CN103323551A

CN103323551A - 一种检测枸杞酸含量的方法

Info

Publication number: CN103323551A
Application number: CN2013102567801A
Authority: CN
Inventors: 殷梦龙; 杨延超; 董慧燕; 李旭孟
Original assignee: NUODE BIOLOGICAL IND CO Ltd SHANGHAI
Current assignee: NUODE BIOLOGICAL IND CO Ltd SHANGHAI
Priority date: 2013-06-25
Filing date: 2013-06-25
Publication date: 2013-09-25

Abstract

本发明提供了一种检测枸杞酸含量的方法。本发明采用HPLC（高效液相色谱）方法检测枸杞或枸杞提取物中枸杞酸的含量。本发明的检测方法科学有效，可应用于枸杞原药材和采用枸杞为原料进行深加工后所得枸杞提取物中枸杞酸含量的检测，能很好地对产品质量进行控制，并具有鉴别别产品真伪的效果，有较大的实际应用价值和积极的社会效益。

Description

一种检测枸杞酸含量的方法

技术领域

本发明涉及中药，具体涉及中药枸杞中有效成分含量的检测方法，尤其涉及一种有效成分枸杞酸含量的检测方法。

背景技术

枸杞是一种灌木果实，其学名为（ＬｙｃｉｕｍｂａｒｂａｒｕｍＬ．）目前已成为家喻户晓的对健康有益的食品，近年来大量进入美洲和欧洲市场，被看成是一种具有很强生命力的补益食品。近代世界对枸杞的研究显示，其果实内含有大量对人体有益的天然营养素。枸杞浑身是宝，人体所需要的必要营养素它都充分拥有。比如：碳水化合物如：多糖、低聚糖、单糖、食物纤维；抗氧化物质如：抗坏血酸、类胡萝卜素、牛磺酸、黄酮类化合物、谷胱甘肽、枸杞酸；还有其它多种人体必需的氨基酸以及甾体化合物、生物碱等。还经过加工开发了多种枸杞的保健食品，但是，对于枸杞及其加工产品中所有的枸杞酸含量缺乏有效、科学的检测方法。因此，研究检测枸杞酸含量的方法，具有积极意义。

发明内容

本发明提供了一种检测枸杞酸含量的方法。

本发明采用HPLC（高效液相色谱）方法检测枸杞或枸杞提取物中枸杞酸的含量。

本发明方法包括下列步骤：

（1）色谱分析条件：二元醇基键合色谱柱(4.6×150mm，粒径5μm)，SPD-10AV紫外可见检测器，CTO-6A柱温箱，SIL-10AD自动进样器，DGU-14A排气器，LC-10AD泵；进样量10μl，自动进样；流动相为乙腈-66.7mM醋酸铵（85/15,v/v），等梯度洗脱；流速为0.7ml/min；柱温为40℃；检测波长为260nm；

（2）供试品溶液的制备

精密称取枸杞提取物0.5g于100ml锥形瓶中，加30ml水溶解，在温度80～90℃助溶15min，温度25℃超声15min，冷却至室温，转移至50ml容量瓶中，并用水定容，从中吸取4ml溶液于25ml容量瓶中，用乙腈定容即可，分析时，供试品溶液过0.45μm有机系微孔滤膜，取续滤液进样；或

精密称取0.3g枸杞子，加1ml水置于温度0～4℃溶胀1h，研碎，加15ml乙腈-水（3:7）混匀，在温度25～30℃超声15min，冷却至室温，离心（800×g）20min，上清液转移至100ml容量瓶中，沉淀部分用10ml乙腈-水（3:7）按上述条件进行第二次提取，离心后将两次上清液合并于100ml容量瓶，用乙腈定容即可，分析时，供试品溶液过0.45μm有机系微孔滤膜，取续滤液进样；

（3）对照品溶液的制备精密称取在减压干燥器干燥12小时的枸杞酸对照品7.78mg于100ml容量瓶中，加1ml水溶解并用流动相稀释至刻度，配成77.80μg/ml的枸杞酸对照品贮备溶液；

（4）枸杞酸的检测限和定量限浓度分别为2.5×10^-2与8.2×10^-2μg/ml

（5）在上述条件下，通过HPLC检测。

本发明方法所述步骤（2）供试品溶液的制备用低级醇或乙腈。所述低级醇选自C₁、C₂或者C₃的伯醇或者仲醇，它们可以是一元醇也可以是二元醇。

本发明的检测方法科学有效，可应用于枸杞原药材和采用枸杞为原料进行深加工后所得枸杞提取物中枸杞酸含量的检测，能很好地对产品质量进行控制，并具有鉴别别产品真伪的效果，有较大的实际应用价值和积极的社会效益。

附图说明

图1实施例1枸杞样品前处理后的HPLC图谱

图2实施例2枸杞多糖提取物样品前处理后的HPLC图谱

图3实施例4枸杞低聚糖提取物样品前处理后的HPLC图谱

图4实施例6枸杞酸浓度和峰面积的线性关系

纵坐标：峰面积；横坐标：枸杞酸浓度μg/ml

具体实施方式

实施例1

精密称取0.3g枸杞子（市售，280粒/50g），加1ml水置于温度0～4℃溶胀1h，磨碎，加15ml乙腈-水（3:7）混匀，在温度25～30℃超声15min，冷却至室温，离心（800×g）20min，上清液转移至100ml容量瓶中。沉淀部分用10ml乙腈-水（3:7）按上述条件进行二次提取，离心后将两次上清液合并于100ml容量瓶，用乙腈定容即可。分析时，供试品溶液过0.45μm有机系微孔滤膜。滤液进样后（采用HPLC检测，仪器型号：Agilent1100）

测得枸杞子中枸杞酸含量为1.34%。

实施例2

精密称取枸杞多糖提取物（实施例3制备）0.5g于100ml锥形瓶中，加30ml水溶解，在温度80～90℃助溶15min，温度25℃超声15min，冷却至室温，转移至50ml容量瓶中，并用水定容。从中吸取4ml溶液于25ml容量瓶中，用乙腈定容即可。分析时，供试品溶液过0.45μm有机系微孔滤膜。滤液进样后（采用HPLC检测，仪器型号：Agilent1100）。

测得枸杞多糖提取物中枸杞酸含量为2.41%。

实施例3枸杞多糖提取物制备

称取宁夏产枸杞干果10公斤，用反渗透饮用纯净水冲淋洗去浮尘。用反渗透饮用纯净水浸提两次，用量每次80KG，每次静态浸提2小时，浸提温度80℃。浸提取得的料液经过原位过滤。合并浸提液用0.1μm的精滤膜滤清。滤清液采用10000D超滤膜处理获取超滤后的截留液。截留液真空浓缩参数为-90～-95兆帕50～60℃。物料浓缩到Brix20～26停止浓缩放出料液。浓缩好的物料采用超高温灭菌设备（型号：BTG1-5.5，灭菌条件：119-125℃，25HZ）灭菌，然后用喷雾干燥设备喷雾干燥，喷雾干燥进风温度控制在110～120℃，出风温度控制在85～90℃。获得干燥粉末枸杞多糖提取物615g。

实施例4

称取枸杞低聚糖提取物（实施例5制备）0.5g于100ml锥形瓶中，加30ml水溶解，在温度80～90℃助溶15min，温度25℃超声15min，冷却至室温（25℃），转移至50ml容量瓶中，并用水定容。从中吸取4ml溶液于25ml容量瓶中，用乙腈定容即可。分析时，供试品溶液过0.45μm有机微孔滤膜。滤液进样后（采用HPLC检测，仪器型号：Agilent1100）

测得枸杞低聚糖提取物中枸杞酸含量为1.33%。

实施例5制备枸杞低聚糖提取物

称取宁夏产枸杞干果10公斤，用反渗透饮用纯净水冲淋洗去浮尘。用反渗透饮用纯净水浸提两次，用量每次80KG，每次静态浸提2小时，浸提温度80℃。浸提取得的料液经过原位过滤。合并浸提液用0.1μm的精滤膜滤清。滤清液采用10000D超滤膜处理获取超滤后的通过液。通过液真空浓缩参数为-90～-95兆帕50～60℃。物料浓缩到Brix20～26停止浓缩放出料液。浓缩好的物料采用超高温灭菌设备（型号：BTG1-5.5，灭菌条件：119-125℃，25HZ）灭菌，然后用喷雾干燥设备喷雾干燥，喷雾干燥进风温度控制在110～120℃，出风温度控制在85～90℃。获得干燥粉末枸杞低聚糖提取物4350g。

实施例6 本发明检测方法的建立试验

本发明采用HPLC仪器建立起来的含量测定方法，主要包括部分有：1.色谱分析条件。2.对照品溶液的制备。3.供试品溶液的制备。4.检测限和定量限的确定。5.标准曲线的制作。6.精密度实验。7.稳定性实验。8.重现性实验。9.回收率实验。本专利发明人在经过努力工作后获得了以下的具体发明内容。

一、色谱分析条件二元醇基键合色谱柱(4.6×150mm,粒径5μm)，SPD-10AV紫外可见检测器，CTO-6A柱温箱，SIL-10AD自动进样器，DGU-14A排气器，LC-10AD泵；进样量10μl，自动进样；流动相为乙腈-66.7mM醋酸铵（85/15,v/v），等梯度洗脱；流速为0.7ml/min；柱温为40℃；检测波长为260nm。

二、供试品溶液的制备：

（1）精密称取枸杞提取物0.5g于100ml锥形瓶中，加30ml水溶解，在温度80～90℃助溶15min，温度25℃超声15min，冷却至室温，转移至50ml容量瓶中，并用水定容。从中吸取4ml溶液于25ml容量瓶中，用乙腈定容即可。分析时，供试品溶液过0.45μm有机系微孔滤膜。

（2）精密称取0.3g枸杞子，加1ml水置于温度0～4℃溶胀1h，磨碎，加15ml乙腈-水（3:7）混匀，在温度25～30℃超声15min，冷却至室温，离心（800×g）20min，上清液转移至100ml容量瓶中。沉淀部分用10ml乙腈-水（3:7）按上述条件进行二次提取，离心后将两次上清液合并，用乙腈定容即可。分析时，供试品溶液过0.45μm有机系微孔滤膜。

三、对照品溶液的制备精密称取在减压干燥器干燥12小时的枸杞酸对照品7.78mg于100ml容量瓶中，加1mL水溶解并用流动相稀释至刻度，配成77.80μg/ml的枸杞酸对照品贮备溶液。

四、检测限和定量限的确定用一系列已知浓度的标准供试品进行分析，（采用HPLC检测，仪器型号：Agilent1100）通过考察图谱的信噪比来确定检测限和定量限。结果表明，枸杞酸的检测限和定量限浓度分别为2.5×10^-2与8.2×10^-2μg/ml，如表1所示。

表1枸杞酸的检测限和定量限浓度及信噪比

项目	浓度（μg/ml）	信噪比S/N
			检测限	2.5×10^-2	4.9
定量限	8.2×10^-2	12.3

五、标准曲线的制作精密量取77.80μg/ml的枸杞酸对照品贮备液2.5、12.5ml置于100ml容量瓶，2.5、5.0、7.5ml置于10ml容量瓶中。用流动相定容，制成1.95、9.73、19.45、38.90、58.35μg/ml的枸杞酸对照品溶液。各吸取10μl进样，按上述色谱条件进行色谱分析，检测结果如表2所示。

以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线并进行线性回归，得枸杞酸线性方程Y=29.2x+3.8，r=0.9999，如图1所示。表明枸杞酸在1.95～77.80μg/ml范围内线性良好。

表2枸杞酸浓度及峰面积的对应关系(进样体积10ul)

六、精密度实验精密吸取对照品溶液10μl，连续进样6次，按上述色谱条件进行色谱分析，检测结果如表3所示。枸杞酸峰面积RSD为0.19%，表明仪器的精密度良好。

表3（提取物）供试品精密度试验结果

七、稳定性实验精密吸取对照品溶液10μl，分别于0，1，2，4，8，24小时进样，按上述色谱条件进行色谱分析，检测结果如表4所示。枸杞酸峰面积RSD为0.25%，表明对照品溶液在24小时内稳定性较好。

表4（提取物）供试品稳定性试验结果

八、重现性实验分别取适量低聚糖提取物、多糖提取物和枸杞子样品三份，按照上述相应的提取方法制备供试品溶液，在不同日期使用不同的仪器对样品中枸杞酸含量进行检测，结果如表5、6和7所示。其RSD依次为2.75%、1.64%和2.55%（n=6）。表明方法的重现性良好。

表5（低聚糖提取物）供试品重复性试验结果

表6（多糖提取物）供试品重复性试验结果

表7（枸杞子）供试品重复性试验结果

九、回收率实验精密称取已知枸杞酸含量的枸杞子、提取物样品，分别添加适量枸杞酸对照品，按提取物、药材供试品溶液的制备方法制备供试品溶液并用上述色谱条件进行测定，以下式计算回收率。结果如表8、9所示，表明该检测方法有良好的回收率。

回收率=（枸杞酸含量检测值-样品中枸杞酸含量实际值）/添加枸杞酸对照品的量×100%

表8（提取物）加样回收率测定结果（对照品浓度=40.59μg/ml）

表9（枸杞子）加样回收率测定结果（对照品浓度=40.59μg/ml）

研究表明，一般枸杞中枸杞酸含量在2%左右。依此也就可以推测出产品的收率。

Claims

1.一种检测枸杞酸含量的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

（1）HPLC条件：二元醇基键合色谱柱4.6×150mm,粒径5μm，SPD-10AV紫外可见检测器，CTO-6A柱温箱，SIL-10AD自动进样器，DGU-14A排气器，LC-10AD泵；进样量10μl，自动进样；流动相为乙腈-66.7mM醋酸铵85/15，v/v，等梯度洗脱；流速为0.7ml/min；柱温为40℃；检测波长为260nm；

（2）供试品溶液的制备精密称取0.3g枸杞子，加1ml水置于温度0～4℃溶胀1h，磨碎，加15ml乙腈-水3:7V/V混匀，在温度25～30℃超声15min，冷却至室温，离心800×g20min，上清液转移至100ml容量瓶中，沉淀部分用10ml乙腈-水3:7V/V按上述条件进行二次提取，离心后将两次上清液合并至100ml容量瓶，用乙腈定容，分析时，供试品溶液过0.45μm有机系微孔滤膜；

（4）枸杞酸的检测限和定量限浓度分别为2.5×10^-2与8.2×10^-2μg/ml；

（5）在上述条件下，通过HPLC检测。

2.根据权利要求1所述一种检测枸杞酸含量的方法，其特征在于，所述步骤（2）供试品溶液的制备为精密称取枸杞提取物0.5g于100ml锥形瓶中，加30ml水溶解，在温度80～90℃助溶15min，温度25℃超声15min，冷却至室温，转移至50ml容量瓶中，并用水定容，从中吸取4ml溶液于25ml容量瓶中，用乙腈定容，分析时，供试品溶液过0.45μm有机系微孔滤膜。

3.根据权利要求1所述一种检测枸杞酸含量的方法，其特征在于，所述步骤（2）供试品溶液的制备用低级醇或乙腈。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）低级醇选自C₁、C₂或者C₃的伯醇或者仲醇。