CN104198623A - 检测猪组织中孟布酮残留的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了检测猪组织中孟布酮残留的方法，首先称取经肌注孟布酮注射液之后的猪组织，切碎后匀浆，匀浆组织用乙腈提取，提取液离心后于温度为60℃的真空下旋转蒸发至干，冷确后，向残渣中加入流动相超声溶解，然后离心，收集上清液，上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液即为供试品溶液；其次精密称定孟布酮对照品，用乙腈溶解后用流动相稀释制成浓度为10±1μg/mL，制得对照品溶液；最后将供试品溶液和对照品溶液采用高效液相色谱法检查，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，得组织中孟布酮的残留量；该方法专属性好，灵敏度高、重复性好，能够快速检测猪组织中孟布酮的残留，为控制动物性食品中孟布酮的残留量提供可靠的方法。

Description

检测猪组织中孟布酮残留的方法

技术领域

本发明属于分析技术领域，具体涉及检测猪组织中孟布酮残留的方法。

背景技术

消化系统疾病在动物的生长过程中时常发生，其中消化不良、食欲不振、便秘腹胀等胃肠机能障碍常导致动物生长发育受阻，阻碍养殖业的发展。临床上在治疗该类疾病或症状时，常选用氨甲酰甲胆碱、甲硫酸新斯的明、浓氯化钠注射液等拟胆碱或抗胆碱酯酶药物，但该类药物选择性差，副作用多，毒性大，安全范围小。

孟布酮(Menbutone)是一种动物专用利胆剂，能够促进胆汁、胃液和胰液的分泌，从而使胆酸盐、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶等的供应量增加，有效治疗动物的消化不良、食欲不振、便秘腹胀等胃肠机能障碍，改善消化、吸收功能。在欧洲，孟布酮已被应用于猪、牛、绵羊、山羊、马、狗的消化不良、厌食、便秘、毒血症、肝脏和胰腺功能不全所致的消化机能障碍，治疗效果良好。此外，孟布酮对中枢神经系统、心血管系统、呼吸系统、泌尿系统和生殖系统均无明显不良影响，对雌性动物的子宫平滑肌基本无作用，不会引起生殖不利和流产，故本品可用于怀孕动物。

研究表明，孟布酮在体内主要以原型滞留在肌肉、脂肪、肝脏和肾脏中。由于孟布酮在体内消除迅速，临床主要用于并不立即宰杀的动物，故欧盟兽药委员会认为没有必要规定孟布酮的最高残留限量(MRL)。但全球对兽药残留要求最严的日本发布并规定了孟布酮在猪的肌肉、脂肪、肝脏、肾脏中的最高残留限量(MRL)均为40μg/kg。因此，为了有效控制动物性食品中孟布酮的残留量，有必要建立孟布酮的残留检测方法，进而制定出孟布酮的休药期，并实时检测及监控市场上可食性组织中孟布酮的残留量。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供检测猪组织中孟布酮残留的方法，利用该方法能够准确、快速检测猪组织中孟布酮的残留，为控制动物性食品中孟布酮的残留量提供可靠的方法。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

检测猪组织中孟布酮残留的方法，包括如下步骤：

(1)组织样品前处理：称取经肌注孟布酮注射液之后的猪组织，切碎后，在转速为2800～7000r/min条件下匀浆3～9min，然后精密称取匀浆组织，并按匀浆组织与乙腈的重量体积比为1:2加入乙腈，涡旋混匀后离心收集上清液，沉淀用乙腈重复提取0～3次，合并上清液，并将上清液于温度为60℃的真空下旋转蒸发至干，冷至18～25℃后，向残渣中加入流动相超声溶解，流动相加入量按匀浆组织与流动相的重量体积比为1:1；然后离心，上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液即为供试品溶液；

(2)制备对照品溶液：精密称定孟布酮对照品，用乙腈溶解后用流动相稀释制成浓度为10±1μg/mL，制得对照品溶液；

(3)采用高效液相色谱法检查：将步骤(1)制得供试品溶液和步骤(2)制得对照品溶液各取20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，得猪组织中孟布酮的残留量；所用高效液相色谱法的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈与0.5％(w/v)的磷酸溶液按体积比53～57：47～43组成的混合液为流动相，检测波长为235～240nm，理论塔板数以孟布酮峰计算不低于2000，孟布酮峰与相邻杂质峰的分离度大于1.5。

优选的，步骤(1)中，所述匀浆是在转速为5000～7000r/min条件下匀浆7～9min。

更优选的，步骤(1)中，所述匀浆是在转速为6000r/min条件下匀浆8min。

优选的，步骤(1)中，沉淀用乙腈重复提取2～3次。

优选的，步骤(1)中，乙腈提取的离心是在3000r/min条件下离心10min。

优选的，步骤(1)中，样品溶解后的离心是在10000r/min条件下离心10min。

优选的，步骤(3)中，所述流动相为乙腈与质量百分比0.5％的磷酸溶液按体积比55:45组成的混合液。

优选的，步骤(3)中，所述检测波长为235nm。

优选的，步骤(3)中，流动相流速为0.8～1.2mL/min，色谱柱柱温为20～30℃。

更优选的，步骤(3)中，流动相流速为1.0mL/min，色谱柱柱温为25℃。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种检测猪组织中孟布酮残留的方法，该方法准确性好，灵敏度高，操作简单，能够检测猪组织中孟布酮的残留，为控制动物性食品中孟布酮的残留量提供可靠的方法。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为系统适用性试验色谱图(A：空白溶液；B：对照品溶液)。

图2为专属性试验色谱图(A：空白肌肉组织溶液；B：空白肌肉组织添加溶液；C：空白脂肪组织溶液；D：空白脂肪组织添加溶液；E：空白肝脏组织溶液；F：空白肝脏组织添加溶液；G：空白肾脏组织溶液；H：空白肾脏组织添加溶液)。

图3为孟布酮定量限色谱图。

图4为孟布酮检测限色谱图。

图5为孟布酮标准曲线图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

本发明中主要药品、仪器与试验动物：孟布酮对照品由德国Dr.Ehrenstorfer公司提供，批号01117，含量99.9％；孟布酮注射液按公开号为103417476A的中国专利公开的配方，并按公开的方法制备，现由重庆百乐维克动物药业有限公司中试生产，规格为10mL：1g，批号为20120702。

本发明使用的主要实验仪器：XHF-D高速分散器；TD₃低速台式离心机；RE-2000B旋转蒸发器；台式高速冷冻离心机；梅特勒MS105DU型天平；岛津LC-20AD高效液相色谱仪；岛津SPD-M20A紫外可变波长检测器。

本发明的试验动物为约×荣杂交猪(大约克夏公猪与荣昌母猪的杂交一代)。

实施例1、猪组织中孟布酮的残留检测方法的建立

猪组织中孟布酮的残留检测方法，具体步骤如下：

(1)组织样品前处理：称取经肌注孟布酮注射液之后的猪组织(肌肉、脂肪、肝脏或肾)20g，切碎，置于高速分散器(内切式匀浆机)中，在转速为6000r/min条件下匀浆8min，然后精密称取匀浆组织2.0g，加入乙腈4mL，涡旋混匀，在3000r/min条件下离心10min，取上清液，重复加入乙腈提取2次，合并3次提取的上清液，然后将全部上清液转移至50mL圆底烧瓶中，于60℃真空旋转蒸发至干，冷至室温(18-25℃)后，残渣用2.0mL流动相超声溶解后转移至离心管中，并于10000r/min条件下离心10min，离心后的上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液即为供试品溶液；

(2)制备对照品溶液：精密称取孟布酮对照品10mg，用乙腈溶解并定容至100mL，摇匀，精密量取5.0mL，用流动相稀释至50mL，摇匀，作为对照品溶液；制得的对照品溶液浓度为10μg/mL；

(3)采用高效液相色谱法检查：步骤(1)制得供试品溶液和步骤(2)制得对照品溶液各取20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，得猪组织中孟布酮的残留量；高效液相色谱法的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈与0.5％(w/v)的磷酸溶液按体积比55：45组成的混合液为流动相，检测波长为235nm，理论塔板数以孟布酮峰计算不低于2000，孟布酮峰与相邻杂质峰的分离度大于1.5。

实施例2、组织样品前处理方法的验证

(1)匀浆转速

分别称取经肌注孟布酮注射液之后猪的肌肉(非注射部位和注射部位)、脂肪、肝脏、肾脏各5份，每份约20.0g，分别在2800，4000，5000，6000，7000r/min条件下匀浆8min，之后按照实施例1的方法操作，每种组织称取供试样品2份，每份连续进样2次分析，对照品溶液连续进5次，按外标法计算不同匀浆转速下的孟布酮平均含量，并计算相邻转速之间孟布酮平均含量的相对偏差，结果见表1～5。

表1、不同匀浆转速对脂肪组织中孟布酮含量测定的影响

匀浆转速(r/min)	2800	4000	5000	6000	7000
						孟布酮平均含量(μg/g)	0.049	0.061	0.071	0.070	0.070
相对偏差(％)	--	10.91	7.58	0.71	0.00

表2、不同匀浆转速对非注射部位肌肉组织中孟布酮含量测定的影响

匀浆转速(r/min)	2800	4000	5000	6000	7000
						孟布酮平均含量(μg/g)	0.050	0.063	0.072	0.071	0.073
相对偏差(％)	--	11.50	6.67	0.70	1.39

表3、不同匀浆转速对注射部位肌肉中孟布酮含量测定的影响

匀浆转速(r/min)	2800	4000	5000	6000	7000
						孟布酮平均含量(μg/g)	0.127	0.142	0.160	0.158	0.156

相对偏差(％)

--

5.57

5.96

0.63

0.64

表4、不同匀浆转速对肝脏组织中孟布酮含量测定的影响

匀浆转速(r/min)	2800	4000	5000	6000	7000
						孟布酮平均含量(μg/g)	0.102	0.118	0.135	0.134	0.135
相对偏差(％)	--	7.27	6.72	0.37	0.37

表5、不同匀浆转速对肾脏组织中孟布酮含量测定的影响

匀浆转速(r/min)	2800	4000	5000	6000	7000
						孟布酮平均含量(μg/g)	0.141	0.160	0.178	0.177	0.180
相对偏差(％)	--	6.31	5.33	0.28	0.84

结果显示，各种组织在匀浆转速为5000r/min，6000r/min和7000r/min时，相邻转速间的孟布酮平均含量的相对偏差均小于5.0％，且高于2800r/min和4000r/min的孟布酮平均含量，符合要求。因此选择6000r/min用于样品前处理的匀浆，在该转速下经8min匀浆后足以保证各种组织匀浆均匀。

(2)匀浆时间

分别称取经肌注孟布酮注射液之后猪的肌肉(非注射部位和注射部位)、脂肪、肝脏、肾脏各5份，每份20.0g，匀浆机转速设定为6000r/min，分别匀浆3min，5min，7min，8min，9min，之后按照实施例1的方法操作，每个组织称取供试样品2份，每份进样2次，对照品溶液连续进5次，按外标法计算不同匀浆时间的孟布酮含量，并计算相邻匀浆时间之间孟布酮含量的相对偏差，结果见表6～10。

表6、不同匀浆时间对脂肪组织中孟布酮含量测定的影响

匀浆时间(min)	3	5	7	8	9
						孟布酮平均含量(μg/g)	0.057	0.066	0.074	0.074	0.073
相对偏差(％)	--	7.32	5.71	0.00	0.68

表7、不同匀浆时间对非注射部位肌肉中孟布酮含量测定的影响

匀浆时间(min)	3	5	7	8	9
						孟布酮平均含量(μg/g)	0.050	0.064	0.071	0.071	0.070
相对偏差(％)	--	12.28	5.18	0.00	0.71

表8、不同匀浆时间对注射部位肌肉中孟布酮含量测定的影响

匀浆时间(min)	3	5	7	8	9
						孟布酮平均含量(μg/g)	0.099	0.120	0.134	0.136	0.135
相对偏差(％)	--	9.59	5.51	0.74	0.37

表9、不同匀浆时间对肝脏组织中孟布酮含量测定的影响

匀浆时间(min)	3	5	7	8	9
						孟布酮平均含量(μg/g)	0.083	0.095	0.109	0.108	0.109
相对偏差(％)	--	6.74	6.86	0.46	0.46

表10、不同匀浆时间对肾脏组织中孟布酮含量测定的影响

匀浆时间(min)	3	5	7	8	9
						孟布酮平均含量(μg/g)	0.114	0.132	0.151	0.148	0.152
相对偏差(％)	--	7.32	6.71	1.00	1.33

结果显示，各种组织在匀浆时间为7min，8min和9min时，相邻匀浆时间的孟布酮含量的相对偏差均小于5.0％，且高于匀浆3min和5min的孟布酮含量，符合要求。因此样品前处理中选择匀浆时间为8min，在6000r/min条件下匀浆足以保证各种组织匀浆均匀。

(3)提取次数

分别称取经肌注孟布酮注射液之后猪的肌肉(非注射部位和注射部位)、脂肪、肝脏、肾脏，每份20g，在6000r/min条件下匀浆8min后，准确称取匀浆组织各4份，每份2.0g，然后加入乙腈4.0mL，涡旋混匀，离心(3000r/min)10min，取上清液。各种组织按照相同的方法分别用乙腈提取孟布酮1次、2次、3次、4次，之后按照实施例1的方法检测。每个组织称取供试样品2份，每份进样2次，孟布酮对照品溶液连续进样5次，记录色谱图，按外标法计算各组织提取孟布酮1次、2次、3次、4次后的孟布酮含量，并计算相邻提取次数之间孟布酮含量的相对偏差，结果见表11～15。

表11、不同提取次数对脂肪组织中孟布酮含量测定的影响

提取次数(/次)	1	2	3	4
					孟布酮平均含量(μg/g)	0.050	0.059	0.063	0.064
相对偏差(％)	--	8.26	3.28	0.79

表12、不同提取次数对非注射部位肌肉中孟布酮含量测定的影响

提取次数(/次)	1	2	3	4
					孟布酮平均含量(μg/g)	0.058	0.068	0.073	0.075
相对偏差(％)	--	7.94	3.55	1.35

表13、不同提取次数对注射部位肌肉中孟布酮含量测定的影响

提取次数(/次)	1	2	3	4
					孟布酮平均含量(μg/g)	0.101	0.127	0.138	0.138
相对偏差(％)	--	7.02	4.15	0.00

表14、不同提取次数对肝脏组织中孟布酮含量测定的影响

提取次数(/次)	1	2	3	4
					孟布酮含量(μg/g)	0.084	0.096	0.104	0.103
相对偏差(％)	--	6.67	4.00	0.48

表15、不同提取次数对肾脏组织中孟布酮含量测定的影响

提取次数(/次)	1	2	3	4
					孟布酮含量(μg/g)	0.112	0.124	0.132	0.136
相对偏差(％)	--	5.08	3.13	1.49

结果显示，各种组织提取次数为2次、3次和4次时，相邻提取次数间的孟布酮含量的相对偏差均小于5.0％，提取3次或4次高于提取1次和提取2次的孟布酮含量，符合要求。故在提取样品时只需提取3次，足以保证各种组织中的孟布酮几乎完全被提取。

(4)、过滤与未过滤

按实施例1中组织样品前处理方法制备组织供试液，每种组织过滤和未过滤的供试液各制备2份，每份连续进样2次，孟布酮对照品溶液连续进样5次，记录色谱图。按外标法计算过滤与未过滤的孟布酮含量，并计算两者之间的相对偏差，结果见表16～20。

表16、前处理中过滤与未过滤对脂肪组织中孟布酮含量测定的影响

表17、前处理中过滤与未过滤对非注射部位肌肉中孟布酮含量测定的影响

表18、前处理中过滤与未过滤对注射部位肌肉中孟布酮含量测定的影响

表19、前处理中过滤与未过滤对肝脏组织中孟布酮含量测定的影响

表20、前处理中过滤与未过滤对肾脏组织中孟布酮含量测定的影响

各种组织样品前处理后过滤和未过滤的供试液中孟布酮含量的相对偏差均小于5.0％，符合要求。因此经过滤后，供试液中孟布酮含量几乎没有变化。

实施例3、孟布酮的残留检测的验证

按照农业部文件《兽药残留试验技术规范(试行)》的要求进行验证。

具体色谱条件如下：色谱柱为Shim-pack VP-ODS C₁₈柱(4.6×250mm，5μm)，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈与0.5％磷酸(体积比为55:45)；柱温为25℃；检测波长为235nm；流速为1.0mL/min；进样体积为20μL；理论塔板数以孟布酮峰计算不低于2000，孟布酮峰与相邻杂质峰的分离度大于1.5。

验证方法：精密称取孟布酮对照品10mg，用乙腈溶解并定容至100mL，摇匀，精密量取5.0mL，用流动相稀释至50mL，摇匀，作为对照品溶液；未肌注或未内服孟布酮的猪肌肉、脂肪、肝脏和肾脏20.0g，按实施例1中组织样品前处理操作，得空白组织溶液；取未肌注或未内服孟布酮的猪肌肉、脂肪、肝脏和肾脏20.0g，匀浆均匀后，取组织2.0g，精密称定，添加2.0mL孟布酮对照品溶液，之后按照实施例1中组织样品前处理操作，得空白组织添加溶液；然后精密量取对照品溶液、空白组织溶液和空白组织添加溶液各20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得孟布酮的含量。

(1)系统适用性

按照孟布酮的残留检测方法制备对照品溶液，以流动相作为空白溶液。精密量取流动相和对照品溶液各20μL注入液相色谱仪，记录色谱图。对照品溶液连续进样6次，计算主峰面积的相对标准偏差(RSD)，结果见图1和表21。

表21、对照品溶液重复进样6次的结果

色谱图编号	1	2	3	4	5	6	RSD(％)
								主峰面积	1350655	1353737	1352932	1352635	1353720	1353193	0.084

结果显示，在该色谱系统条件下，空白溶液对孟布酮主峰没有干扰；对照品溶液经连续6次进样后，色谱图中孟布酮主峰峰面积的RSD为0.084％，故该色谱条件下系统适用性良好，可用于猪组织中孟布酮残留量的测定。

(2)专属性

按照孟布酮的残留检测方法制备对照品溶液和空白组织添加溶液。分别称取未肌注或未内服孟布酮的肌肉、脂肪、肝脏和肾脏4种组织，按实施例1的方法匀浆后取匀浆液2.0g，即为空白组织溶液；再分别精密称取未肌注或未内服孟布酮的肌肉、脂肪、肝脏和肾脏4种组织，按实施例1的方法匀浆后取匀浆液2.0g，然后准确量取对照品溶液2.0mL加入至匀浆液中，按照实施例1的组织样品前处理方法提取、过滤，得空白组织添加溶液。取流动相、空白组织溶液、对照品溶液、空白组织添加溶液各20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，见图2所示。

结果显示，在该色谱系统条件下，空白溶剂和空白组织溶液均在孟布酮主峰的位置没有干扰峰出现；在各空白组织添加溶液色谱图中孟布酮主峰与相邻峰的分离度良好，符合要求。说明该色谱条件对孟布酮含量测定具有良好的选择性和专属性，可用于猪组织中孟布酮残留量的测定。

(3)定量限

取孟布酮浓度为10.08μg/mL的对照品溶液，加入流动相逐级稀释，当稀释至孟布酮浓度为30.2ng/mL，精密量取该溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图3。结果显示，色谱图中主峰峰高响应值为0.6，噪音峰峰高响应值为0.125，信噪比约为10:1，故孟布酮的残留检测方法的定量限为30.2ng/mL。

(4)检测限

将上述定量限溶液稀释3倍，孟布酮浓度为10.1ng/mL。精密量取该溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图4所示。结果显示，色谱图中主峰峰高响应值为0.19，噪音峰峰高响应值为0.12，信噪比约为3:1，故孟布酮的残留检测方法的检测限为10.1ng/mL。

(5)线性与范围

精密称取孟布酮对照品10mg，用乙腈溶解并定容至100mL容量瓶中，摇匀即得100μg/mL的对照品储备液。精密量取对照品储备液1.0mL于100mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度并摇匀，从中精密量取3.0mL于100mL容量瓶中用流动相稀释至刻度并摇匀，即得1号线性试液；精密量取0.2mL对照品储备液于100mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度并摇匀，即得2号线性试液；精密量取1.0mL对照品储备液于100mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度并摇匀，即得3号线性试液；精密量取2.5mL对照储备液于50mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度并摇匀，即得4号线性试液；精密量取5.0mL对照储备液于50mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度并摇匀，即得5号线性试液；精密量取6.0mL对照储备液于50mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度并摇匀，即得6号线性试液。分别精密量取上述1至6号线性试液各20μL注入液相色谱仪，每种线性试液连续进样3次，记录色谱图，再以孟布酮浓度为横坐标、孟布酮峰面积为纵坐标准曲线，计算线性回归方程，结果见图5和表22。结果显示，回归方程为y＝131005x+1725，r＝0.999999，符合验证要求。

表22、线性试验结果

根据标准曲线还可以得出孟布酮在0.031-12.34μg/mL浓度范围内，其峰面积与其浓度呈现良好的线性关系，可用于猪组织中孟布酮残留量的测定。

(6)精密度

a、重复性

由一名分析人员按照孟布酮的残留检测方法制备猪肌肉、脂肪、肝脏和肾脏4种组织的空白组织添加溶液。精密量取各空白组织添加溶液20μL注入液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图，计算主峰面积的相对标准偏差(RSD)，结果见表23～26。

表23、肌肉组织添加溶液重复性试验结果

进样编号	1	2	3	4	5	6	RSD(％)
								主峰面积	1117103	1118637	1118431	1120374	1121247	1121669	0.16

表24、脂肪组织添加溶液重复性试验结果

进样编号	1	2	3	4	5	6	RSD(％)
								主峰面积	1186992	1188697	1188619	1185248	1188617	1186806	0.12

表25、肝脏组织添加溶液重复性试验结果

进样编号	1	2	3	4	5	6	RSD(％)
								主峰面积	1201176	1200526	1201736	1202808	1201902	1200761	0.07

表26、肾脏组织添加溶液重复性试验结果

进样编号	1	2	3	4	5	6	RSD(％)
								主峰面积	1119432	1121442	1121166	1121552	1121344	1125603	0.18

结果显示，在该色谱条件下，取同一批次样品的4种组织，4种组织中孟布酮含量测定结果的RSD值均小于2.0％，符合要求；表明该色谱条件下重复性良好，可用于猪组织中孟布酮残留量的测定。

b、中间精密度

由两名分析人员分别按照孟布酮的残留检测方法制备猪肌肉、脂肪、肝脏和肾脏4种空白组织添加溶液，并精密量取20μL注入液相色谱仪，连续进样6次，计算主峰面积的RSD，结果见表27～30。

表27、肌肉组织添加溶液中间精密度试验结果

表28、脂肪组织添加溶液中间精密度试验结果

表29、肝脏组织添加溶液中间精密度试验结果

表30、肾脏组织添加溶液中间精密度试验结果

结果显示，在该色谱条件下，4种组织中孟布酮含量测定结果的RSD值均小于2.0％，符合要求。表明该色谱条件下中间精密度良好，可用于猪组织中孟布酮残留量的测定。

(7)准确度

分别取未肌注或未内服孟布酮的猪肌肉、脂肪、肝脏和肾脏4种组织的匀浆各3份，每份2.0g，精密称定，添加适量孟布酮溶液，使得孟布酮在肌肉、脂肪、肝脏和肾脏中的浓度约为0.03μg/g，0.18μg/g，1.8μg/g,9μg/g，11μg/g，每种组织的每一个浓度分别制备3份样品。另外用孟布酮对照品储备液配制浓度约为10μg/mL的对照品溶液。精密量取对照品溶液和每份样品各20μL进行色谱分析，对照品溶液连续进样5次，每份样品连续分析3次，按外标法计算各组织样品的回收率，结果见表31～34。

表31、肌肉组织溶液准确度试验结果

表32、脂肪组织溶液准确度试验结果

表33、肝脏组织溶液准确度试验结果

表34、肾脏组织溶液准确度试验结果

结果显示，4种组织中孟布酮LOQ浓度回收率均在70％～110％之间，其他4种浓度的回收率均在80％～110％之间，均符合要求。说明在该色谱条件下，孟布酮的测定具有良好的准确度，可用于猪组织中孟布酮残留量的测定。

(8)、系统耐用性

a、溶液稳定性

按照孟布酮的残留检测方法制备未肌注或未内服孟布酮的猪肌肉、脂肪、肝脏和肾脏4种组织，匀浆后分别精密称取4种空白组织匀浆2.0g，准确量取2.0mL对照品溶液加入匀浆液中，然后按照组织样品前处理进行操作，将得到的空白组织添加液放置在室温下，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样分析，考察主成分峰面积的变化，结果如表35～38所示。

表35、空白肌肉组织添加溶液稳定性结果

表36、空白脂肪组织添加溶液稳定性结果

表37、空白肝脏组织添加溶液稳定性将结果

表38、空白肾脏组织添加溶液稳定性结果

结果显示，孟布酮主峰峰面积RSD均小于2.0％，符合要求。表明各组织样品经处理后的空白组织添加溶液在室温下24小时内具良好的稳定性，可用于猪组织中孟布酮残留量的测定。

b、改变流速、改变流动相组分比例、更换色谱柱

按照实施例1孟布酮的残留检测方法制备对照品溶液和空白组织添加溶液，精密量取对照品溶液和空白组织添加溶液各20μL注入液相色谱仪，对照品溶液连续进样5次，各空白组织添加溶液连续分析2次，按外标法计算组织中孟布酮的含量。

分别改变色谱条件中流速(0.8～1.2mL/min)、流动相组份比例(57:43、53:47)、同一厂家不同编号同类型的色谱柱进行含量测定。计算在不同条件测得的孟布酮含量的相对标准偏差(RSD)，结果见表39～45。由4种组织中孟布酮含量检测结果可知：在色谱条件进行微小的变化后，不同组织中孟布酮检测结果的RSD均小于2.0％，符合要求，说明该色谱条件具有良好的系统耐用性，在该色谱条件下对孟布酮的含量测定具有适用性、准确性和可靠性，可用于猪组织中孟布酮残留量的测定。

表39、流速1.0mL/min，乙腈-0.5％磷酸(55:45)，色谱柱编号1012633)]试验结果

表40、同一厂家不同编号同类型色谱柱(色谱柱编号1012645)试验结果

表41、降低流速(0.8mL/min)试验结果

表42、升高流速(1.2mL/min)试验结果

表43、降低流动相中乙腈比例(53:47)试验结果

表44、升高流动相中乙腈比例(57:43)试验结果

表45、不同条件下孟布酮含量测定结果比较

实施例4、孟布酮残留检测方法的应用

采用本发明的猪组织中孟布酮的残留检测方法，给约×荣杂交猪臀部肌内注射孟布酮注射液，按临床推荐剂量10mg/kg体重，每日1次，连续肌注7d，每次左右轮换注射部位，在停药后0d(最后一次给药后8～12小时内)、1d、3d、5d、7d、10d、13d、16d、20d分组宰杀试验猪，采集肌肉【非注射部即腿部肌肉；注射部位肌肉：皮肤去毛后，以注射点为中心，划10cm×10cm正方形，采取10×10×6cm(深)的肌肉)300-500g、脂肪(腹脂)200g、肝脏(取一整叶)400-500g、肾脏(双肾纵切各取1/2)】，所采样本不进行任何洗涤或处理，随即对各器官或组织分别包装、贴签、编号，-20℃保存。所采样本经自然解冻后，按照孟布酮的残留检测方法进行样品前处理，色谱柱为Shim-pack VP-ODS C₁₈柱(4.6×250mm，5μm)，流动相为乙腈-0.5％磷酸(体积比为55:45)，柱温为25℃，检测波长为235nm，流速为1.0mL/min，进样体积为20μL，测定猪组织中孟布酮的残留量。停药后0d、1d、3d的残留检测结果，见表46。

表46、猪组织中孟布酮的残留检测结果(mg/kg)

	脂肪组织	非注射部位肌肉	注射部位肌肉	肝脏组织	肾脏组织
						停药0天	0.36	0.30	0.73	0.40	0.52
停药1天	0.05	0.07	0.59	0.07	0.08
						停药3天	0.04	0.03	0.08	0.03	0.04

结果表明，在停药1～3天内，猪组织中孟布酮的残留逐渐降低，表明本发明的方法检测孟布酮的残留可行。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.检测猪组织中孟布酮残留的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)组织样品前处理：称取经肌注孟布酮注射液之后的猪组织，切碎后，在转速为2800～7000r/min条件下匀浆3～9min，然后精密称取匀浆组织，并按匀浆组织与乙腈的重量体积比为1:2加入乙腈，涡旋混匀后离心收集上清液，沉淀用乙腈重复提取0～3次，合并上清液，并将上清液于温度为60℃的真空下旋转蒸发至干，冷至18～25℃后，向残渣中加入流动相超声溶解，流动相加入量按匀浆组织与流动相的重量体积比为1:1；然后离心，上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液即为供试品溶液；

(2)制备对照品溶液：精密称定孟布酮对照品，用乙腈溶解后用流动相稀释制成浓度为10±1μg/mL，制得对照品溶液；

(3)采用高效液相色谱法检查：将步骤(1)制得供试品溶液和步骤(2)制得对照品溶液各取20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，得猪组织中孟布酮的残留量；所用高效液相色谱法的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈与0.5％(w/v)的磷酸溶液按体积比53～57：47～43组成的混合液为流动相，检测波长为235～240nm，理论塔板数以孟布酮峰计算不低于2000，孟布酮峰与相邻杂质峰的分离度大于1.5。

2.根据权利要求1所述检测猪组织中孟布酮残留的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述匀浆是在转速为5000～7000r/min条件下匀浆7～9min。

3.根据权利要求2所述检测猪组织中孟布酮残留的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述匀浆是在转速为6000r/min条件下匀浆8min。

4.根据权利要求1所述检测猪组织中孟布酮残留的方法，其特征在于：步骤(1)中，沉淀用乙腈重复提取2～3次。

5.根据权利要求1所述检测猪组织中孟布酮残留的方法，其特征在于：步骤(1)中，乙腈提取中所述离心在3000r/min条件下离心10min。

6.根据权利要求1所述检测猪组织中孟布酮残留的方法，其特征在于：步骤(1)中，样品溶解后所述离心是在10000r/min条件下离心10min。

7.根据权利要求1所述检测猪组织中孟布酮残留的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述流动相为乙腈与质量百分比0.5％的磷酸溶液按体积比55:45组成的混合液。

8.根据权利要求1所述检测猪组织中孟布酮残留的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述检测波长为235nm。

9.根据权利要求1所述检测猪组织中孟布酮残留的方法，其特征在于：步骤(3)中，流动相流速为0.8～1.2mL/min，色谱柱柱温为20～30℃。

10.根据权利要求9所述检测猪组织中孟布酮残留的方法，其特征在于：步骤(3)中，流动相流速为1.0mL/min，色谱柱柱温为25℃。