CN101135677A - 一种红曲及其制剂的含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
一种红曲及其制剂的含量测定方法，该方法可以准确测定红曲及其制剂中洛伐他汀及总洛伐他汀的含量，所说的总洛伐他汀是内酯式与羟酸式两种分子构型洛伐他汀之和；该方法以洛伐他汀为对照品，通过检验样品的两种不同处理方法准确测定样品中洛伐他汀的含量，这样可以准确得到红曲中酸式洛伐他汀和总洛伐他汀的量；本方法采用快速、准确、灵敏的高效液相色谱法进行含量测定，能准确反映用药的准确性，有效控制药用红曲及其制剂的质量，从而确保了药品的安全性、有效性、可靠性，具有实际意义。
Description
技术领域
本发明涉及中药技术质量控制领域，特别涉及红曲及其制剂中洛伐他汀的含量测定方法。
背景技术
红曲是一味传统中药，在我国广泛应用，已有上千年的历史，1979年日本学者远藤章首次从红曲中分离出具有抑制HMG-CoA还原酶活性的物质，命名为Monacolin K，即洛伐他汀。研究表明，洛伐他汀可以明显调节血脂。此后，美国和日本的科学家进行了大量研究，并于1987年由美国默东沙公司推出调血脂药物美降之即洛伐他汀，之后增加治疗动脉粥样硬化的适应症。由于该产品安全、有效，故临床应用非常广泛。
洛伐他汀有两种分子构型，即内酯式洛伐他汀和β-羟酸式洛伐他汀。内酯式洛伐他汀是没有生物活性的前体药物，服用后在体内经水解为开环的β-羟酸即洛伐他汀酸才具有活性。这两种结构可互相转化，内酯结构得到一分子水，即水解成β-羟酸结构，相反，β-羟酸结构脱去一分子水，即转化为内酯结构。见下图。
经研究证实，中药红曲或功能红曲是以大米为基质，由红曲霉固态发酵而成。羟酸式洛伐他汀为红曲霉的最终代谢产物，内酯式洛伐他汀是在红曲的后处理过程中因分子脱水产生的。一般情况下，红曲中两种分子构型的洛伐他汀均存在，而两种洛伐他汀分子构型的比例，能够反映红曲后处理过程的条件剧烈程度。尽管羟酸式洛伐他汀为实际洛伐他汀的活性分子，然而目前所有的以红曲为原料的国家药品标准：血脂康胶囊和脂必妥片、红曲法定药材标准、国家保健品标准技术规范等，均仅测定内酯式洛伐他汀。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提出一种红曲及其制剂的含量测定方法，该方法可以准确测定红曲及其制剂中洛伐他汀及总洛伐他汀的含量，所说的总洛伐他汀是内酯式与羟酸式两种分子构型洛伐他汀之和。该方法以洛伐他汀为对照品，通过检验样品的两种不同处理方法准确测定样品中洛伐他汀的含量，这样可以准确得到红曲中酸式洛伐他汀和总洛伐他汀的量。本方法采用快速、准确、灵敏的高效液相色谱法进行含量测定，能准确反映用药的准确性，有效控制药用红曲及其制剂的质量，从而确保了药品的安全性、有效性、可靠性，具有实际意义。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现：
一种红曲及其制剂的含量测定方法，所述的红曲制剂是原料中含有红曲的口服制剂，如片剂、胶囊、分散片、丸剂、颗粒剂、软胶囊等，该测定方法的特征在于用高效液相色谱法测定所述药物中洛伐他汀C24H36O5的含量及以洛伐他汀计的总洛伐他汀含量，具体采用中国药典2005年版一部附录VID记载的高效液相色谱法测定红曲及其制剂中洛伐他汀的含量，包括以下步骤：
A、色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；按体积比为乙腈∶甲醇∶0.1％磷酸溶液＝55-65∶0-10∶30-40为流动相；检测波长为238±2nm。
B、对照品溶液的制备：称取经五氧化二磷干燥的洛伐他汀对照品5-150mg，置10-100ml量瓶中，加入甲醇或乙醇中的任一种使溶解并稀释至刻度，摇匀；量1ml置25ml量瓶中，加75％甲醇或75％乙醇或流动相稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中含5-500微克溶液；
C、供试品溶液的制备
①测定总洛伐他汀含量：取红曲或其制剂，称定，研细，混匀，取约含2-10mg洛伐他汀的粉末，称定。置25-100ml容量瓶中，按体积比为丙酮：0.1％磷酸溶液＝7-9∶1-3比例加入至容量瓶体积约2/3处，在120W、40kHz强度条件下超声处理40分钟，取出放冷至室温，加同体积比例丙酮-0.1％磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液5-20ml；或置于具塞三角瓶内，加入体积比为8∶2丙酮-0.1％磷酸溶液10-50ml，在120W、40kHz条件下超声处理40分钟，取出，放冷至室温，用体积比为8∶2丙酮-0.1％磷酸溶液补足减失重量，摇匀，置具塞离心管中在每分钟3000转条件下离心5分钟，取上清液5-20ml。用体积比为3∶1二氯甲烷：乙酸乙酯混合液振摇萃取3次，第一次5-10ml、第二次1-6ml、第三次1-6ml，合并下层萃取液，用体积比为体积比为二氯甲烷∶乙酸乙酯＝3∶1的混合液定容，移入具塞三角瓶中，加无水硫酸钠3-10g，振摇15分钟，静置1-30分钟，滤过，量取滤液10ml于蒸发皿中，置沸水上，蒸干，蒸干后，保持10-30分钟得转化残渣；或采用量取上清液2ml，置15ml试管内，真空抽干溶剂，真空管管口直接接在试管口上，并置于95℃水浴真空干燥20分钟得转化残渣。转化残渣，冷却，用75％甲醇或75％乙醇或流动相溶解，于10ml量瓶中，用相同溶剂定容，定容前，可以采用振摇或在120W、40kHz条件下超声强化处理5分钟，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
②测定洛伐他汀含量：取红曲或其制剂，称定，研细，混匀，取约含2-10mg洛伐他汀的粉末，称定，置具塞锥形瓶内，加75％甲醇或75％乙醇10-40ml，称定重量，密塞，在120W、40kHz条件下超声处理30-50分钟，取出，放冷，用相同溶剂补足减失重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
D、含量测定方法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各5-20μl，注入液相色谱仪，测定洛伐他汀的含量。
较优化的测定方案包括下列测定步骤：
A、色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；体积比为60∶5∶35乙腈一甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相；检测波长为238nm。
B、对照品溶液的制备称取经五氧化二磷干燥48小时的洛伐他汀对照品62.5mg，置50ml量瓶中，加入乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀；量1ml置25ml量瓶中，加75％乙醇释至刻度，摇匀，制成每1ml中含50微克的溶液；
C、供试品溶液的制备
①测定总洛伐他汀含量：红曲或其制剂，称定，研细，混匀，取约含6mg洛伐他汀的粉末，称定，置50ml容量瓶中，加入体积比为8∶2丙酮-0.1％磷酸溶液30ml，在120W、40kHz条件下超声处理40分钟，取出放冷至室温，加体积比为8∶2丙酮-0.1％磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10ml，用体积比为3∶1的二氯甲烷∶乙酸乙酯混合液组成的萃取剂，振摇萃取3次：第一次7ml、第二次4ml、第三次4ml，合并下层萃取液，用体积比为3∶1的二氯甲烷∶乙酸乙酯混合液组成的萃取剂定容至25ml容量瓶中，移入具塞瓶中，加无水硫酸钠5g，振摇15分钟，静置15分钟，滤过，量取滤液10ml于蒸发皿中，置沸水上，蒸干，蒸干后，保持20分钟，冷却，残渣用75％乙醇溶解，于10ml量瓶中定容，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
②测定洛伐他汀含量：红曲或其制剂，称定，研细，混匀，取约含2.5mg洛伐他汀的粉末，称定，置具塞锥形瓶内，加75％乙醇25ml，称定重量，密塞，在120W、40kHz条件下超声处理40分钟，取出，放冷，用75％乙醇补足减失重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
D、含量测定方法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定洛伐他汀的含量。
本发明所指的红曲是指以谷物包括大米、玉米、小米、小麦、大麦、山药等为基质由红曲霉固态发酵而成。该类红曲的特征是含有洛伐他汀，包括羟酸式分子与内酯式分子构型洛伐他汀其中一种，或两种的组合物。大量研究已证实，羟酸式洛伐他汀为红曲霉的最终代谢产物，而内酯式洛伐他汀是羟酸式洛伐他汀分子脱水而成，鉴于后处理加工方式的不同，红曲中含有的洛伐他汀的分子构型可以是酸式结构，可以是内酯式结构，可以是两者的混合物。
本发明所指的含有红曲的制剂是指制备原料中含有红曲的口服制剂，可以是单方，可以是复方；可以药材直接作制剂，亦可通过提取或半提取方式；剂型包括片剂、分散片、胶囊、软胶囊、颗粒剂、丸剂等。在测定过程中，取样应该按照现行《中国药典》的规定进行，有包衣的制剂应去除包衣、胶囊与软胶囊应取内容物。口服制剂不仅限于药品，亦包括保健品、健康食品等。
本发明所提出的总洛伐他汀含量测定方法主要包括提取、萃取、转化等几个步骤，采用中药检测中样品的常规提取方法如超声处理、回流提取、浸泡等，其主要目的是将拟检测的成分从样品中尽可能完全地提取出来，所采用的溶剂可以是常规的乙醇、甲醇、丙酮等能溶解洛伐他汀的溶剂，也可采用改变了酸碱度的水如：0.1％磷酸溶液、0.1N氢氧化钠溶液；或用水与有机溶剂的混合溶液，如75％乙醇、65％丙酮的0.1％磷酸溶液等。由于提取的目的是最大限度将检测物质提取出来，提取液中会存在大量杂质，尽管提取液可以直接进行分析，但影响分析系统的稳定性及分析数据的重现性，因此，需要进一步纯化，由于洛伐他汀为有机分子，更易溶解到比提取溶剂极性更弱的有机溶剂中，因此，萃取溶剂采用二氯甲烷、乙酸乙酯、醋酸丁酯、三氯甲烷、四氯甲烷、苯等，也可采用几种溶剂的混合物。样品的进一步处理主要是将开环分子结构的洛伐他汀转变内酯分子结构的洛伐他汀分子，而该过程为脱水过程，为减少转化过程因高温引起的损失：如降解、氧化等，在样品的进一步处理中应采取尽可能的脱出自由水、减少样品与高温的接触时间等措施，因此首先可将萃取液中的游离水分去除，可采用常规的吸附方式如加无水硫酸钠或其它吸附剂的方式，再采用静止、离心、过滤等方式进行固液分离，净化的萃取液，蒸发溶剂，在一定条件下进行洛伐他汀的脱水转化，转化的过程不宜超过100 ℃，不然，洛伐他汀分子降解加剧。可采用水浴直接蒸干-保温方式，如：量取一定量萃取液于蒸发皿中，置沸水上，蒸干，蒸干后，保持10--30分钟；也可采用真空蒸干保温转化的方式，如：精密量取萃取液2ml，置15ml试管内，真空抽干溶剂，真空管管口直接接在试管口上，并置于95℃水浴真空干燥20分钟。转化样品需要用溶剂进行溶解，溶解过程可采用振荡、超声、加热等手段进行强化，减少溶解时间。所得样品可进行分析测定。
本发明的优点在于可以准确的测定样品中酸式洛伐他汀的含量：总洛伐他汀减去内酯式洛伐他汀量，为红曲制剂质量的有效控制、临床用药有效、安全提供可靠手段。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明，但本发明不受此局限：
实施例1：红曲中洛伐他汀含量方法的验证
红曲及其制剂中洛伐他汀的检测方法已有大量研究报道，而且已列入国家标准包括药品和保健品中，方法成熟，但采用转化的方式测总洛伐他汀，研究尚不多，而且方法的可靠性与具体转化方式有关，为了确保本发明含量测定方法科学、合理、可行，发明人以红曲为例进行了试验研究，结果表明该方法稳定、精确、可靠。实验步骤如下：
1、色谱条件与系统适用性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，体积比为60∶5∶35乙腈∶甲醇∶0.1％磷酸溶液为流动相，检测波长为238nm。进行试验其结果见表1，表明供试品及对照品的理论塔板数均大于2000，供试品洛伐他汀峰与前后锋的分离度、拖尾因子均能满足《中国药典》2005年版一部附录VID高效液相色谱法项下规定，将理论塔板数规定为：按洛伐他汀峰计算应不低于2000。
表1红曲原料含量测定系统适用性试验结果
| 保留时间(min) | 峰高(mv) | 峰面积(mv·sec) | 理论塔板数 | 拖尾因子 | 分离度 | |
| 对照品 | 15.06 | 43.08 | 4323.99 | 37309.18 | 1.01 | 0.00 |
| 供试品 | 14.98 | 44.19 | 4310.57 | 38433.29 | 1.00 | 1.63、2.01 |
2、供试品溶液的制备方法研究
2.1提取溶剂
洛伐他汀在丙酮中极易溶解，选取表2中所列溶剂进行试验，对同一批红曲药材，研成粉末，取约含6mg洛伐他汀的红曲粉末11份，称定，分别加入50ml量瓶中，分别按表2的溶剂加入至量瓶约2/3处，用在120W、40kHz条件下超声处理40分钟，取出冷却至室温，用相同溶剂定容，取10ml，真空干燥，蒸干溶剂后，置沸水浴保持20分钟，冷却，残渣用75％乙醇溶解，于10ml量瓶中定容，进行测定，计算出红曲药材中洛伐他汀含量，重复试验，结果见表2。用体积比为8∶2丙酮-0.1％磷酸作提取溶剂，可有效地将两种分子构型的洛伐他汀从红曲中溶出。此外，在后续萃取操作中，丙酮作溶剂比乙醇更容易分层，有利于操作。
表2提取对比试验结果
| 溶剂 | 含量(mg/g) | |
| 75％乙醇 | 5.37 | |
| 丙酮-0.1％磷酸体积比 | 5∶5 | 5.65 |
| 6∶4 | 5.05 | |
| 7∶3 | 5.07 | |
| 7.5∶2.5 | 5.53 | |
| 8∶2 | 6.00 | |
| 8.5∶1.5 | 5.70 | |
| 9∶1 | 4.95 | |
| 9.5∶0.5 | 4.49 | |
| 9.8∶0.2 | 4.12 | |
| 9.9∶0.1 | 3.88 |
2.2萃取溶剂
由于洛伐他汀在红曲中的含量较低，一般小于5％，提取液中会含有许多杂质，通过萃取可以去除红曲提取液中大量的杂质如：水分、色素以及较多的水溶性成分，有利于后续酸式洛伐他汀的转化。为使萃取更加完全，对溶剂进行选择，选择的溶剂见表3。对同一批红曲药材，研成粉末，取约含6mg洛伐他汀的红曲粉末10份，称定，分别加入50ml量瓶中，分别量取体积比为8∶2丙酮-0.1％磷酸溶液30ml加入至容量瓶中，用在120W、40kHz条件下超声处理40分钟，取出，冷却至室温，用体积比为8∶2丙酮-0.1％磷酸溶液定容，过滤，各取10ml提取液，分别加入表3中所列的5种溶剂各15ml，每种溶剂进行平行试验，分离萃取液，取10ml萃取液，真空干燥，蒸干溶剂，置沸水浴保持20分钟，冷却，残渣用75％乙醇溶解，于10ml量瓶中定容，进行测定，计算萃取率。结果见表3。
以体积比为3∶1二氯甲烷-乙酯混合液为萃取溶剂，可达到较好的萃取效果。三氯甲烷萃取后分层较快，考虑到其毒性较大，故选用体积比为3∶1二氯甲烷-乙酸乙酯作萃取溶剂。经优化筛选，以体积比为3∶1二氯甲烷-乙酸乙酯组成的萃取剂萃取3次，三次的萃取剂体积为：7ml、4ml、4ml，可达到较好的萃取效果。
表3萃取溶剂对比试验结果
| 萃取溶剂 | 提取率(％) | ||
| 1 | 2 | 平均 | |
| 三氯甲烷 | 97.1 | 96.7 | 95.9 |
| 二氯甲烷 | 74.0 | 73.2 | 73.6 |
| 二氯甲烷-乙酸乙酯＝2∶1 | 86.2 | 85.1 | 85.7 |
| 二氯甲烷-乙酸乙酯＝3∶1 | 97.2 | 96.7 | 97.0 |
| 乙酸乙酯 | 71.2 | 70.5 | 70.9 |
2.3萃取液中水分的影响
萃取时，下层的有机相萃取液会带入少量水分，水分的存在会影响转化。取上述萃取液2份，每份10ml。一份加4g无水硫酸钠脱水，分别于沸水上蒸干，后继续保持20分钟，冷却，残渣用75％乙醇溶解，于10ml量瓶中定容，进行测定。重复试验。结果见表4。
表4萃取液中水分的对测定的影响
| 项目 | 脱水 | 未脱水 | ||
| 1 | 2 | 1 | 2 | |
| 萃取液中洛伐他汀浓度(μg/ml) | 46.7 | 47.0 | 42.6 | 41.6 |
| 平均值(μg/ml) | 46.9 | 42.1 | ||
因此，在转化前应除去萃取液中水分。为避免带入过多水分，萃取时应静置使分层较为充分。经多次考察，静置15分钟可达至较好分层。用无水硫酸钠作为脱水剂，是因为其脱水强度和吸收量都较为适中。25ml萃取液用5g无水硫酸钠脱水，可达到快速，充分的脱水效果。取25ml萃取液加入不同量的无水硫酸钠脱水，之后，取10ml，于沸水上蒸干，后继续保持20分钟，冷却，残渣用75％乙醇溶解，于10ml量瓶中定容，进行测定。见表5。脱水剂的用量对结果没有明显影响。
表5脱水剂的用量
| 脱水剂用量 | 1g | 5g | 10g | |||
| 1 | 2 | 1 | 2 | 1 | 2 | |
| 取液中洛伐他汀浓度(μg/ml) | 47.2 | 47.1 | 47.6 | 47.5 | 47.4 | 47.3 |
| 均值(μg/ml) | 47.2 | 47.6 | 47.4 | |||
2.4干燥方式的选择
由于洛伐他汀由羟酸式分子构型转化成内酯式分子构型为脱水过程，脱水条件对最终测定结果影响较大，因此，本研究采用多种脱水干燥条件见表6，以确定最佳方式。试验中最终采用了沸水浴干燥。试验采用上述脱水萃取液各10ml，选择不同的干燥方式，处理最终样品，测定含量。结果见表6。
表6不同干燥方式对测定结果的影响
| 干燥方式 | 萃取液中洛伐他汀浓度(μg/ml) | ||
| 1 | 2 | 平均 | |
| 干燥箱110℃ 20分钟 | 42.6 | 42.3 | 42.5 |
| 沸水浴20分钟 | 48.7 | 49.1 | 48.9 |
| 80 ℃浴20分钟 | 39.2 | 38.7 | 39.0 |
| 真空80℃ 20分钟 | 46.2 | 46.4 | 47.0 |
从上表中可以看出，脱水条件对最终含量测定有较大影响，考虑到方法的可操作性，选择水浴干燥方式。而温度对羟酸式洛伐他汀转化为其内酯式构型影响较大，因此，选择沸水浴20分钟。
2.5保温时间对测定的影响
采用沸水浴保温方式，考察保温时间对测定的影响。试验采用上述脱水萃取液各10ml，沸水浴保温，分别于10min、15min、20min、25min、30min取样测定含量。结果见表7。
表7不同干燥方式对测定结果的影响
| 时间(min) | 萃取液中洛伐他汀浓度(μg/ml) | ||
| 1 | 2 | 平均 | |
| 10 | 44.7 | 44.3 | 44.4 |
| 15 | 47.1 | 47.3 | 47.2 |
| 20 | 48.8 | 48.9 | 48.9 |
| 25 | 48.2 | 48.1 | 48.2 |
| 30 | 47.3 | 47.1 | 47.2 |
从表中可以看出保温20分钟可以使测定值达到最大。因此，选沸水浴保温，20min。
综上结果，供试品溶液的制备方法如下：
取约含6mg洛伐他汀的红曲粉末，称定，置50ml容量瓶中，加入体积比为8∶2的丙酮-0.1％磷酸溶液30ml，在120W、40kHz条件下超声处理40分钟，取出放冷至室温，加体积比为8∶2的丙酮-0.1％磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10ml，用体积比为3∶1二氯甲烷-乙酸乙酯的萃取剂，振摇萃取3次，三次加入萃取剂的量分别为7ml、4ml、4ml，合并萃取液，用体积比为3∶1二氯甲烷-乙酸乙酯的萃取剂定容至25ml容量瓶中，移入具塞瓶中，加无水硫酸钠5g，振摇15分钟，静置15分钟，滤过，量取滤液10ml于蒸发皿中，置沸水上，蒸干，蒸干后，继续保持20分钟，冷却，残渣用75％的乙醇溶解，并定容于10ml的容量瓶中，滤过，去续滤液即得。
3、精密度试验
取相同供试品溶液，依法进行6次含量测定，结果见表8。
表8精密度试验结果
结果表明，以该检测方法测得的含量具有较高的重现性，六次测定结果的相对标准偏差为1.75％，说明该法较为可靠。
4、重复性试验
取同一批红曲原料，按上述试验方法进行6次重复测定，其结果(见表9)表明，重现性较好。
表9红曲原料药材含量测定重复性试验结果
| 试验号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 含量(mg/g) | 3.5567 | 3.4893 | 3.4668 | 3.6019 | 3.5455 | 3.6139 |
| S | 0.05888 | |||||
| RSD(％) | 1.66 | |||||
| 95％的可信限 | (3.5457±0.1358)mg/g | |||||
5洛伐他汀线性考察
制备洛伐他汀对照品溶液10～500μg/ml 6个浓度，按上述色谱条件，各进样测定3次，分别计算平均峰面积，以峰面积为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算出回归方程。试验结果见表10。
表10线性试验数据
| 浓度(μg/ml) | 10.4 | 76.2 | 127 | 254 | 304.8 | 508 |
| 峰面积(mv·s) | 142.42 | 1257.32 | 2173.35 | 4346.70 | 4976.83 | 8529.54 |
| 回归方程 | y＝16.828x+29.808 | |||||
| 相关系数 | r＝0.9997 | |||||
以上结果表明，在进样量20μl时，洛伐他汀浓度在10～500μg/ml的范围内，洛伐他汀峰面积与进样量具有良好的线性关系。
6、回收率试验
取约含3mg相当于洛伐他汀的红曲原料9份，称定，分别置50ml容量瓶中，按表11所列洛伐他汀量加入1mg/ml洛伐他汀对照品溶液，并加入体积比为8∶2丙酮-0.1％磷酸溶液至容量瓶体积约2/3处，在120W、40kHz条件下超声处理40分钟，取出放冷至室温，加体积比为8∶2丙酮-0.1％磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10ml，用振摇萃取3次，每次体积分别为7ml、4ml、4ml，合并萃取液，用体积比为3∶1二氯甲烷-乙酸乙酯组成的萃取剂定容至25ml容量瓶中，移入具塞瓶中，加无水硫酸钠5g，振摇15分钟，静置15分钟，滤过，量取滤液10ml于蒸发皿中，置沸水上，蒸干，蒸干后，继续保持20分钟，冷却，残渣用75％的乙醇溶解，并定容于10ml的容量瓶中，滤过，去续滤液即得。
试验结果如表11表明，所拟订的方法能有效准确的测定出红曲原料中洛伐他汀的含量。
表11红曲原料回收率试验结果
| 试验号 | 供试品洛伐他汀含量(mg) | 洛伐他汀对照品加入量(mg) | 测出洛伐他汀总量(mg) | 回收率(％) | 平均(％) | RSD(％) | 95％可信限(％) |
| 1 | 3.01 | 2.40 | 5.39 | 99.2 | 99.9 | 0.86 | (99.9±1.99) |
| 2 | 3.00 | 2.40 | 5.39 | 99.6 | |||
| 3 | 3.03 | 2.40 | 5.40 | 98.8 | |||
| 4 | 3.12 | 3.00 | 6.10 | 99.3 | |||
| 5 | 3.48 | 3.00 | 6.48 | 100.0 | |||
| 6 | 3.89 | 3.00 | 6.93 | 100.1 | |||
| 7 | 3.08 | 3.60 | 6.72 | 101.1 | |||
| 8 | 3.00 | 3.60 | 6.65 | 101.4 | |||
| 9 | 3.02 | 3.60 | 6.61 | 99.7 |
7、稳定性试验
取同一供试品溶液，按上述色谱条件于0，2，4，8，12，24h进样测定含量，RSD＝1.11％，结果表明本溶液在24h内稳定。所得数据见下表12：
表12稳定性试验结果
| 时间(h) | 0 | 2 | 4 | 8 | 12 | 24 |
| 含量(mg/g) | 3.5681 | 3.5271 | 3.4894 | 3.5231 | 3.5485 | 3.6025 |
| SD | 0.03929 | |||||
| RSD(％) | 1.11 | |||||
| 95％的可信限 | (3.5431±0.1352)mg/g | |||||
以上结果表明，本发明提供的红曲总洛伐他汀的测定方法可靠、准确，适合红曲及其制剂含量测定的要求。
实施例2脂必妥片的测定方法一
取红曲273.0g，粉碎过80目筛，加入微晶纤维素37.45g、微粉硅胶10.50g、硬脂酸17.50g、乳糖10.50g，混匀，制成颗粒，干燥，加入硬酯酸镁1.05g，混匀，压片，得1000片。每片重为0.35g；其含量测定方法包括下列步骤：
A、色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；体积比为60∶5∶35乙腈一甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相；检测波长为238nm。
B、对照品溶液的制备称取经五氧化二磷干燥48小时的洛伐他汀对照品12.5mg，置25ml量瓶中，加入乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀；量1ml置25ml量瓶中，加75％乙醇释至刻度，摇匀，制成每1ml中含20微克的溶液；
C、供试品溶液的制备
①测定总洛伐他汀含量：制剂20片，称定，研细成粉末，混匀，取约含6mg洛伐他汀的粉末，称定，置具塞三角瓶内，加入体积比为8∶2丙酮-0.1％磷酸溶液25ml，在120W、40kHz条件下超声处理40分钟，取出，放冷至室温，用体积比为8∶2丙酮-0.1％磷酸溶液补足减失重量，摇匀，置具塞离心管中在每分钟3000转条件下离心5分钟，量取上清液10ml于分液漏斗，用体积比为3∶1的二氯甲烷∶乙酸乙酯混合液组成的萃取剂，振摇萃取3次：第一次7ml、第二次4ml、第三次4ml，合并下层萃取液，用体积比为3∶1的二氯甲烷∶乙酸乙酯混合液组成的萃取剂定容至25ml容量瓶中，移入具塞瓶中，加无水硫酸钠5g，振摇15分钟，静置15分钟，量取上清液2ml，置15ml试管内，真空抽干溶剂，真空管管口直接接在试管口上，并置于95℃水浴真空干燥20分钟，残渣用75％乙醇洗净溶解，转入10ml量瓶中，在120W、40kHz条件下超声处理5分钟，用75％乙醇定容，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
②测定洛伐他汀含量：制剂20片，称定，研细成粉末，混匀，取约含2.5mg洛伐他汀的粉末，称定，置具塞锥形瓶内，加75％乙醇25ml，称定重量，密塞，在120W、40kHz条件下超声处理40分钟，取出，放冷，用75％乙醇补足减失重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
D、含量测定方法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定洛伐他汀的含量。
本品每片含红曲以洛伐他汀C24H36O5计，不得少于1.7mg。
实施例3脂必妥片的测定方法二
取红曲273.0g，粉碎过80目筛，加入微晶纤维素37.45g、微粉硅胶10.50g、硬脂酸17.50g、乳糖10.50g，混匀，制成颗粒，干燥，加入硬酯酸镁1.05g，混匀，压片，得1000片。片重为0.35g。其含量测定方法包括下列步骤：
A、色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；体积比为60∶5∶35乙腈一甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相；检测波长为238nm。
B、对照品溶液的制备称取经五氧化二磷干燥48小时的洛伐他汀对照品62.5mg，置50ml量瓶中，加入乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀；量1ml置25ml量瓶中，加75％乙醇释至刻度，摇匀，制成每1ml中含50微克的溶液；
C、供试品溶液的制备
①测定总洛伐他汀含量：制剂20片，称定，研细成粉末，混匀，取约含6mg洛伐他汀的粉末，称定，置50ml容量瓶中，加入体积比为8∶2丙酮-0.1％磷酸溶液30ml，在120W、40kHz条件下超声处理40分钟，取出放冷至室温，加体积比为8∶2丙酮-0.1％磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10ml，用体积比为3∶1的二氯甲烷：乙酸乙酯混合液组成的萃取剂，振摇萃取3次：第一次7ml、第二次4ml、第三次4ml，合并下层萃取液，用体积比为3∶1的二氯甲烷∶乙酸乙酯混合液组成的萃取剂定容至25ml容量瓶中，移入具塞瓶中，加无水硫酸钠5g，振摇15分钟，静置15分钟，滤过，量取滤液10ml于蒸发皿中，置沸水上，蒸干，蒸干后，保持20分钟，冷却，残渣用75％乙醇溶解，于10ml量瓶中定容，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
②测定洛伐他汀含量：制剂20片，称定，研细成粉末，混匀，取约含2.5mg洛伐他汀的粉末，称定，置具塞锥形瓶内，加75％乙醇25ml，称定重量，密塞，在120W、40kHz条件下超声处理40分钟，取出，放冷，用75％乙醇补足减失重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
D、含量测定方法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定洛伐他汀的含量。
实施例4红曲胶囊即脂必妥胶囊含量测定方法
取红曲273.0g，粉碎过80目筛，加入辅料，混匀，制成颗粒，干燥，加入1.0g硬酯酸镁，混匀，灌胶囊，得1000粒。其含量测定方法包括下列步骤：
A、色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；体积比为60∶5∶35乙腈一甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相；检测波长为238nm。
B、对照品溶液的制备称取经五氧化二磷干燥48小时的洛伐他汀对照品62.5mg，置50ml量瓶中，加入乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀；量1ml置25ml量瓶中，加75％乙醇释至刻度，摇匀，制成每1ml中含50微克的溶液；
C、供试品溶液的制备
①测定总洛伐他汀含量：制剂10粒，取内容物，称定，研细成粉末，混匀，取约含6mg相当于洛伐他汀的粉末，称定，置50ml容量瓶中，加入体积比为8∶2丙酮-0.1％磷酸溶液30ml，在120W、40kHz条件下超声处理40分钟，取出放冷至室温，加体积比为8∶2丙酮-0.1％磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10ml，用体积比为3∶1的二氯甲烷：乙酸乙酯混合液组成的萃取剂，振摇萃取3次：第一次7ml、第二次4ml、第三次4ml，合并下层萃取液，用体积比为3∶1的二氯甲烷∶乙酸乙酯混合液组成的萃取剂定容至25ml容量瓶中，移入具塞瓶中，加无水硫酸钠5g，振摇15分钟，静置15分钟，滤过，量取滤液10ml于蒸发皿中，置沸水上，蒸干，蒸干后，保持20分钟，冷却，残渣用75％乙醇溶解，于10ml量瓶中定容，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
②测定洛伐他汀含量：制剂10粒，取内容物，称定，研细成粉末，混匀，取约含2.5mg洛伐他汀的样品粉末，称定，置具塞锥形瓶内，加75％乙醇25ml，称定重量，密塞，在120W、40kHz条件下超声处理40分钟，取出，放冷，用75％乙醇补足减失重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
D、含量测定方法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定洛伐他汀的含量。
实施例5红曲提取物胶囊含量测定方法
取红曲，适当粉碎，用70％乙醇提取三次，浓缩提取液至无醇味，上硅胶柱，用水洗脱至洗脱液无色，再依次用90％、80％、70％乙醇洗脱，每次5倍硅胶体积，收集洗脱液，浓缩，干燥，粉碎，加入辅料，混匀，制成颗粒，干燥，加入硬酯酸镁，混匀，灌胶囊，即得红曲提取物胶囊，每粒红曲提取物胶囊中含两种分子构型洛伐他汀之和不少于5mg。其含量测定方法包括下列步骤：
A、色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；体积比为60∶5∶35乙腈一甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相；检测波长为238nm。
B、对照品溶液的制备称取经五氧化二磷干燥48小时的洛伐他汀对照品62.5mg，置50ml量瓶中，加入乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀；量1ml置25ml量瓶中，加75％乙醇释至刻度，摇匀，制成每1ml中含50微克的溶液；
C、供试品溶液的制备
①测定总洛伐他汀含量：制剂10粒，取内容物，称定，研细成粉末，混匀，取含约6mg洛伐他汀的样品粉末，称定，置50ml容量瓶中，加入体积比为8∶2丙酮-0.1％磷酸溶液30ml，在120W、40kHz条件下超声处理40分钟，取出放冷至室温，加体积比为8∶2丙酮-0.1％磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10ml，用体积比为3∶1的二氯甲烷：乙酸乙酯混合液组成的萃取剂，振摇萃取3次：第一次7ml、第二次4ml、第三次4ml，合并下层萃取液，用体积比为3∶1的二氯甲烷：乙酸乙酯混合液组成的萃取剂定容至25ml容量瓶中，移入具塞瓶中，加无水硫酸钠5g，振摇15分钟，静置15分钟，滤过，量取滤液10ml于蒸发皿中，置沸水上，蒸干，蒸干后，保持20分钟，冷却，残渣用75％乙醇溶解，于10ml量瓶中定容，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
②测定洛伐他汀含量：制剂10粒，取内容物，称定，研细呈粉末，混匀，取约含2.5mg洛伐他汀的样品粉末，称定，置具塞锥形瓶内，加75％乙醇25ml，称定重量，密塞，在120W、40kHz条件下超声处理40分钟，取出，放冷，用75％乙醇补足减失重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
D、含量测定方法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定洛伐他汀的含量。
实施例6红曲及其制剂含量测定
取红曲原料A、B，由昆明法莫泰克药物技术公司提供；血脂康胶囊，市售，北大维信生物科技公司出品；脂必妥片，市售，云南永安制药有限公司生产；脂必妥胶囊，西双版纳雨林制药公司生产；红曲提取物胶囊，昆明法莫泰克药物技术公司提供，按实施例1、3、4、5所列方法进行测定：结果如下表13：
表13红曲及其制剂含量测定
| 含量 | 红曲A(mg/g) | 红曲B(mg/g) | 血脂康胶囊mg/粒) | 脂必妥片mg/片) | 脂必妥胶囊(mg/粒) | 红曲提取物胶囊mg/粒) |
| 洛伐他汀 | 6.1 | 12.1 | 4.0 | 1.2 | 1.7 | 5.8 |
| 总洛伐他汀 | 10.8 | 40.2 | 4.1 | 3.1 | 3.5 | 12.5 |
Claims (4)
1.一种红曲及其制剂的含量测定方法，其特征在于用高效液相色谱法测定该药物中洛伐他汀C24H36O5及以洛伐他汀计的总洛伐他汀含量，步骤如下：
A、色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；按体积比为乙腈∶甲醇∶0.1％磷酸溶液＝55-65∶0-10∶30-40为流动相；检测波长为238±2nm；
B、对照品溶液的制备：称取经五氧化二磷干燥的洛伐他汀对照品5-150mg，置10-100ml量瓶中，加入甲醇或乙醇中的任一种使溶解并稀释至刻度，摇匀；量1ml置25ml量瓶中，加75％甲醇或乙醇或流动相稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中含5-500微克溶液；
C、供试品溶液的制备
①测定总洛伐他汀含量：取红曲或其制剂，称定，研细，混匀，取含2-10mg洛伐他汀的粉末，称定，置25--100ml容量瓶中，按体积比为丙酮∶0.1％磷酸溶液＝7-9∶1-3的混合溶液加入至容量瓶体积约2/3处，在120W、40kHz强度条件下超声处理40分钟，取出放冷至室温，加同比例丙酮-0.1％磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液5-20ml；或置具塞三角瓶内，加入体积比为8∶2丙酮-0.1％磷酸溶液10-50ml，在120W、40kHz条件下超声处理40分钟，取出，放冷至室温，用体积比为8∶2丙酮-0.1％磷酸溶液补足减失重量，摇匀，置具塞离心管中在每分钟3000转条件下离心5分钟，取上清液5-20ml，用体积比为二氯甲烷∶乙酸乙酯＝3∶1的混合液振摇萃取3次，第一次5-10ml、第二次1-6ml、第三次1-6ml，合并下层萃取液，用体积比为二氯甲烷∶乙酸乙酯＝3∶1的混合液定容，移入具塞三角瓶中，加无水硫酸钠3-10g，振摇15分钟，静置1-30分钟，滤过，量取滤液10ml于蒸发皿中，置沸水上，蒸干，蒸干后，保持10-30分钟得转化残渣；或量取上清液2ml置于15ml试管内，真空抽干溶剂，真空管管口直接接在试管口上，并置于95℃水浴真空干燥20分钟得转化残渣，转化残渣冷却后用75％甲醇或75％乙醇或流动相溶解，于10ml量瓶中用相同溶剂定容，定容前采用振摇或120W、40kHz超声强化处理5分钟，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得；
②测定洛伐他汀含量：取红曲或其制剂，称定，研细，混匀，取含2-10mg洛伐他汀的粉末，称定，置具塞锥形瓶内，加75％甲醇或75％乙醇10-40ml，称定重量，密塞，120W、40kHz超声处理30-50分钟，取出，放冷，用相同溶剂补足减失重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得；
D、含量测定方法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各5-20μl，注入液相色谱仪，测定洛伐他汀的含量。
2.根据权利要求1所述的红曲及其制剂的含量测定方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
A、色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；按体积比为乙腈∶甲醇∶0.1％磷酸溶液＝60∶5∶35为流动相；检测波长为238nm；
B、对照品溶液的制备称取经五氧化二磷干燥48小时的洛伐他汀对照品62.5mg，置50ml量瓶中，加入乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀；量1ml置25ml量瓶中，加75％乙醇释至刻度，摇匀，制成每1ml中含50微克的溶液；
C、供试品溶液的制备
①测定总洛伐他汀含量：取红曲或其制剂，称定，研细，混匀，取含6mg洛伐他汀的粉末，称定，置50ml容量瓶中，按体积比为丙酮∶0.1％磷酸溶液＝8∶2混合溶剂加入至容量瓶体积约2/3处，在120W、40kHz条件下超声处理40分钟，取出放冷至室温，加同比例丙酮∶0.1％磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10ml，用体积比为二氯甲烷∶乙酸乙酯＝3∶1的混合液组成的萃取剂，振摇萃取3次：第一次7ml、第二次4ml、第三次4ml，合并下层萃取液，用体积比为二氯甲烷∶乙酸乙酯＝3∶1的混合液组成的萃取剂定容至25ml容量瓶中，移入具塞三角瓶中，加无水硫酸钠5g，振摇15分钟，静置15分钟，滤过，量取滤液10ml于蒸发皿中，置沸水上，蒸干，蒸干后，保持20分钟，冷却，残渣用75％乙醇溶解，于10ml量瓶中定容，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得；
②测定洛伐他汀含量：取红曲或其制剂，称定，研细，混匀，取含2.5mg洛伐他汀的粉末，称定，置具塞锥形瓶内，加75％乙醇25ml，称定重量，密塞，在120W、40kHz条件下超声处理40分钟，取出，放冷，用75％乙醇补足减失重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
D、含量测定方法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定洛伐他汀的含量。
3.根据权利要求1所述的红曲及其制剂的含量测定方法，其特征在于所述的红曲制剂是原料中含有红曲的口服片剂、胶囊、分散片、丸剂、颗粒剂、软胶囊。
4.根据权利要求1或3所述的红曲及其制剂的含量测定方法，其特征在于红曲口服片剂是取红曲273.0g，粉碎过80目筛，加入微晶纤维素37.45g、微粉硅胶10.50g、硬脂酸17.50g、乳糖10.50g，混匀，制成颗粒，干燥，加入硬酯酸镁1.05g，混匀，压片，得1000片，每片重为0.35g；
所述红曲口服片剂的含量测定步骤为：
A、色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；体积配比为60∶5∶35乙腈-甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相；检测波长为238nm；
B、对照品溶液的制备：称取经五氧化二磷干燥48小时的洛伐他汀对照品12.5mg，置25ml量瓶中，加入乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀；量1ml置25ml量瓶中，加75％乙醇释至刻度，摇匀，制成每1ml中含20微克的溶液；
C、供试品溶液的制备
①测定总洛伐他汀含量：取制剂20片，称定，研细成粉末，混匀，取含6mg洛伐他汀的粉末，称定，置具塞三角瓶内，加入体积比例为8∶2丙酮-0.1％磷酸溶液25ml，在120W、40kHz条件下超声处理40分钟，取出，放冷至室温，用体积比例为8∶2丙酮-0.1％磷酸溶液补足减失重量，摇匀，置具塞离心管中在每分钟3000转条件下离心5分钟，量取上清液10ml于分液漏斗，用体积比例为3∶1的二氯甲烷∶乙酸乙酯混合液组成的萃取剂，振摇萃取3次：第一次7ml、第二次4ml、第三次4ml，合并下层萃取液，用体积比例为3∶1的二氯甲烷∶乙酸乙酯混合液组成的萃取剂定容至25ml容量瓶中，移入具塞瓶中，加无水硫酸钠5g，振摇15分钟，静置15分钟，量取上清液2ml，置15ml试管内，真空抽干溶剂，真空管管口直接接在试管口上，并置于95℃水浴真空干燥20分钟，残渣用75％乙醇洗净溶解，转入10ml量瓶中，在120W、40kHz条件下超声处理5分钟，用75％乙醇定容，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得；
②测定洛伐他汀含量：取制剂20片，称定，研细成粉末，混匀，取含2.5mg洛伐他汀的粉末，称定，置具塞锥形瓶内，精密加75％乙醇25ml，称定重量，密塞，在120W、40kHz条件下处理40分钟，取出，放冷，用75％乙醇补足减失重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得；
D、含量测定方法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定洛伐他汀的含量；
本品每片含红曲以洛伐他汀C24H36O5计，不得少于1.7mg。
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