CN102175788A - 一种利用液质联用仪检测红曲中桔霉素含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种桔霉素的检测方法，特别是利用液质联用仪检测红曲中桔霉素含量的方法。它包括超声提取法对样品进行前处理，超高压液相色谱检测和质谱检测步骤，方法：采用waters BEH C18液相色谱柱，流动相为乙腈-水，梯度洗脱条件，柱温为室温；用四级杆质谱检测器：正离子方式，电喷雾源，以母离子，子离子为定性定量离子，结果：本方法桔霉素的标准溶液在0.001～50μg/L之间线性良好，回归方程为y＝1923.2x+270.29，R2＝0.9998；样品的回收率为83.6％，检测限为0.001μg/L。结论：本方法准确度高，重复性好，适用于红曲中桔霉素的定量检测。

Description

一种利用液质联用仪检测红曲中桔霉素含量的方法

技术领域

本发明涉及一种桔霉素的检测方法，特别是利用液质联用仪检测红曲中桔霉素含量的方法。

背景技术

在我国，利用红曲霉发酵生产食品和药品已有上千年的历史，许多传统食品如：红曲米、红曲酒和腐乳等深受人们的喜爱。红曲霉的代谢产物中有许多在食品、医药和化工中很有价值的发酵产物。如品质优异、着色性好、色调丰富的天然红曲色素；能显著抑制胆固醇合成、降低血脂含量的莫那可林(Monacolin K)；还有含量非常丰富的麦角固醇、长链脂肪酸及多种抗菌活物质。20世纪90年代初，欧美、日本等国对我国的食用红曲、药用红曲及其相关产品需求猛增，给我国的红曲生产厂家带来了可观的经济效益。

桔霉素是青霉属和曲霉属的某些菌株产生的真菌毒素，于1931年首次被分离纯化。1979年Carlton将其作为抗菌素进行检测时，发现它对实验动物具有显著的肾脏毒性。后来，又发现它能引起许多动物的肾脏毒害，并有致癌性。

桔霉素的存在使我国的红曲产品出口受到了严重的损失。日本厚生省在1999年版“食品添加剂标准”中规定红曲色素中的桔霉素的含量须低于0.2μg/g，德国等西方国家也都制定了针对我国出口的红曲相关产品的新标准，规定桔霉素的含量必须低于规定值，否则严禁进口销售。而我国的红曲产品大多达不到这些标准。现在，国内外许多学者都在致力于筛选低产或不产桔霉素的生产菌株及生产工艺，和建立桔霉素快速检测的方法。

目前，桔霉素的危害性已越来越引起人们的重视，尤其我国是红曲产品的生产和消费大国。面对这一严峻的形势，应尽快制定检测桔霉素含量的国家标准，建立桔霉素快速检测的方法，努力筛选低产或不产桔霉素的生产菌株及生产工艺，才能保障人民健康，并使我国的红曲生产行业持续、健康发展。

桔霉素的检测方法有薄层层析法，高效毛细管电泳法，高效液相色谱法，高效液相色谱-荧光检测法以及酶联免疫法等。薄层层析法由于低灵敏度、低回收率、特异性差，一般只能用来定性分析。色谱和毛细管电泳技术都有各自优点，前者分离定量能力强，后者定性鉴定能力强。酶联免疫法检测是目前较为灵敏的方法，但此法需要专用的抗体，国内没有生产，且测试费用昂贵、周期长。

液质联用检测与以上方法相比有分离能力强、定性分析结果可靠、检测限低、分析时间快、自动化程度高等优点。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与质谱具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来。本方法检测结果准确可靠，检测限低，可达到0.001μg/L。

发明内容

为了克服现有技术的缺点，本发明提供一种利用液质联用仪检测红曲中桔霉素含量的方法，它分离能力强，定性分析结果可靠，检测限低，分析时间快，自动化程度高。

本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：包括以下步骤：

(一)、样品处理过程：

(1)、样品中桔霉素的提取：将试样充分混匀，称取0.2～1.0g，放于50mL离心管中；按照1∶10的体积比加入甲醇，超声提取30分钟，离心，沉淀，收集上清液；(2)、将第(1)步的沉淀物按照1∶10的体积比加入甲醇，超声提取30分钟，离心，沉淀，收集上清液；(3)、将将第(2)步的沉淀物按照1∶10的体积比加入甲醇，超声提取30分钟，离心，沉淀，收集上清液；(4)将第(1)、(2)和(3)步的上清液合并，常温减压浓缩至5mL；(5)、浓缩液离心后转移至刻度试管，读取体积备用；(6)、脱色素处理：将大孔树脂装入1.6×30cm层析柱，柱床15-20cm，用约2倍体积的70％甲醇水溶液流过填充好的层析柱，使甲醇水溶液浸过层析柱中的大孔树脂的顶部；取1mL第(5)步的浓缩液，上柱，置于树脂柱顶部，用70％甲醇水溶液以自上而下通过树脂柱，当红色色素到达层析柱的末端时开始准确收集30mL洗脱液，洗脱液用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤，所得过滤液用高效液相色谱-质谱联用仪进行测定；

(二)、色谱与质谱条件：

(1)、所用仪器为Waters液相色谱-质谱联用仪，色谱柱为BEH C18液相色谱柱(50*2.1mm，1.7μm)；(2)、质谱条件：正离子方式，电喷雾源(ESI)，质量分析器为四级杆，毛细管电压1.00ky，多反应检测(MRM)锥孔电压35V，离子源温度120℃，锥孔反吹气流量50L/hr，脱溶剂气流量500L/hr，脱溶剂温度350℃，母离子m/z＝251(M+1)，锥孔电压35V，子离子m/z＝233和205，碰撞能量分别为27V和17V；(3)、液相条件：色谱柱：BEH C18液相色谱柱(50*2.1mm，1.7μm)；(4)、流动相：A：乙腈；B：含体积0.1％甲酸的水，梯度洗脱条件，柱温为25℃，进样量10μL；

(三)、标准曲线的绘制：

用甲醇配制0.001μg/L、0.01μg/L、0.05μg/L、0.1μg/L、0.5μg/L、1.0μg/L、5.0μg/L、10μg/L、50μg/L的桔霉素标准溶液，在所述色谱和质谱条件下测定，记录峰面积，绘制峰面积-浓度标准曲线；

(四)、结果计算：

样品中桔霉素含量X＝C*V1*V2/m；式中：

X——样品中桔霉素的含量，单位μg/kg；

C——由标准曲线查得的洗脱液中的桔霉素浓度，单位μg/kg；

V1——洗脱液体积，单位mL；

V2——样品浓缩液体积，单位mL；

m——样品质量，单位g。

本发明与以上方法相比具有分离能力强、定性分析结果可靠、检测限低、分析时间快、自动化程度高等优点。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与质谱具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来。本方法检测结果准确可靠，检测限低，可达到0.001μg/L。

附图说明

下面结合附图对本发明进一步说明。

图1为本发明桔霉素标准色谱图；

图2为本发明桔霉素标准质谱图；

图3为本发明样品中桔霉素色谱图；

图4为本发明样品中桔霉素质谱图；

图5为本发明桔霉素标准曲线。

具体实施方式

实施例一

一、实验仪器与试剂如下

1)仪器：Waters液相色谱-质谱联用仪(美国waters公司)；色谱柱：BEH C18液相色谱柱(50*2.1mm，1.7μm)(美国waters公司)；针筒式微孔滤膜0.22μm有机系滤膜；旋转蒸发仪(上海申科)；电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；高速离心机(湘仪集团)；超声仪。

2)实验试剂：桔霉素标准品、甲醇、乙腈、甲酸、超纯水

二、实验如下：

1)在本实施例中，用桔霉素标准品摸索并确定最佳的色谱条件和质谱条件。

2)用已确定的方法测定待测样品，确定其中是否含有桔霉素。

3)往待测样品中添加桔霉素标准品，测定方法的回收率、精密度以及最低检测限。

三、试验方法如下：

1)、样品中桔霉素的提取

准确称取功能红曲米粉1.0g，放于50mL离心管中；按照1∶10的比例加入甲醇，超声提取30min；离心，收集上清液；将沉淀物按上述条件提取，收集上清液；将沉淀物按上述条件再提取，收集上清液；将三次上清液合并，旋转蒸发仪常温减压浓缩至5mL；浓缩液离心后转移至刻度试管，读取体积备用。

2)、试样脱色素处理

大孔树脂处理后，装入1.6×30cm层析柱，柱床15-20cm，用约2倍体积的70％甲醇水溶液流过填充好的层析柱，使甲醇水溶液浸过柱中树脂的顶部。

取1mL的浓缩液上柱，置于树脂柱顶部，用70％甲醇水溶液以自上而下通过树脂柱。当红色色素到达层析柱的末端时开始准确收集30mL洗脱液，洗脱液用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤，所得过滤液用高效液相色谱-质谱联用仪进行测定。

3)、色谱与质谱条件

所用仪器为Waters液相色谱-质谱联用仪。

质谱条件：

正离子方式，电喷雾源(ESI)，质量分析器为四级杆，毛细管电压1.00kv，多反应检测(MRM)锥孔电压35V，离子源温度120℃，锥孔反吹气流量50L/hr，脱溶剂气流量500L/hr，脱溶剂温度350℃，母离子m/z＝251(M+1)，锥孔电压35V，子离子m/z＝233和205，碰撞能量分别为27V和17V。

液相条件：

a色谱柱：BEH C18液相色谱柱(50*2.1mm，1.7μm)。

b流动相：A：乙腈；B：水(含0.1％甲酸)，梯度洗脱条件，

c柱温：25℃，

d进样量10μL。

四、实验结果

1)、标准曲线绘制

用甲醇配制0.001μg/L、0.01μg/L、0.05μg/L、0.1μg/L、0.5μg/L、1.0μg/L、5.0μg/L、10μg/L、50μg/L的桔霉素标准溶液，在所述色谱和质谱条件下测定，记录峰面积，绘制峰面积-浓度标准曲线。

根据其保留时间对应的子离子峰面积与其浓度进行回归分析，得到线性方程：y＝1923.2x+270.29，R2＝0.9998，桔霉素在0.001～50ppb范围内呈线性。

2)检测结果

                                                   

样品名称                    桔霉素含量(μg/kg)

                                                   

功能红曲米粉                15.3

                                                   

3)方法的回收率和精密度

对添加1mL浓度分别为10μg/L，50μg/L，100μg/L桔霉素标准溶液的样品进行重复性试验，每个浓度取三个平行样。根据测定结果计算回收率和精密度，结果如下表所示。

                                                                   

样品    内标添加量(μg)    平均回收率(％)    相对标准偏差RSD(％)

红曲    0.01               83.1              4.6

米粉    0.05               82.7              4.9

0.1                84.3              5.7

                                                                   

4)方法的检出限

根据仪器响应值与噪音的比值为3计算方法的检出限，桔霉素的检出限为0.001μg/L。

实施例二

一、实验仪器与试剂如下

1)仪器

实验仪器同实施例一

2)实验试剂

实验试剂同实施例一

二、实验设计如下：

1)在本实施例中，用桔霉素标准品摸索并确定最佳的色谱条件和质谱条件。

2)用已确定的方法测定待测样品，确定其中是否含有桔霉素。

3)往待测样品中添加桔霉素标准品，测定方法的回收率、精密度以及最低检测限。

三、试验方法如下：

1)样品中桔霉素的提取

准确称取色素红曲米粉0.2g，放于50mL离心管中；按照1∶10的比例加入甲醇，超声提取30min；离心，收集上清液；沉淀再抽提两次(条件同前)；将三次上清液合并，旋转蒸发仪常温减压浓缩至5mL；浓缩液离心后转移至刻度试管，读取体积备用。

2)试样脱色素处理

树脂处理后，装1.6×30cm层析柱，柱床15-20cm，用约2倍体积的70％甲醇水溶液流过填充好的层析柱，使甲醇水溶液浸过柱中树脂的顶部。

取约1mL的样品浓缩液上柱，置于树脂柱顶部，用70％甲醇水溶液以自上而下通过树脂柱。当红色色素到达柱子的末端时开始准确收集30mL洗脱液，洗脱液用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤，所得过滤液用高效液相色谱-质谱联用仪进行测定。

3)色谱与质谱条件

液相色谱条件与质谱条件同实施例一。

四、实验结果

1)标准曲线绘制

用甲醇配制0.001μg/L、0.01μg/L、0.05μg/L、0.1μg/L、0.5μg/L、1.0μg/L、5.0μg/L、10μg/L、50μg/L的桔霉素标准溶液，在所述色谱和质谱条件下测定，记录峰面积，绘制峰面积-浓度标准曲线。

根据其保留时间对应的子离子峰面积与其浓度进行回归分析，得到线性方程：y＝1923.2x+270.29，R2＝0.9998，桔霉素在0.001～50μg/L范围内呈线性。

2)检测结果

                                                  

样品名称                    桔霉素含量(μg/kg)

                                                  

色素红曲米粉                5373

                                                  

3)方法的回收率和精密度

对添加1mL浓度分别为1mg/L，5mg/L，10mg/L桔霉素标准溶液的样品进行重复性试验，每个浓度取三个平行样。根据测定结果计算回收率和精密度，结果如下表所示。

                                                                     

样品    内标添加浓度(μg)    平均回收率(％)    相对标准偏差RSD(％)

红曲    1                    85.7              6.1

米粉    5                    88.9              5.3

10                   87                3.7

                                                                     

4)方法的检出限

根据仪器响应值与噪音的比值为3计算方法的检出限，桔霉素的检出限为0.001μg/L。

Claims (1)

1.一种利用液质联用仪检测红曲中桔霉素含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(一)、样品处理过程：

(1)、样品中桔霉素的提取：将试样充分混匀，称取0.2～1.0g，放于50mL离心管中；按照1∶10的体积比加入甲醇，超声提取30分钟，离心，沉淀，收集上清液；(2)、将第(1)步的沉淀物按照1∶10的体积比加入甲醇，超声提取30分钟，离心，沉淀，收集上清液；(3)、将将第(2)步的沉淀物按照1∶10的体积比加入甲醇，超声提取30分钟，离心，沉淀，收集上清液；(4)将第(1)、(2)和(3)步的上清液合并，常温减压浓缩至5mL；(5)、浓缩液离心后转移至刻度试管，读取体积备用；(6)、脱色素处理：将大孔树脂装入1.6×30cm层析柱，柱床15-20cm，用约2倍体积的70％甲醇水溶液流过填充好的层析柱，使甲醇水溶液浸过层析柱中的大孔树脂的顶部；取1mL第(5)步的浓缩液，上柱，置于树脂柱顶部，用70％甲醇水溶液以自上而下通过树脂柱，当红色色素到达层析柱的末端时开始准确收集30mL洗脱液，洗脱液用孔径0.22μm的微孔滤膜过滤，所得过滤液用高效液相色谱-质谱联用仪进行测定；

(二)、色谱与质谱条件：

(1)、所用仪器为Waters液相色谱-质谱联用仪，色谱柱为BEH C18液相色谱柱(50*2.1mm，1.7μm)；(2)、质谱条件：正离子方式，电喷雾源(ESI)，质量分析器为四级杆，毛细管电压1.00kv，多反应检测(MRM)锥孔电压35V，离子源温度120℃，锥孔反吹气流量50L/hr，脱溶剂气流量500L/hr，脱溶剂温度350℃，母离子m/z＝251(M+1)，锥孔电压35V，子离子m/z＝233和205，碰撞能量分别为27V和17V；(3)、液相条件：色谱柱：BEH C18液相色谱柱(50*2.1mm，1.7μm)；(4)、流动相：A：乙腈；B：含体积0.1％甲酸的水，梯度洗脱条件，柱温为25℃，进样量10μL；

(三)、标准曲线的绘制：

用甲醇配制0.001μg/L、0.01μg/L、0.05μg/L、0.1μg/L、0.5μg/L、1.0μg/L、5.0μg/L、10μg/L、50μg/L的桔霉素标准溶液，在所述色谱和质谱条件下测定，记录峰面积，绘制峰面积-浓度标准曲线；

(四)、结果计算：

样品中桔霉素含量X＝C*V1*V2/m；式中：

X——样品中桔霉素的含量，单位μg/kg；

C——由标准曲线查得的洗脱液中的桔霉素浓度，单位μg/kg；

V1——洗脱液体积，单位mL；

V2——样品浓缩液体积，单位mL；

m——样品质量，单位g。

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