CN104749263B - 麦角硫因的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种麦角硫因的高压液相色谱检测方法，包括采用亲水作用色谱（HILIC）分析色谱柱对含有麦角硫因的样品进行高压液相色谱分析，所述色谱柱采用HILIC填料作为固定相，采用（80～95）∶（20～5）的乙腈‑水（v/v）溶液作为流动相，所述溶液的pH为5.6～8.0，柱温为25～45℃。本发明还涉及麦角硫因的定量检测方法。

Description

麦角硫因的检测方法

技术领域

本发明属于生物化学技术、分析化学领域，涉及麦角硫因及其含量的测定方法。

背景技术

麦角硫因（L-Ergothioneine，EGT）是一种稀有的天然手性氨基酸类强抗氧化剂，是一种独特的细胞生理保护剂，具有抗氧化，螯合金属离子，防止紫外辐射以及调节生物能量、基因表达、免疫系统等诸多功能。由于麦角硫因特殊的生物学功能和药理活性，如：对抗炎症，防御神经组织退化，阻止铜引发DNA和蛋白质发生氧化损伤，抑制发育性缺陷，保护肝脏等，并且人和动物摄入后不会产生任何的毒副作用，属于通常认为安全的（generallyrecognized as safe,GRAS）产品，因此，麦角硫因在医药、食品、保健品和化妆品等行业具有广泛的应用前景。

麦角硫因的制备方法有化学合成法、天然生物提取法和生物合成法。食用蕈菌深层发酵生物合成麦角硫因具有产量高、成本低、易实现规模化生产及产品安全等优势。蕈菌发酵合成的麦角硫因绝大部分积累于菌丝体内，因此快速准确地检测菌丝体和发酵液中的麦角硫因，对于麦角硫因的研究和生产都至关重要。

至今尚没有麦角硫因检测方法的标准。国内外基本采用高压液相色谱技术测定麦角硫因，所用检测柱普遍为反相C₁₈柱。Huynh N.D.Bao利用两根串联的SymmetryShield^TMC₁₈柱（250mm×4.6mm，5μm）定量测定从金针菇子实体中提取的麦角硫因，使用的流动相是pH7.3含有3%乙腈和0.1%三乙胺的磷酸钠缓冲液（Huynh N.D.Bao a,Yoichi Shinomiya b,Hiroaki Ikeda,et al.,Preventing discoloration and lipid oxidation in darkmuscle of yellowtail by feeding an extract prepared from mushroom(Flammulinavelutipes)cultured medium[J].Aquaculture，2009,doi:10.1016/j.aquaculture.2009.06.042.）。N.Joy Dubost采用两根串联的Econosphere C₁₈柱（250mm×4.6mm，5μm）分离检测从蕈菌子实体中提取的麦角硫因，使用的流动相是pH7.3含有3%乙腈和0.1%三乙胺的磷酸钠缓冲液（N.Joy Dubost,BoxinOu,RobertB.Beelman.Quantification of polyphenols and ergothioneine in cultivatedmushrooms and correlation to total antioxidant capacity[J].Food Chemistry,2007,105:727-735.）。周念波使用Hypersil ODS C₁₈柱（250mm×4.6mm，5μm）测定从双孢菇子实体中提取的麦角硫因，所用流动相为乙腈-水（3∶97，v/v）溶液（周念波，朱艳琴，殷勤红．高效液相色谱法测定双孢菇中麦角硫因的含量[J]．食品科技，2010，35(10):271-272.）。Chih-Hung Liang利用Chrospher100C18柱测定从杏鲍菇深层发酵的菌丝体中提取的麦角硫因，所用流动相为含有3%乙腈和0.1%三乙胺的磷酸钠缓冲液（Chih-Hung Liang,Ling-Yi Huang,Kung-Jui Ho,et al.Submerged cultivation of mycelium with highergothioneine content from the culinary-medicinal king oyster mushroomPleurotus eryngii(higher basidiomycetes)and its composition[J].InternationalJournal of Medicinal Mushrooms,2013,15(2):153-164,）。姜文侠、刘琦和周涛建立的反相高压液相色谱检测方法是：色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C₁₈柱，两根串联使用，流动相为甲醇-水（1∶99，v/v）溶液（姜文侠，刘琦，周涛．麦角硫因的检测方法[P]．CN201210392294.8.）。

发明内容

本发明的目的是提供另一种麦角硫因的检测方法，本方法基于与反相C₁₈色谱不同的分离机理。本发明技术方案的特点在于采用亲水作用色谱（Hydrophilic InteractionLiquid Chromatography,HILIC）分析检测麦角硫因，所述高压液相检测方法的色谱条件如下：

采用HILIC填料作为色谱分析的固定相，色谱柱规格250mm×4.6mm；检测波长250～260nm，优选254nm；流动相为乙腈-水溶液。

上述麦角硫因的高压液相检测方法，其中所述流动相为（80～95）∶（20～5）的乙腈-水（v/v），使用10mmol/L～40mmol/L的乙酸铵缓冲液调节流动相的pH至5.6～8.0，优选（85～95）∶（15～5）的乙腈-水溶液（v/v），10mmol/L～25mmol/L的乙酸铵缓冲液调节流动相pH至6.0～8.0；柱温为25～45℃，优选30～40℃，最优选40℃；进样量及流速分别根据样品浓度和上样量而定，记录时间为40min，麦角硫因的出峰时间在19min～25min。

本发明的麦角硫因的定量检测方法中，标准曲线的绘制及待测样中麦角硫因的定量方法如下：

1）麦角硫因对照品的预处理步骤，包括制备含不同浓度的麦角硫因对照品的溶液；

2）对含不同浓度的麦角硫因对照品的溶液分别进行本发明所述的高压液相色谱检测；

3）根据麦角硫因对照品的浓度与相应的高压液相色谱峰面积绘制标准曲线；和

4）对麦角硫因待测样品进行本发明所述的高压液相色谱检测，根据检测结果的出峰时间和峰面积，比照对照品的出峰时间和标准曲线，对待测样品中的麦角硫因的含量进行定量。

其中，麦角硫因对照品的预处理步骤包括，精密称取一定量的麦角硫因对照品，用纯水配制成一定浓度梯度的麦角硫因对照品溶液；经微孔滤膜过滤，即得含不同浓度的麦角硫因对照品的溶液。上述微孔滤膜过滤步骤中选择孔径0.1～0.45μm的微孔滤膜，优选0.22μm孔径的微孔滤膜。

具体地，对含不同浓度的麦角硫因对照品的溶液进行高压液相色谱检测的条件，与上述的麦角硫因样品的高压液相色谱检测方法中使用的条件相同。

所述的系统适应性试验按照常规方法进行，包括检测限、定量限、精密度、重复性、稳定性、回收率的考察。

本发明的优势在于：首次采用HILIC色谱柱分析和检测麦角硫因，由于亲水色谱是一种用来改善在反相色谱中保留较差的强极性物质保留行为的色谱技术，通过采用强极性固定相——高纯硅胶键合中性亲水酰胺基团，同时结合高比例有机相/低比例水相组成的流动相来实现对强极性化合物的保留和分离的目的，尤其适用于普通反相色谱难以保留的物质的分离检测。

应用本发明的方法分析检测麦角硫因，达到了理想的保留及洗脱效果，麦角硫因与杂质有效分离，目的峰明显。本发明中的检测条件稳定、通用性强，适用于不同的HILIC分析柱以及对不同的麦角硫因样品进行分析测定。

附图说明

图1是实施例6中以VH510525BXN0068分析柱检测的麦角硫因样品溶液的HPLC图谱；

图2是实施例7中以VH510525BXN0095分析柱检测的麦角硫因样品溶液的HPLC图谱；

图3是实施例7中以VH510525BXN0096分析柱检测的麦角硫因样品溶液的HPLC图谱；

图4是实施例9中麦角硫因的HPLC标准曲线。

具体实施方式

本发明的以下实施例仅用来说明实现本发明的具体实施方式，这些实施方式不能理解为是对本发明的限制。相反，本发明不仅要包括这些实施方式，而且还要涵盖其它的任何在未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化。

主要仪器：高压液相色谱仪（Agela LC-10F）和HILIC分析色谱柱（VH510525BXN0068、VH510525BXN0095、VH510525BXN0096）均为天津博纳艾杰尔科技有限公司生产；中空纤维超滤膜（4kDa，天津爱生膜过滤技术有限公司）；微孔滤膜（0.22μm，天津博纳艾杰尔科技有限公司）；水浴（TW20型，Julabo）；数字式加热磁力搅拌器（MIX Control 20型，WIGGENS）；高速台式冷冻离心机（TGL-16M型，湘仪离心机仪器有限公司）；超声机（SB-5200D型，宁波新芝生物科技股份有限公司）。

主要试剂：麦角硫因对照品（纯度≥98%，Biomol International Inc.）；乙腈、甲醇、丙酮、乙醇等试剂均为市售色谱纯。化学试剂KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、NaOH、Na₂HPO₄、柠檬酸、乙酸铵等，购自国药集团化学试剂有限公司。玉米粉购自梅河口市兴达米业有限责任公司，豆粕粉购自北京中棉紫光生物科技有限公司，α-淀粉酶购自北京索莱宝科技有限公司，甘油购自天津市风船化学试剂科技有限公司，酪蛋白胨购自偃师市百家工贸有限公司。

实施例1：糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）CGMCC No.6232菌丝体发酵液的制备

斜面培养基：PDA培养基（Becton,Dickinson and Company）。

液体种子培养基（g/L）：玉米粉30g/L、豆粕粉15g/L、α-淀粉酶54U/L、KH₂PO₄3g/L、MgSO₄·7H₂O1.5g/L，其余为水，于121℃灭菌20min，在500mL三角瓶中的装液量为150mL。

液体发酵培养基（g/L）：甘油50g/L、酪蛋白胨35g/L、KH₂PO₄3g/L、MgSO₄·7H₂O1.5g/L，其余为水，其余为水，121℃灭菌20min，500mL三角瓶中装液量为150mL。

挑取斜面培养基菌种CGMCC No.6232的菌苔接入种子培养基，25℃摇床150rpm培养4天，得到种子液。将种子液按体积比5%的接种量接入发酵培养基，25℃摇床150rpm培养15天，得菌丝体发酵液。

实施例2：麦角硫因发酵液样品的预处理

实施例1中糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）CGMCC No.6232菌丝体深层发酵结束后，将菌丝体发酵液置于90℃水浴，200rpm搅拌条件下浸提15min，将麦角硫因浸提到细胞外。过滤，收集滤液，使用截留分子量为4kDa的超滤膜超滤，得到的超滤透过液即为高压液相检测的待测样品。

实施例3：麦角硫因水悬液样品的预处理

实施例1中糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）CGMCC No.6232菌丝体深层发酵结束后，过滤收集菌丝体，根据需要，按湿菌丝体重∶水（g湿菌丝体∶mL水）加入1∶15的水，制成菌丝体的水悬液。将菌丝体水悬液置于85℃水浴，以300rpm搅拌浸提10min，将麦角硫因浸提到水溶液中。过滤，收集滤液，使用截留分子量为4kDa的超滤膜超滤，得到的超滤透过液即为高压液相检测的待测样品。

实施例4：对照品溶液的制备

精密称取麦角硫因对照品10mg，于25mL容量瓶中加纯水配制成浓度为400mg/L的对照品贮备液。再精密吸取贮备液适量，加纯水制成浓度分别为40、80、120、160和200mg/L浓度的溶液，经0.22μm微孔滤膜过滤，即得对照品溶液。

实施例5：色谱条件的优化

初始色谱检测条件：高压液相色谱（Agela LC-10F），HILIC分析色谱柱（250mm×4.6mm，5μm，VH510525BXN0068），流动相为乙腈-水（85∶15，v/v），检测波长254nm，柱温30℃，流速1mL/min，进样量10μL；进样物质为实施例2和3处理得到的待测样品溶液。

（1）流动相组成的选择：分别使用相同体积的甲醇、丙酮和乙醇替代乙腈作为流动相中的有机相，其他条件与初始色谱条件相同。

检测结果：选用甲醇作有机相时，麦角硫因保留较弱，与杂质分离度差，峰型拖尾；选用丙酮作有机相时，流动相在254nm下吸收太强，盖住样品峰；选用乙醇作有机相时，麦角硫因与杂质分离度差，样品峰型拖尾；选用乙腈作有机相，麦角硫因的峰形及与杂质的分离度均较好，故选择乙腈-水作为流动相组成。

（2）流动相组成比例的选择：分别使用体积比为80∶20、85∶15、90∶10和95∶5的乙腈-水做流动相，其他条件与初始色谱条件相同。

检测结果：采用上述的流动相比例均能实现麦角硫因与杂质的分离，乙腈在流动相中所占比例越大，麦角硫因与杂质的分离效果越好，但有机相比例过高时，麦角硫因不易被洗脱，致使保留时间过长，不利于麦角硫因的检测分析，故选择（80～95）∶（20～5）的乙腈-水（v/v）作为流动相。

（3）流动相pH的优化：使用20mmol/L的乙酸铵缓冲液调节流动相的pH至5.0、5.6、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，其他条件与初始色谱条件相同。

检测结果：使用乙酸铵缓冲液调节流动相的pH至5.6～8.0之间，麦角硫因与杂质的分离度明显优于其他pH条件下的分离度，pH6.0时分离效果最佳。pH过高或过低均不利于麦角硫因与杂质的分离。

（4）使用5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/和50mmol/L的乙酸铵缓冲液调节流动相的pH至6.0，其他条件同初始色谱条件。

检测结果：5mmol/L的缓冲液对麦角硫因与杂质的分离效果基本无影响，盐浓度过高则在流动相中的溶解较差。当盐浓度在10mmol/L～40mmol/L之间较利于样品与杂质的分离。盐浓度为20mmol/L时，麦角硫因的峰形更好，因此选择乙酸铵缓冲液的浓度为20mmol/L。

（5）使用20mmol/L的磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液调节流动相的pH至6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，其他条件同初始色谱条件。

检测结果：由于流动相中乙腈的浓度较高，磷酸缓冲盐在流动相中的溶解度较差，不宜使用。

（6）使用20mmol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液调节流动相的pH至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，其他条件同初始色谱条件。

检测结果：由于流动相中乙腈的比例较高，导致柠檬酸缓冲盐的溶解度较差，不宜使用。

（7）柱温的优化：调节柱温分别为25℃、30℃、35℃、40℃和45℃，其他条件同初始色谱条件。

检测结果：上述温度均能实现麦角硫因与杂质的有效分离，但温度越低峰形越宽，出峰时间越长。40℃与45℃条件下分离效果接近，因此选择40℃作色谱检测的适宜柱温。

实施例6：色谱条件优化结果

优化后的色谱检测条件：高压液相色谱（Agela LC-10F），HILIC分析色谱柱（250mm×4.6mm，5μm，VH510525BXN0068），流动相为乙腈-水（85∶15，v/v），使用20mmol/L的乙酸铵缓冲液调节流动相的pH至6.0，检测波长254nm，柱温40℃，流速1mL/min，进样量10μL；进样物质为实施例2处理得到的待测样品溶液。结果见附图1。

由附图1可见，麦角硫因达到了理想的保留效果，与杂质实现有效分离，目的峰明显，峰形较好。

实施例7：色谱柱重现性考察

另选择两根规格和填料与VH510525BXN0068柱相同的HILIC分析柱VH510525BXN0095和VH510525BXN0096，进行色谱柱重现性测试，其它色谱检测条件同实施例6，结果见附图2、3。

由附图1、2、3看出，三根不同的HILIC分析柱均能使麦角硫因样品达到理想的分离效果，表明使用HILIC色谱检测麦角硫因具有条件稳定、通用性强的优点。

实施例8：检测限和定量限实验

使用流动相逐步稀释由实施例4制备的麦角硫因对照品溶液，进行色谱分析，色谱条件同实施例6，在信噪比S/N为3和10时，计算得麦角硫因的最低检测限和定量限分别为4mg/L和10mg/L。

实施例9：标准曲线的绘制

将由实施例4制备得到的麦角硫因对照品溶液进行色谱检测，检测条件同实施例6，记录色谱图，根据对照品的浓度与相应的峰面积绘制标准曲线，结果见附图4。标准曲线用于定量测定样品中麦角硫因的含量。

实施例10：精密度试验

对由实施例2得到的1份待测样品溶液进行5次平行的高压液相色谱测定，色谱条件同实施例6，麦角硫因含量检测结果的相对标准偏差RSD为1.47%，表明该方法的精密度良好。

实施例11：重复性试验

取1份麦角硫因发酵液，按照实施例2的方法平行制备5份待测样品溶液，测定麦角硫因的含量，计算麦角硫因含量的RSD值为1.03%，表明该方法重复性良好。

实施例12：样品的时间稳定性的考察

取实施例2处理得到的1份待测样品，在室温下分别放置0、2、4、6、8、10、14和24h后进行测定，色谱检测条件同实施例6，结果见表1，计算麦角硫因含量的RSD值为1.66%，表明待测样品在24h内稳定。

表1麦角硫因的含量随样品存放时间的变化

实施例13：加样回收率试验

取由实施例2得到的2份待测样品溶液，分别添加已知浓度的麦角硫因对照品溶液，测定麦角硫因在样品中的含量，色谱检测条件同实施例6，每份样品平行进样5次，根据检测值计算出麦角硫因的回收率，检测结果见表2。由麦角硫因检测回收率的实验结果看出，本方法可满足定量分析的要求。

表2麦角硫因回收率的测定结果

*回收率=（检测值－样品溶液中麦角硫因浓度）/麦角硫因对照溶液浓度×100%

Claims (7)

1.一种麦角硫因的高压液相色谱检测方法，包括采用亲水作用色谱分析色谱柱对含有麦角硫因的样品进行高压液相色谱分析，所述色谱柱采用亲水作用色谱填料作为固定相，采用体积比为80:20～95:5的乙腈-水溶液作为流动相，使用10mmol/L～40mmol/L的乙酸铵缓冲液调节所述流动相的pH，所述溶液的pH为5.6～8.0，柱温为25～45℃。

2.如权利要求1所述的检测方法，其中所述流动相为体积比为85:15～95:5的乙腈-水溶液。

3.如权利要求1所述的检测方法，其中所述溶液的pH为6.0～8.0。

4.如权利要求1所述的检测方法，其中所述柱温为30～40℃。

5.如权利要求1所述的检测方法，其中使用10mmol/L～25mmol/L的乙酸铵缓冲液调节所述流动相的pH至预定范围。

6.如权利要求1所述的检测方法，其中麦角硫因的出峰时间在19min～25min，检测波长为250～260nm。

7.一种麦角硫因的定量检测方法，包括如下步骤：

1)麦角硫因对照品的预处理步骤，包括制备含不同浓度的麦角硫因对照品的溶液；

2)对含不同浓度的麦角硫因对照品的溶液分别进行如权利要求1－6中任一项所述的高压液相色谱检测；

3)根据麦角硫因对照品的浓度与相应的高压液相色谱峰面积绘制标准曲线；和

4)对麦角硫因待测样品进行如权利要求1－6中任一项所述的高压液相色谱检测，根据检测结果的出峰时间和峰面积，比照麦角硫因对照品的出峰时间和标准曲线，对待测样品中的麦角硫因的含量进行定量。