CN109991326A - 一种红曲霉素指纹图谱分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种红曲霉素指纹图谱分析方法,包括以下步骤:S1.取红曲药材精密称定质量,利用有机溶液提取,称定重量;S2.提取后进行超声处理,超声处理后静置放冷,并用有机溶液补足步骤S1中称定的重量;S3.取上清液过滤,滤液取样后注入高相液相色谱仪,选择237nm和370nm波长进行检测。本发明提供了一种对红曲霉素的指纹图谱分析方法,可以通过本方法建立统一、可靠的指纹图谱,研究发酵时间的不同对红曲化学成分的影响,从而确定红曲发酵时间,为红曲发酵工艺的参数选取提供可靠的数据实验依据。
Description
技术领域
本发明涉及生物化工技术领域,具体为一种红曲霉素指纹图谱分析方法。
背景技术
红曲是一味传统的中药,最早记载于元朝的《饮膳正要》、《本草从新》、《本草纲目》也都有记载。对于红曲的功效应用及其炮制方法,历朝历代的医学书籍都有颇多的记载。现代人们利用生化技术对它的有效生理活性物质进行深入研究,通过提取、分离、分析,发现红曲中含有多种活性物质,如红曲色素、胆固醇抑制剂、麦角固醇、Y-氨基丁酸等,具有抑菌、降血压、降血糖、抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳、调节血脂平衡等诸多的生理活性。
中药指纹图谱是指某些中药或中药制剂经过适当处理后,采用一定的分析手段,得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图[14]。中药指纹图谱是一种综合的,可量化的鉴定手段,它是建立在中药化学成分系统研究的基础上,主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。“整体性”和“模糊性”为其显著特点。
中药色谱指纹图谱的建立,应体现中药指纹图谱三个特点:系统性、稳定性和特征性。系统性指的是指纹图谱应反应绝大部分中药有效成分或指标性成分;稳定性指的是在规定的条件和方法下,不同的实验环境或不同的实验人员所建立的指纹图谱相同。这是作为标准方法所必备的特征方法之一。特征性,即中药的化学条形码,是指能特征地鉴别中药的真伪和优劣。
发明内容
本发明的目的在于提供一种红曲霉素指纹图谱分析方法,以对红曲的指纹图谱进行研究与建立,为红曲的进一步开发利用提供理论基础。
为实现上述目的,本发明提供如下一种红曲霉素指纹图谱分析方法,包括以下步骤:
S1.取红曲药材精密称定质量,利用有机溶液提取,称定重量;
S2.提取后进行超声处理,超声处理后静置放冷,并用有机溶液补足步骤S1中称定的重量;
S3.取上清液过滤,滤液取样后注入高相液相色谱仪,选择237nm和370nm波长进行检测。
优选的:所述有机溶液为75%体积比的乙醇溶液,步骤S1中红曲质量与提取有机溶液的比例为1克:20毫升。
优选的:所述超声处理步骤中的具体参数为功率250w,频率28KHZ,处理时间1小时。
优选的:所述步骤S3中过滤采用0.45μm微孔滤膜过滤。
优选的:所述步骤S3中高相液相色谱仪中采用乙腈-0.05%磷酸作为流动相。
优选的:所述步骤S3中高相液相色谱仪中采用C18反相柱。
本发明提供了一种对红曲霉素的指纹图谱分析方法,可以通过本方法建立统一、可靠的指纹图谱,研究发酵时间的不同对红曲化学成分的影响,从而确定红曲发酵时间,为红曲发酵工艺的参数选取提供可靠的数据实验依据。
附图说明
图1为本发明具体实施例1中采用乙醇作为提取用有机溶剂在237纳米波长下的HPLC指纹图谱;
图2为本发明具体实施例1中采用甲醇作为提取用有机溶剂在237纳米波长下的HPLC指纹图谱;
图3为本发明具体实施例1中采用丙酮作为提取用有机溶剂在237纳米波长下的HPLC指纹图谱;
图4为本发明具体实施例3中采用环球柱作为反相柱的HPLC指纹图谱;
图5为本发明具体实施例3中采用色谱柱作为反相柱的HPLC指纹图谱;
图1至5中,横坐标均为时间,单位为分钟,纵坐标为检测电压,单位为毫伏。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
具体实施例1.
实验步骤:分别精密称定三份发酵的红曲样品0.5g,各自置于50ml具塞的锥形瓶中,分别采用75%体积比的乙醇、甲醇、丙酮作为有机溶剂提取,精密加入10ml有机溶剂,密塞,称定重量,采用超声处理(功率250w,频率28KHZ)1小时,放冷,再称定重量,用75%乙醇补足减失的重量,冷却,取上清液,用0.45μm微孔滤膜过滤,取续滤液,即得,作为供试品溶液,备用。精密吸取各红曲样品10μl,注入高相液相色谱仪,因为洛伐他汀物质在237nm波长下吸收较强,色素在370nm波长下有较强的吸收,所以选择237nm和370nm波长进行检测(237nm检测洛伐他汀类物质,370nm检测色素类物质),采用批处理,测得采用乙醇、甲醇、丙酮作为有机溶剂在237nm波长下的HPLC( 高性能液体色谱)指纹图谱分别如图1、2、3所示。
通过比较三种提取条件下供试液的HPLC指纹图谱可知,丙酮提取的溶剂峰太大,出的峰较少,提取不完全;乙醇提取和甲醇提取的出峰效果近似,所出的峰都更好更全面,但是甲醇成本高而且有毒,可以优选采用75%乙醇提取。
从图中可见,通过全波段扫描,得出波长在230nm~254nm下对照品的吸收峰较大,对230nm、237nm、254nm波长下分别对对照品进行测定,得出在237nm波长下所测得的峰面积是最大的。因此可以采用237nm作为检测波长。
具体实施例2
本实施例的具体实施方式参照具体实施例1,分别采用乙腈-甲醇和乙腈-0.05wt%磷酸两种系统作为高相液相色谱仪的流动相,以分离度、对称因子、峰数为指标选择图谱制备的最佳流动相,用乙腈-甲醇梯度洗脱时,出峰时间不稳定,分离效果不理想,而乙腈-0.05%磷酸梯度洗脱能使各主要色谱峰达到较好的分离,且基线比较平稳,因此试验确定流动相为乙腈-0.05%磷酸。
具体实施例3.
本实施例的具体实施方式参照具体实施例1,红曲中洛伐他汀类成较多,使用C18反相柱。均取同一红曲样品,在同一高效液相色谱仪上,分别用色谱柱和环球柱两种不同的C18柱,在其他色谱条件不变的情况下进样分析;结果表明:色谱峰、色谱保留时间、分离度等均以色谱柱(LC Column 250*4.6mm)为最好;图4和图5分别给出采用环球柱(GlobalChhromatography 4.6mm*250mm GS-120-5-C18-BIO)和色谱柱(LC Column 250*4.6mm,5μm,由广州菲罗门提供)得到的色谱分析图。
具体实施例4
取红曲药材0.5g,精密称定,置50ml具塞锥形瓶中,精密加入75%乙醇10ml,密塞,称定重量,超声处理(功率250w,频率28KHZ)1小时,放冷,再称定重量,用75%乙醇补足减失的重量,冷却,取上清液,用0.45μm微孔滤膜过滤,取续滤液,即得供试品溶液,备用。所有红曲样品均采用此方法制备。
按以上方法制备样品,进样5次,每次进样10μL,采用中药指纹图谱相似度评价系统2004A版进行处理(五点校正,中位数法),结果见下表3,表的横纵坐标均表示样品S1-S5,交叉处表示两份样品的相似度值,相似度均大于0.9,表明精密度好,符合要求。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (6)
1.一种红曲霉素指纹图谱分析方法,包括以下步骤:
S1.取红曲药材精密称定质量,利用有机溶液提取,称定重量;
S2.提取后进行超声处理,超声处理后静置放冷,并用有机溶液补足步骤S1中称定的重量;
S3.取上清液过滤,滤液取样后注入高相液相色谱仪,选择237nm和370nm波长进行检测。
2.根据权利要求1所述的红曲霉素指纹图谱分析方法,其特征在于:所述有机溶液为75%体积比的乙醇溶液,步骤S1中红曲质量与提取有机溶液的比例为1克:20毫升。
3.根据权利要求1所述的红曲霉素指纹图谱分析方法,其特征在于:所述超声处理步骤中的具体参数为功率250w,频率28KHZ,处理时间1小时。
4.根据权利要求1所述的红曲霉素指纹图谱分析方法,其特征在于:所述步骤S3中过滤采用0.45μm微孔滤膜过滤。
5.根据权利要求1所述的红曲霉素指纹图谱分析方法,其特征在于:所述步骤S3中高相液相色谱仪中采用乙腈-0.05%磷酸作为流动相。
6.根据权利要求1所述的红曲霉素指纹图谱分析方法,其特征在于:所述步骤S3中高相液相色谱仪中采用C18反相柱。
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