CN1808117A - 一种红曲发酵产品中桔霉素含量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种红曲发酵产品中桔霉素含量的检测方法。它包括以下步骤：(一)样品色价测定步骤；(二)试样前处理步骤，包括：(1)样品中桔霉素的提取步骤：试样称取；加入甲醇提取液；混匀超声提取，离心提取；室温下减压浓缩；(2)粗分离所需吸附层析柱的制备步骤：包括以甲醇洗涤后的中性吸附树脂装柱；(3)样品中桔霉素的粗分离步骤；(三)液相色谱条件的确定步骤；(四)色谱分析步骤；(五)标准溶液的配制与标准曲线的制备步骤；(六)结果计算步骤。本发明具有提取溶剂简单、毒性小、桔霉素的稳定性高、样品中的桔霉素提取充分、液相色谱分析的灵敏性高、测定时间短等特点。

Description

一种红曲发酵产品中桔霉素含量的检测方法

技术领域

本发明涉及一种保健食品或食品添加剂中有害物质的检测方法，特别是涉及一种红曲发酵产品中桔霉素含量的检测方法。

背景技术

桔霉素是红曲发酵产品在发酵过程中产生的一种有害物质。由于在红曲产品中含量很低，难以对其进行准确定量分析。目前，高效液相色谱法和薄层层析法是检测桔霉素比较灵敏的方法。但是由于这些检测方法中缺少对样品中桔霉素有效的初步分离，不能有效排除红曲发酵产品中的大量色素等物质的干扰，因此即便是采用这些方法，对于那些桔霉素含量较低的样品，还是不能准确测定样品中存在的桔霉素含量。我国是红曲的故乡，是生产红曲发酵产品的大国。自从发现红曲发酵产品中含有一种能够抑制体内胆固醇合成的天然产物—洛伐他汀以后，很多发达国家想从我国进口红曲发酵产品。但由于国内目前桔霉素定量分析方法存在上述缺陷，并且最低检测限数值较高(50μg/L，见卫生部《保健食品检验与评价技术规范2003年版》)，而这些国家要求产品中桔霉素的最大含量往往低于50μg/L。因此给国内红曲发酵产品的出口带来困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够灵敏检测红曲发酵产品中桔霉素含量的方法。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种红曲发酵产品中桔霉素含量的检测方法，它包括以下步骤：

(一)、样品色价测定步骤；

(二)、试样前处理步骤，包括：

(1)样品中桔霉素的提取步骤：将试样充分混合均匀，准确称取0.1～5.0g，即按色价50相当1g样品量再乘以5计算所称样品重量，放于50mL容量瓶中；按称样量1∶10(W/V)比例加入95％甲醇提取液，混合均匀，超声提取40min，工作频率可以为40KHz，静置澄清，上清液移至圆底烧瓶中平；往沉淀中按大约1∶8(V/V)比例加入95％甲醇，超声提取20min，静置澄清后将上清液合并至圆底烧瓶中；沉淀同前法加入95％甲醇，再超声提取20min，转入离心管中，3500rp/min离心10分钟，将上清液倒入圆底烧瓶中与前两次提取液合并；将圆底烧瓶中所合并的提取液在室温下，温度可以为20-25℃，减压浓缩，将全部浓缩液取至5mL刻度试管中，读取体积备用；

(2)粗分离所需吸附层析柱的制备步骤：

取适量中性吸附树脂以甲醇洗涤3次，再用蒸馏水洗涤3次，装入1×20cm的柱子，柱床高度为10-15cm；用两个柱床体积的蒸馏水清洗平衡后备用；

(3)样品中桔霉素的粗分离步骤：

取1/5-1/2的样品浓缩液，体积一般不要超过1mL，上柱，以70％甲醇洗脱，收集前20mL-25mL洗脱液，混合均匀后以0.45μm孔径微孔滤膜过滤，滤液待进样；

(三)、液相色谱条件的确定步骤中，液相色谱条件为：

      色谱柱：C₁₈柱  4.6×250mm  5μm

      柱温：28℃

      荧光检测器：λex＝331nm，λem＝500nm

      流动相：乙腈∶：水＝50∶50(可以磷酸调pH至2.5)

      流速：1.0mL/min

      进样量：20μl；

(四)、色谱分析步骤，包括：

将处理好的试样提取液20μl进样，经荧光检测器检测得到色谱图后，外标法以标准桔霉素保留时间定性，将试样提取液中色谱峰面积与标准样品色谱峰面积比较定量；

(五)、标准溶液的配制与标准曲线的制备步骤，包括：配制浓度为0.0002、0.001、0.004、0.04、0.1μg/mL桔霉素标准溶液，在下述色谱条件下进样测定，以峰面积对浓度作标准曲线：

    色谱柱：C₁₈柱  4.6×250mm  5μm

    柱温：28℃

    荧光检测器：λex＝331nm，λem＝500nm

    流动相：乙腈∶：水＝50∶50(可以磷酸调pH至2.5)

    流速：1.0mL/min

    进样量：20μl；

(六)、结果计算步骤，所用公式为：

$X=\frac{h_1\×c\×20\×5}{h_2\×m}\×1000$

式中：X-试样中桔霉素含量，μg/Kg

      h₁-试样中桔霉素色谱峰面积

      c-标准桔霉素溶液浓度，μg/mL

      20-洗脱体积，mL

      5-1/5取样倍数

      1000-单位折算倍数(g至Kg)

      h₂-标准桔霉素色谱峰面积

      m-试样称取量，g。

所述的一种红曲发酵产品中桔霉素含量的检测方法，其样品色价测定步骤中司以按照GB4926-85标准测定样品色价水平。

所述的一种红曲发酵产品中桔霉素含量的检测方法，其粗分离所需吸附层析柱的制备步骤中，所使用的中性吸附树脂可以为HPD-100。

所述的一种红曲发酵产品中桔霉素含量的检测方法，其粗分离所需吸附层析柱的制备步骤中，所使用的中性吸附树脂可以为HPD-300。

所述的一种红曲发酵产品中桔霉素含量的检测方法，其粗分离所需吸附层析柱的制备步骤中，所使用的中性吸附树脂可以为HPD-600。

本发明的技术参数可以是：

准确度：方法的回收率100±10％。

允许差：平行样测定相对误差≤±10％。

在本发明中，如果样品色价含量过高，经色价50相当1g样品折算后取样量小于20mg，可按计算量称取该样品，用小于1ml的95％甲醇溶解后直接加至吸附层系柱上洗脱，收集20mL洗脱液测定。

本发明的有益效果为：

1、提取溶剂为95％甲醇，溶剂简单，毒性小，减压浓缩时不用加温，浓缩时间短，且不会影响桔霉素的稳定性，提取浓缩步骤合理，因此前处理阶段样品中的桔霉素损失小。

2、采用超声波振荡提取，能够充分将样品中的桔霉素提取出来。

3、用吸附柱层析对提取后的样品进行粗分离，使进入高效液相色谱仪的样品中杂质大大减少，因而提高了高效液相色谱分析的灵敏性，使最低检测线达到0.0002μg/mL。

4、为了在粗分离的柱层析中能够最大量的将样品中的色素等杂质吸附除去，根据样品中色素含量(色价)来确定吸附层析的上样量即根据样品色价确定取样量。

5、所采用的吸附剂对桔霉素基本上不吸附，因此在前处理阶段桔霉素的回收率在90％以上，而由于高效液相色谱仪本身对桔霉素的损失很小，因此方法回收率可以达到100±10％。

6、采用了简单而分离度良好的色谱条件，只用普通C18柱，流动相：乙腈∶水＝50∶50(可以磷酸调pH至2.5)，桔霉素的保留时间约为16-18min，测定一次的实际所需时间最多需要40-50min。

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

附图说明

图1为桔霉素标准曲线图(0.0002、0.001、0.004、0.04、0.1ug/ml)

图2为桔霉素标准品HPLC色普图

图3为实施例1-XX红曲米中桔霉素含量测定HPLC分离图谱

图4为实施例2-XX红曲色素中桔霉素含量测定HPLC分离图谱

具体实施方式

实施例1 XX红曲米中桔霉素含量测定

1实验材料

1.1样品：由XX生物工程有限公司生产的功能性红曲米，为红色粉末。约100克/袋，共1袋。阴凉避光保存。

1.2主要仪器：电子天平、高效液相色谱仪、分光光度计、酸度计、超声波清洗器、旋转蒸发仪、超纯水制备系统、真空泵、恒温水浴锅、1×20cm层析柱

1.3参考标准物质：桔霉素(标准品，批号：115049034704019，美国Fluka)

1.4试剂：磷酸(分析纯，北京化工厂，批号：20040408)；乙腈(色谱纯，美国Fisher，批号：052064)；甲醇(分析纯，北京化工厂，批号：20051022)；大孔吸附树脂(HPD-300，沧州保恩化工有限公司)；无水乙醇(分析纯，北京化工厂，批号：20050412)

2分析步骤

2.1样品色价测定：按照GB 4926-85测定样品色价水平。

2.2试样前处理

将试样充分混合均匀，准确称取3.5g放于50mL容量瓶中。按称样量1∶10(W/V)比例加入95％甲醇提取液，混合均匀，超声提取40min(工作频率40KHz)，静置澄清，上清液移至圆底烧瓶中。往沉淀中按1∶8(V/V)比例加入95％甲醇，超声提取20min，静置澄清后将上清液合并至圆底烧瓶中。沉淀同前法加入95％甲醇，再超声提取20min，转入离心管中，3500rp/min离心10分钟，将上清液倒入圆底烧瓶中与前两次提取液合并。将圆底烧瓶中所合并的提取液在室温下(20-25℃)减压浓缩，将全部浓缩液取至5mL刻度试管中，读取体积备用。

取HPD-300吸附树脂以甲醇洗涤2-3次，再用蒸馏水洗涤2-3次，装入1×20cm的柱子，柱床高度为10cm。用两个柱床体积的蒸馏水清洗平衡后备用。

取1/5的样品浓缩液上柱，以70％甲醇洗脱，收集前20mL洗脱液，混合均匀后以0.45μm孔径微孔滤膜过滤，滤液待进样。

2.3液相色谱条件

       色谱柱：C₁₈柱  4.6×250mm  5μm

       柱温：28℃

       荧光检测器：λex＝331nm，λem＝500nm

流动相：乙腈∶：水＝50∶50(以磷酸调pH至2.5)

流速：1.0mL/min

进样量：20μl

2.4色谱分析：处理好的试样提取液20μl进样，经荧光检测器检测得到色谱图后，外标法以标准桔霉素保留时间定性，将试样提取液中色谱峰面积与标准样品色谱峰面积比较定量。见图3。

2.5标准溶液制备：准确量取桔霉素标准储备液0.1mL，以70％甲醇定容100mL。此溶液浓度为0.004μg/mL，置4℃冰箱保存备用。

2.6计算

$X=\frac{h_1\×c\×20\×5}{h_2\×m}\×1000$

式中：X-试样中桔霉素含量，μg/Kg

      h₁-试样中桔霉素色谱峰面积

      c-标准桔霉素溶液浓度，g/mL

      20-洗脱体积，mL

      5-1/5取样倍数

      1000-单位折算倍数(g至Kg)

      h₂-标准桔霉素色谱峰面积

      m-试样称取量，g

3实验结果

功能性红曲米中桔霉素的含量测定实验结果( X±SD)

样品名称

n值

桔霉素含量

回收率

		μg/Kg	％
				功能性红曲米	5	12.4±1.1	94.1％

实施例3 XX红曲色素中桔青霉素含量测定

1实验材料

1.1样品：由XX研究所提供的xx红曲色素，为红色粉末。约50克/袋，共1袋。阴凉避光保存。

1.2主要仪器：电子天平、高效液相色谱仪、分光光度计、酸度计、超声波清洗器、旋转蒸发仪、超纯水制备系统、真空泵、恒温水浴锅、1×20cm层析柱

1.3参考标准物质：桔霉素(标准品，批号：1150490 34704019，美国Fluka)

1.4试剂：磷酸(分析纯，北京化工厂，批号：20040408)；乙腈(色谱纯，美国Fisher，批号：052064)；甲醇(分析纯，北京化工厂，批号：20051022)；大孔吸附树脂(HPD-300，沧州保恩化工有限公司)；无水乙醇(分析纯，北京化工厂，批号：20050412)

2.分析步骤

2.1样品色价测定：按照GB 4926-85测定样品色价水平。

2.2试样前处理

称取该样品5.0mg，用1ml的95％甲醇溶解后备用。

取HPD-600吸附树脂以甲醇洗涤2-3次，再用蒸馏水洗涤2-3次，装入1×20cm的柱子，柱床高度为10cm。用两个柱床体积的蒸馏水清洗平衡后备用。

将溶解好的样品溶液上柱，以70％甲醇洗脱，收集前20mL洗脱液，混合均匀后以0.45μm孔径微孔滤膜过滤，滤液待进样。

2.3液相色谱条件

色谱柱：C₁₈柱  4.6×250mm  5μm

柱温：28℃

荧光检测器：λex＝331nm，λem＝500nm

流动相：乙腈∶：水＝50∶50(以磷酸调pH至2.5)

流速：1.0mL/min

进样量：20μl

2.4色谱分析：处理好的试样提取液20μl进样，经荧光检测器检测得到色谱图后，外标法以标准桔霉素保留时间定性，将试样提取液中色谱峰面积与标准样品色谱峰面积比较定量。见图4。

2.5标准溶液制备：准确量取桔霉素标准储备液0.1mL，以70％甲醇定容100mL。此溶液浓度为0.004μg/mL，置4℃冰箱保存备用。

2.6计算

$X=\frac{h_1\×c\×20}{h_2\×m}\×1000$

式中：X-试样中桔霉素含量，μg/Kg

      h₁-试样中桔霉素色谱峰面积

      c-标准桔霉素溶液浓度，μg/mL

      20-洗脱体积，mL

      1000-单位折算倍数(g至Kg)

      h₂-标准桔霉素色谱峰面积

      m-试样称取量，g

3.实验结果

    xx红曲色素中桔霉素的含量测定实验结果( x±SD)

样品名称	n值	桔霉素含量μg/Kg	回收率％
				xx红曲色素	5	4458.3±135.7	98.5％

Claims (5)

1.一种红曲发酵产品中桔霉素含量的检测方法，它包括以下步骤：

(一)、样品色价测定步骤；

(二)、试样前处理步骤，包括：

(1)样品中桔霉素的提取步骤：将试样充分混合均匀，准确称取0.1～5.0g，即按色价50相当1g样品量再乘以5计算所称样品重量，放于50mL容量瓶中；按称样量1∶10(W/V)比例加入95％甲醇提取液，混合均匀，超声提取40min，静置澄清，上清液移至圆底烧瓶中平；往沉淀中按大约1∶8(V/V)比例加入95％甲醇，超声提取20min，静置澄清后将上清液合并至圆底烧瓶中；沉淀同前法加入95％甲醇，再超声提取20min，转入离心管中，3500rp/min离心10分钟，将上清液倒入圆底烧瓶中与前两次提取液合并；将圆底烧瓶中所合并的提取液在室温下减压浓缩，将全部浓缩液取至5mL刻度试管中，读取体积备用；

(2)粗分离所需吸附层析柱的制备步骤：

取适量中性吸附树脂以甲醇洗涤3次，再用蒸馏水洗涤3次，装入1×20cm的柱子，柱床高度为10-15cm；用两个柱床体积的蒸馏水清洗平衡后备用；

(3)样品中桔霉素的粗分离步骤：

取1/5-1/2的样品浓缩液上柱，以70％甲醇洗脱，收集前20mL-25mL洗脱液，混合均匀后以0.45μm孔径微孔滤膜过滤，滤液待进样；

(三)、液相色谱条件的确定步骤中，液相色谱条件为：

色谱柱：C₁₈柱4.6×250mm 5μm

柱温：28℃

荧光检测器：λex＝331nm，λem＝500nm

流动相：乙腈∶水＝50∶50

流速：1.0mL/min

进样量：20μl；

(四)、色谱分析步骤，包括：

将处理好的试样提取液20μl进样，经荧光检测器检测得到色谱图后，外标法以标准桔霉素保留时间定性，将试样提取液中色谱峰面积与标准样品色谱峰面积比较定量；

(五)、标准溶液的配制与标准曲线的制备步骤，包括：配制浓度为0.0002、0.001、0.004、0.04、0.1μg/mL桔霉素标准溶液，在下述色谱条件下进样测定，以峰面积对浓度作标准曲线：

色谱柱：C₁₈柱4.6×250mm 5μm

柱温：28℃

荧光检测器：λex＝331nm，λem＝500nm

流动相：乙腈∶水＝50∶50

流速：1.0mL/min

进样量：20μl；

(六)、结果计算步骤，所用公式为：

$X=\frac{h_1\×c\×20\×5}{h_2\×m}\×1000$

式中：X-试样中桔霉素含量，μg/Kg

      h₁-试样中桔霉素色谱峰面积

      c-标准桔霉素溶液浓度，μg/mL

      20-洗脱体积，mL

      5-1/5取样倍数

      1000-单位折算倍数(g至Kg)

      h₂-标准桔霉素色谱峰面积

m-试样称取量，g。

2.根据权利要求1所述的一种红曲发酵产品中桔霉素含量的检测方法，其样品色价测定步骤中按照GB4926-85标准测定样品色价水平。

3、根据权利要求1所述的一种红曲发酵产品中桔霉素含量的检测方法，其粗分离所需吸附层析柱的制备步骤中，所使用的中性吸附树脂为HPD-100。

4、根据权利要求1所述的一种红曲发酵产品中桔霉素含量的检测方法，其粗分离所需吸附层析柱的制备步骤中，所使用的中性吸附树脂为HPD-300。

5、根据权利要求1所述的一种红曲发酵产品中桔霉素含量的检测方法，其粗分离所需吸附层析柱的制备步骤中，所使用的中性吸附树脂为HPD-600。

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