤，即得供试品溶液。
[5]毛细管处理：
进样前，先依次使用0.5mol·l-1盐酸溶液、0.5mol·l-1氢氧化钠溶液、水，冲洗毛细管各2min，Na2HPO4缓冲液冲洗毛细管5min；最后，用上述的电泳介质平衡毛细管5min。
[6]进行毛细管电泳测定，分析条件：
未涂层弹性石英毛细管(75μm×57cm)，有效长度50cm；运行时的电泳介质为10～40mmol·l-1 Na2HPO4(pH＝4.0～10.0)-20～80mmol·l-1十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5psi压力下进样10s；20kV恒压电泳，检测波长286nm，运行温度25℃；实验用溶液和样品均用0.45μm滤膜过滤，并超声脱气15min。
[7]测定结果的处理和计算(略)
本申请人在方法创立的同时，还就本方法的创立进行了一系统相关的技术探索，以下分别进行相关描述。
电泳条件的选择说明：
缓冲液的pH是影响分离度的一个重要因素，它直接影响待分离样品表面的电荷量及毛细管表面的电荷密度，使样品具有特定的荷质比。有研究表明随pH增大，电渗流增加，迁移时间缩短，相邻峰之间的分离度略有减小。但本研究中发现用Na2HPO4作缓冲液时，随着pH增大各组分出峰时间变短，但是分离度下降。因此需经综合考虑后，选定pH在4.0～10.0范围内。
对表面活性剂SDS浓度的选择是基于以下考虑。为了待测物质和中性物质有很好的分离效果，需在缓冲溶液中添加表面活性剂SDS。在胶束毛细管电泳(MEKC)模式下，SDS分子之间的疏水基团聚集在一起形成胶束(假固定相)，溶质基于在水相和胶束相之间的分配系数不同而得到分离。实验过程中SDS须超过其临界束胶浓度(8.2mmol·l-1)，本研究中发现随着浓度增大分离度越高，随着SDS浓度进一步增大样品分离度没有明显变化，反而电流增大，基线噪音增强。经综合考虑选定SDS浓度在20～80mmol·l-1范围内。
在本发明中Na2HPO4缓冲液浓度对样品的分离没有明显的影响，但是随着Na2HPO4浓度逐渐升高，电流在不断增大。考虑到增加缓冲溶液浓度会增加焦耳热效应，造成基线噪音增加，在尽可能获得最大缓冲能力的前提下，盐浓度的选择在10～40mmol·l-1范围内。
综合分离度、峰型和5-HMF出峰保留时间等方面确定分离度高，峰型对称和5-HMF保留时间最短为最佳条件，选择的最优电泳条件为：50mmol·l-1十二烷基硫酸钠(SDS)-20mmol·l-1磷酸氢二钠(pH＝5.0-7.0)为电泳介质，温度25℃，电压20Kv，检测波长286nm。此方法简便，消耗少，分离效率高，能够应用于主流烟气中5-HMF的测定。
本申请人还进行了束胶毛细管电泳法的方法学考察：
1、标准曲线及方法的检测限
精密吸取对照品贮备溶液用缓冲液逐级稀释，即得一系列浓度的对照品溶液。按照最佳电泳条件各进样3次。以对照品峰浓度(X，μg·ml-1)横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，回归方程为Y＝12267X-23470，R2＝0.9968，线性范围为5～100μg·ml-1。通过对标准溶液的不断稀释，以信噪比S/N＝3作为衡量标准，5-HM的检测限(方法能检测到的物质的最小浓度)为0.256ng·μl-1。
2、精密度试验
取同一种卷烟，按照供试品溶液制备方法处理得到样品溶液5组，按权利要求(6)中最佳电泳条件进样分析，对测定结果进行相对标准偏差(RSD≤5％)计算，得到5-HMF的RSD为3.91％。
3、加标回收率试验
配制低、中、高三种不同浓度的5-HMF标准溶液，加入样品溶液，使其最终浓度在标准曲线的线性范围内，按权利要求(6)中最佳电泳条件对原样品溶液和加入5-HMF标样的样品溶液进行分析测试。然后两种溶液中5-HMF含量相减后与标样含量进行对比计算回收率。以样品溶液中5-HMF为含量为标准，分别向其中加入低于，等于和高于样品5-HMF浓度的三种标样，计算加标回收率分别为91.67％、85.45％和83.33％，平均回收率为86.82％。
4、样品测试结果分析
将供试品溶液，平行3个样，通过毛细管电泳仪自带的软件进行所测峰面积的自动计算，然后将计算后的样品峰的峰面积代入上述标准曲线方程中，计算每支卷烟烟气中5-HMF的含量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
实施例1：
[1]缓冲液的配置
(1)4.0≤pH≤10.0的Na2HPO4缓冲溶液配制方法：
先配制浓度为20mmol·l-1的Na2HPO4溶液和浓度为1.0mol·l-1的H3PO4溶液，然后用1.0mol·l-1的H3PO4溶液将pH调节至6.0。
(2)实验运行时的背景电解质配制方法：
以上述20mmol·l-1的Na2HPO4溶液(pH＝6.0)为溶剂，配制浓度为50mmol·l-1十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，作为电泳运行的电泳介质。
[2]标准溶液的配制方法：
精密称取100mg 5-HMF标准品粉末置于50ml容量瓶中，用超纯水溶解并稀释至刻度，得对照品贮备溶液于4℃冰箱中保存。
[3]供试品溶液制备：
烟支的选取及抽吸条件：选取市售卷烟烟支，在温度22℃±1℃、湿度60±1％的恒温恒湿箱中平衡48h，将调节好水分的卷烟样品取100支称重，求出烟支平均重量，选取平均重量在±0.02g范围内的烟支为重量合格烟支。按标准方法(GB/T 16450-2004，卷烟，常规分析用吸烟机定义和标准条件)进行卷烟抽吸及样品收集。在其烟嘴端以标准烟蒂长度画线，准确至0.5mm，标准烟蒂长度为下述三种长度中最大者：23mm，滤嘴长+8mm，卷烟纸+3mm。将卷烟插入SM450型20孔道自动吸烟机，在标准抽吸条件下(每口抽吸2s，抽吸体积35ml，每口间隔58s)抽吸卷烟，将主流烟气中总颗粒物收集于剑桥滤片上。每种卷烟采集三个平行样。
[4]样品前处理方法：把采样后的滤片转移至提取瓶中，用50ml二氯甲烷超声提取3次，每次30min，提取完毕后合并提取液，过滤除去不溶残渣，滤液分三次于45℃下旋转蒸发挥去二氯甲烷，每次均加入5ml左右Na2HPO4缓冲液(pH＝6.0)，最后用Na2HPO4缓冲液定容到25mL，用0.45μm滤膜过滤，即得供试品溶液。
[5]毛细管处理：每天进样前均依次使用0.5mol·l-1盐酸溶液、0.5mol·l-1氢氧化钠溶液、水冲洗毛细管各2min，Na2HPO4缓冲液冲洗毛细管5min；每次进样前用权利要求(1)中的电泳介质平衡毛细管5min。
[6]具体分析方法：未涂层弹性石英毛细管(75μm×57cm)，有效长度50cm；运行时的电泳介质为20mmol·l-1 Na2HPO4(pH＝6.0)-50mmol·l-1十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5psi压力下进样10s；20kV恒压电泳，检测波长286nm，运行温度25℃；实验用溶液和样品均用0.45μm滤膜过滤，并超声脱气15min。
[7]样品测试结果及分析(单位：μg·支-1)
样品测试结果显示如表1，平行样品的相对标准偏差(RSD)基本在5％以下，表明该方法分析稳定性高，能够满足检测要求。样品卷烟2、3号的5-HMF含量均超过80μg·支-1，最低的4号样品卷烟也在66.01μg·支-1。说明卷烟主流烟气中的5-HMF具有较高含量。
表1
实施例2：
[1]缓冲液的配置
(1)4.0≤pH≤10.0的Na2HPO4缓冲溶液配制方法：
先配制浓度为20mmol·l-1的Na2HPO4溶液和浓度为1.0mol·l-1的H3PO4溶液，然后用1.0mol·l-1的H3PO4溶液将pH调节至6.0。
(2)实验运行时的背景电解质配制方法：
以上述20mmol·l-1的Na2HPO4溶液(pH＝6.0)为溶剂，配制浓度为50mmol·l-1十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，作为电泳运行的电泳介质。
[2]标准溶液的配制方法：
精密称取100mg 5-HMF标准品粉末置于50ml容量瓶中，用超纯水溶解并稀释至刻度，得对照品贮备溶液于4℃冰箱中保存。
[3]供试品溶液制备：
烟支的选取及抽吸条件：选取市售卷烟烟支，在温度22℃±1℃、湿度60±1％的恒温恒湿箱中平衡48h，将调节好水分的卷烟样品取100支称重，求出烟支平均重量，选取平均重量在±0.02g范围内的烟支为重量合格烟支。按标准方法(GB/T 16450-2004，卷烟，常规分析用吸烟机定义和标准条件)进行卷烟抽吸及样品收集。在其烟嘴端以标准烟蒂长度画线，准确至0.5mm，标准烟蒂长度为下述三种长度中最大者：23mm，滤嘴长+8mm，卷烟纸+3mm。将卷烟插入SM450型20孔道自动吸烟机，在标准抽吸条件下(每口抽吸2s，抽吸体积35ml，每口间隔58s)抽吸卷烟，将主流烟气中总颗粒物收集于剑桥滤片上。每种卷烟采集三个平行样。
[4]样品前处理方法：把采样后的滤片转移至提取瓶中，用50ml二氯甲烷超声提取3次，每次30min，提取完毕后合并提取液，过滤除去不溶残渣，滤液分三次于45℃下旋转蒸发挥去二氯甲烷，每次均加入5ml左右Na2HPO4缓冲液(pH＝6.0)，最后用Na2HPO4缓冲液定容到25mL，用0.45μm滤膜过滤，即得供试品溶液。
[5]毛细管处理：每天进样前均依次使用0.5mol·l-1盐酸溶液、0.5mol·l-1氢氧化钠溶液、水冲洗毛细管各2min，Na2HPO4缓冲液冲洗毛细管5min；每次进样前用权利要求(1)中的电泳介质平衡毛细管5min。
[6]分析方法：未涂层弹性石英毛细管(75μm×57cm)，有效长度50cm；运行时的电泳介质为20mmol·l-1Na2HPO4(pH＝6.0)-50mmol·l-1十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5psi压力下进样10s；20kV恒压电泳，检测波长286nm，运行温度25℃；实验用溶液和样品均用0.45μm滤膜过滤，并超声脱气15min。
[7]样品测试结果及分析(单位：μg·支-1)
样品测试结果显示如表2，平行样品的相对标准偏差(RSD)基本在5％以下，表明该方法分析稳定性高，能够满足检测要求。样品卷烟1、2、4号中5-HMF含量超过80μg·支-1。5号卷烟样品含量最低，也达到64.61μg·支-1。证明卷烟中5-HM具有较高的含量。
表2
Claims (2)
1.一种主流烟气中5-羟甲基-2-糠醛的毛细管电泳测定方法，用自动吸烟机采集主流烟气中待测原样于剑桥滤片上，其特征在于所述测定方法依以下步骤及条件进行：
(1)对待测原样进行前处理：
把采样后的剑桥滤片转移至提取瓶中，用50ml二氯甲烷超声提取3次，每次30min，提取完毕后合并提取液，过滤除去不溶残渣，滤液分三次于45℃下用旋转蒸发器挥去二氯甲烷，每次均加入5ml左右Na2HPO4缓冲液，pH为5.0-7.0，最后用Na2HPO4缓冲液定容到25mL，用0.45μm滤膜过滤，所得滤液为供试品溶液；
(2)对供试品溶液进行毛细管电泳测定，具体测定条件如下：
A、未涂层弹性石英毛细管(75μm×57cm)，有效长度50cm；
B、运行时的电泳介质为10～40mmol·l-1 Na2HPO4(pH＝4.0～10.0)-20～80mmol·l-1十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5psi压力下进样10s；
C、20kV恒压电泳，检测波长286nm，运行温度25℃；
D、实验用溶液和样品均用0.45μm滤膜过滤，并用超声波脱气15min。
2.根据权利要求1所述的主流烟气中5-羟甲基-2-糠醛的毛细管电泳测定方法，其特征在于：B款所述的进样之前，依次使用0.5mol·l-1盐酸溶液、0.5mol·l-1氢氧化钠溶液、水，各冲洗毛细管2min，Na2HPO4缓冲液冲洗毛细管5min；再用B款所述的电泳介质平衡毛细管5min。
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
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