CN103713070B - 一种酸性氧化铝柱分离提纯桔霉素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及食品安全检测前处理，旨在提供一种酸性氧化铝柱分离提纯桔霉素的方法。该方法包括：选用酸性氧化铝为提纯柱的柱填料，使用干法上柱；用甲醇预淋洗柱，然后上样，样品过柱后，先用pH2.5的60%甲醇洗脱杂质，再用pH2.1的80%甲醇洗脱桔霉素，收集洗脱液，水浴旋转蒸干，得到提纯自样品的桔霉素。本发明可以实现对酱油、米醋、腐乳或大米桔霉素检出限较粗提物的检出限减小。该富集方法易扩大规模，进行大量样品的检测，对桔霉素的检测具有重要的实际意义。

Description

一种酸性氧化铝柱分离提纯桔霉素的方法

技术领域

本发明涉及桔霉素的分离提纯，属于食品安全检测前处理。

背景技术

桔霉素（Citrinin），主要由青霉，曲霉，红曲霉属真菌产生。食品中桔霉素的污染非常普遍的。如自然条件下容易受霉菌污染的食品原料和食品，利用霉菌作用而生产的食品，利用红曲色素作为添加剂的食品等，它们都极有可能受到桔霉素的污染。学者在红曲色素、谷物、果汁等食品中，均测出桔霉素。研究发现，桔霉素是一种肾毒素，具有致畸致癌性，因而被国际生命科学院自然毒素检测委员会欧洲分会列为必须检测的毒素之一。欧盟要求食品中桔霉素不得超过0.1mg/kg，韩国的限量标准为0.05mg/kg，澳大利亚、新西兰等国家要求食品中桔霉素不能够超过0.2mg/kg。日本规定红曲色素中桔霉素不能超过0.2mg/kg，我国对以红曲原料的保健食品有桔霉素限量，为0.05mg/kg，但对普通食品还没有设定桔霉素限制标准。目前，我国很多出口的食品都需要检测桔霉素含量，它已经成了限制我国红曲及其制品，利用曲霉的食品出口的瓶颈问题。目前桔霉素定量最有效的方法是高效液相-荧光检测器（HPLC-FLD）。我们对30类食品中的桔霉素含量进行检测，发现部分食品粗提液，可以用HPLC-FLD直接测出含量。但是酱油、腐乳等食品的桔霉素HPLC出峰处，存在干扰物质难以完全分离问题，其测定结果偏高；而大米、米醋等食品桔霉素含量较低，HPLC直接测定也存在检测限偏高问题。目前我国针对进出口食品中桔霉素检测的国家标准大米中桔霉素的测定，也并非桔霉素提取后直接测定，而是要用桔霉素免疫亲和柱纯化后，再用HPLC-FLD，其回收率为70.25%-88.65%，精密度为3.72%-7.94%，检测低限为30μg/kg。桔霉素免疫亲和柱目前都是进口的，价格非常昂贵。

本发明采用酸性氧化铝柱纯化富集桔霉素属于开创性研究，用酸性氧化铝柱对桔霉素纯化富集的研究上未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种酸性氧化铝柱分离提纯桔霉素的方法。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种酸性氧化铝柱分离提纯桔霉素的方法，包括以下步骤：

（1）选用酸性氧化铝为提纯柱的柱填料，柱体积为3mL，装柱量为0.5g～1.0g，使用干法上柱；

（2）用10mL甲醇预淋洗柱，然后上样，样品过柱后，先用20mL pH2.5的60%甲醇洗脱杂质，再用40mL pH2.1的80%甲醇洗脱桔霉素，收集洗脱液，水浴旋转蒸干，得到提纯自样品的桔霉素；

所述不同浓度的甲醇均为甲醇与加水后总体积的百分比；上样和洗脱时的流速均为1mL/min；

所述样品是：酱油液体样品的冻干粉、米醋液体样品的冻干粉、腐乳样品的匀浆处理物或大米样品粉碎物。

本发明中，所述样品的制备过程是：

A、100mL酱油的液体样品，在45℃±2℃下减压浓缩至无液体滴出，浓缩物冷冻至固态后冷冻干燥2天，收集粉末状样品；或者，

取100mL米醋的液体样品，在45℃±2℃下减压浓缩至无液体滴出，浓缩物冷冻至固态后冷冻干燥2天，收集粉末状样品；或者，

取10.0g腐乳样品，加入20mL60%乙醇溶液，用打浆机进行匀浆处理；或者，

将大米样品放入粉碎机中粉碎成粉末，称取20.0g；

B、向前一步骤所得样品中加入50mL60%乙醇溶液，置于超声仪中超声20min，收集上清液，沉淀物再加入50mL60%乙醇溶液，置于超声仪中超声20min，收集上清液；合并上清液进行减压蒸发至无液体滴出；干燥后加入10mL甲醇复溶，收集上清液，重复提取一次，合并上清液；离心后取出上清液减压蒸发至无液体滴出；放至干燥状态后，2.0mL甲醇定容，移至2mL离心管备用。

本发明中，所述60%甲醇和80%甲醇均使用磷酸调节pH值。

本发明还提供了一种用于确定所述方法中桔霉素回收率的方法，是在其样品的制备过程中加入桔霉素标准品；其过程具体包括：

A、取三个100mL酱油的液体样品，分别按9.6μg、12.0μg、14.4μg加入桔霉素标准品；在45℃±2℃下减压浓缩至无液体滴出，浓缩物冷冻至固态后冷冻干燥2天，收集粉末状样品；或者，

取三个100mL米醋的液体样品，分别按4.8μg、6.0μg、7.2μg加入桔霉素标准品；在45℃±2℃下减压浓缩至无液体滴出，浓缩物冷冻至固态后冷冻干燥2天，收集粉末状样品；或者，

取三个10.0g腐乳样品，加入20mL60%乙醇溶液，用打浆机进行匀浆处理后，分别按4.8μg、6.0μg、7.2μg加入桔霉素标准品；或者，

将大米样品放入粉碎机中粉碎成粉末，取三份样品，各称取20.0g，分别按1.0μg、1.2μg、1.5μg加入桔霉素标准品；

B、向前一步骤所得样品中加入50mL60%乙醇溶液，置于超声仪中超声20min，收集上清液，沉淀物再加入50mL60%乙醇溶液，置于超声仪中超声20min，收集上清液；合并上清液进行减压蒸发至无液体滴出；干燥后加入10mL甲醇复溶，收集上清液，重复提取一次，合并上清液；离心后取出上清液减压蒸发至无液体滴出；放至干燥状态后，2.0mL甲醇定容，移至2mL离心管备用。

本发明的有益效果：

本发明开发酸性氧化铝柱对桔霉素纯化富集，可以实现对桔霉素检出限较粗提物的检出限减小。酱油、米醋粗提物中桔霉素的检出限分别为经过经过酸性氧化铝柱纯化富集后的8.5倍和9.5倍。大米、腐乳粗提物中桔霉素的检出限分别为经过经过酸性氧化铝柱纯化富集后的8.7倍和9.0倍。

采用酸性氧化铝柱纯化桔霉素，可以实现检出限较粗提物的检出限减小。食品中粗提物中桔霉素的检出限均为经过酸性氧化铝柱纯化富集后的8.5-9.5倍。该富集方法易扩大规模，进行大量样品的检测。

本发明对桔霉素的检测具有重要的实际意义。

附图说明

图1为酸性氧化铝提纯后桔霉素的高效液相色谱图（出峰时间为6.556min）。

具体实施方式

我们在桔霉素分析测定研究工作中，发展出酸性氧化铝柱和洗脱体系，对食品样品中桔霉素进行提纯，然后测定其含量，能够用很低的成本，排除食品的桔霉素检测中杂质干扰问题，以及符合检测限要求。较好地解决了食品中桔霉素含量的测定问题。

本发明的技术方案：制备酸性氧化铝的固体分离柱，以4种食品的粗提物为原料，采用柱层析法，选取合适的柱填料和洗脱液分离纯化富集桔霉素。

酸性氧化铝，干法上柱，加压使填料压实，上样流速为1mL/min，样品液通过酸性氧化铝柱后，用甲醇以1mL/min的流速，除去杂质，加压使洗脱液流完，再用80%甲醇(pH2.1)，以流速1mL/min进行洗脱，流出液中桔霉素得以纯化富集。

一、层析柱填料的选取

分别用等量酸性氧化铝、中性氧化铝、弗罗里硅土、硅藻土、硅胶、活性碳颗粒为填料装柱，进行动态吸附试验。结果表明酸性氧化铝和中性氧化铝对桔霉素的吸附率为100%，活性炭对桔霉素的吸附率为99.70%。被酸性氧化铝吸附的桔霉素具有最高的解吸率，被中性氧化铝吸附的桔霉素解吸率较低，被活性炭吸附的桔霉素很难洗脱下来。酸性氧化铝除杂效果显著，因此选用酸性氧化铝作为填料，纯化富集桔霉素。

本发明中，酸性氧化铝是指：三氧化二铝，CAS登记号1344-28-1，白色粉末，使用酸性溶剂预处理过，具有微弱阳离子特性。其来源为：上海五四化学试剂有限公司，Q/BKUS5-1999层析用。

二、洗脱体系的确定

选择酸性氧化铝柱。将0.5mL桔霉素浓度为0.001mg/mL的桔霉素标准品（甲醇为溶剂）以1mL/min的流速通过装柱量为0.500g的酸性氧化铝柱（柱体积为3mL），再用20mL洗脱剂进行洗脱，收集各洗脱液，在39℃±2℃的水浴上旋转蒸发，旋干后，1.0mL甲醇复溶，用0.45μm有机滤膜过滤，再进行HPLC分析。重复5次，计算各种洗脱剂的洗脱率。

预备实验：

1、单溶剂：氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、甲醇、甲醇(pH2.5)。经试验发现甲醇(pH2.5)洗脱效果最好，洗脱率为33.82%。

2、复配溶剂为备选洗脱体系：氯仿∶甲醇=80∶20、氯仿∶甲醇=90∶10、丙酮∶正己烷=40∶60、乙酸乙酯∶石油醚=90∶10、60%甲醇（pH2.5）、70%甲醇（pH2.5）、80%甲醇（pH2.5）、85%甲醇（pH2.5）、90%甲醇（pH2.5）、95%甲醇（pH2.5）、70%乙醇（pH2.5）、80%乙醇（pH2.5）、90%乙醇（pH2.5）。经试验发现，80%甲醇（pH2.5）在酸性氧化铝上的洗脱剂最高，为74.26%。

另，对甲醇、氯仿、乙酸乙酯、氯仿∶甲醇=80∶20、氯仿∶甲醇=90∶10、丙酮∶正己烷=40∶60、乙酸乙酯∶石油醚=90∶10、60%甲醇（pH2.5)进行洗脱桔霉素的测试。

食品中对桔霉素HPLC检测形成干扰的物质主要是极性较大的物质。用60%甲醇（pH2.5)和甲醇洗脱吸附桔霉素的酸性氧化铝柱，桔霉素的洗脱率分别为0%和0.21%。可以选择其中一种洗脱杂质溶剂，作为食品粗提物过柱后减少杂质的清洗液。

正式实验：采用分别调pH2.7、pH2.5、pH2.3、pH2.1、pH2.0、pH不调节的80%甲醇。结果显示：80%甲醇(pH2.1)是酸性氧化铝的桔霉素最佳洗脱剂，洗脱率为83.65%。因此选用80%甲醇(pH2.1)为洗脱剂。

备注：洗脱体系的pH均用磷酸调节，溶剂比值均为体积比。不同浓度的甲醇均为甲醇与加水后总体积的百分比，乙醇同样。

实施例1

液体样品桔霉素提取：取三个食品样品，再分别按照表2中加入不同量的桔霉素标准品后，进行提取操作。

酱油、米醋提取方法一样。各取100mL液体样品，按照表2加标准品。用旋转蒸发仪，在45℃±2℃下，减压浓缩，至无液体滴出时，浓缩物和瓶一起放入-80℃冰箱中冷冻至固态，在-30℃，14Pa条件下冷冻干燥2天，收集粉末。粉末样品移入250mL的锥形瓶中，加入50mL60%的乙醇溶液（预备实验获得最佳工艺），置于超声仪中超声20min（预备实验获得最佳工艺），静置2min，收集上清液，沉淀物再加入50mL60%的乙醇溶液，置于超声仪中超声20min，静置2min，收集上清液。合并上清液于旋转蒸发瓶中，在39℃±2℃水浴里进行减压蒸发至几乎无液体滴出。将该瓶放于通风橱中至干燥状态后，加入10mL甲醇复溶，收集上清液，重复提取一次，合并上清液，8000rpm离心15min。取出上清液于旋转蒸发瓶，减压蒸发至无液体滴出。放入通风橱中至干燥状态后，2.0mL甲醇定容，移至2mL离心管。

实验选用酸性氧化铝为柱填料，装柱规格为1.0g，干法上柱后加压使填料压实。用10mL甲醇活化后，分别取前面处理好的食品样品提取液过柱，先用20mL60%甲醇（pH2.5)洗脱杂质。再用40mL洗脱液80%甲醇（pH2.1）以1mL/min流速洗脱，加压使其流干，收集洗脱液，在39℃±2℃温度下水浴旋转蒸发，旋干后，1.0mL甲醇复溶，再用0.45μm有机滤膜过滤，最后进行HPLC分析测定。

液相测定条件：岛津ODS柱(Hypersil ODS2，5μm，250×4.6mm)，RF-10A荧光检测器，柱温为25℃。流速为0.8mL/min，进样；量10μL，检测波长为λ_ex=331nm，λ_em=500nm，流动相：乙腈：超纯水(pH2.5)=30：70。桔霉素标准品在100μg/mL-0.01μg/mL的浓度范围内具有良好的线性关系(R²=1.0000)，重复5次进样，精密度为0.074%，说明该色谱条件具有良好地重现性，符合实验要求。

表1酱油和米醋样品中桔霉素提取物检出限

表2酱油和米醋样品中桔霉素提取物回收率

由表1可以看出，酱油过柱处理的检出限比不过柱处理的减小了8.5倍。米醋过柱处理的检出限比不过柱处理的减小了9.5倍。由表2可以看出，酱油过柱回收率为79.34%-82.59%，精密度为2.35%-3.54%，米醋过柱回收率为78.23%-80.93%，精密度为2.05%-3.64%。与中国进出口检验检疫行业标准比较，回收率、检测低限类似，精密度稍优。

实施例2

固体样品桔霉素提取：

大米和腐乳中的桔霉素提取方法基本类似。腐乳称取10.0g，将腐乳样品放入50mL离心管中，加入20mL60%乙醇溶液，用打浆机进行匀浆处理。大米样品放入粉碎机中粉碎成粉末，称取20.0g样品。取三个食品样品，再分别按照表4中加入不同量的桔霉素标准品后，进行提取操作。

两种样品分别移入250mL锥形瓶中，加入50mL60%乙醇溶液置于超声仪中超声20min，静置2min，收集上清液，沉淀物加入50mL60%乙醇溶液置于超声仪中超声20min，静置2min，收集上清液。合并上清液于旋转蒸发瓶中，在39℃±2℃水浴里进行减压蒸发，浓缩至无液体滴出。将含有浓缩液的旋转蒸发瓶放于通风橱中至干燥状态后，加入10mL甲醇复溶，收集上清液，重复提取一次，合并上清液，8000rpm离心15min。取出上清液于旋转蒸发瓶，减压蒸发至无液体滴出。放入通风橱中至干燥状态后，2.0mL甲醇定容，移至2mL离心管。

之后的提纯方法与酱油、米醋的桔霉素测定方法相同（测试腐乳时装柱量为0.5g，测试腐乳时装柱量为0.75g）。

表3大米和腐乳样品中桔霉素提取物检出限的比较

表4大米和腐乳样品加标回收率

由表3可以看出，大米过柱处理的检出限比不过柱处理的减小了8.7倍。腐乳过柱处理的检出限比不过柱处理的减小了9.0倍。由表4可以看出，大米过柱回收率为75.87%-79.43%，精密度为2.46%-3.23%，腐乳过柱回收率为78.29-83.75%，精密度为2.98%-3.86%。与中国进出口检验检疫行业标准比较，回收率、检测低限类似，精密度稍优。

本具体实施例中，加标准品只是为了确定回收率，用于证明方法可行。回收率确定后，在正常对食品桔霉素的检测过程中，样品里是不加标准品的，其测试方式相同。

Claims (4)

1.一种酸性氧化铝柱分离提纯桔霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)选用酸性氧化铝为提纯柱的柱填料，柱体积为3mL，装柱量为0.5g～1.0g，使用干法上柱；

(2)用10mL甲醇预淋洗柱，然后上样，样品过柱后，先用20mL pH 2.5的60％甲醇洗脱杂质，再用40mL pH 2.1的80％甲醇洗脱桔霉素，收集洗脱液，水浴旋转蒸干，得到提纯自样品的桔霉素；

所述不同浓度的甲醇均为甲醇与加水后总体积的百分比；上样和洗脱时的流速均为1mL/min；

所述样品是：酱油液体样品的冻干粉、米醋液体样品的冻干粉、腐乳样品的匀浆处理物或大米样品粉碎物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品的制备过程是：

A、100mL酱油的液体样品，在45℃±2℃下减压浓缩至无液体滴出，浓缩物冷冻至固态后冷冻干燥2天，收集粉末状样品；或者，

取100mL米醋的液体样品，在45℃±2℃下减压浓缩至无液体滴出，浓缩物冷冻至固态后冷冻干燥2天，收集粉末状样品；或者，

取10.0g腐乳样品，加入20mL 60％乙醇溶液，用打浆机进行匀浆处理；或者，

将大米样品放入粉碎机中粉碎成粉末，称取20.0g；

B、向前一步骤所得样品中加入50mL 60％乙醇溶液，置于超声仪中超声20min，收集上清液，沉淀物再加入50mL 60％乙醇溶液，置于超声仪中超声20min，收集上清液；合并上清液进行减压蒸发至无液体滴出；干燥后加入10mL甲醇复溶，收集上清液，重复提取一次，合并上清液；离心后取出上清液减压蒸发至无液体滴出；放至干燥状态后，2.0mL甲醇定容，移至2mL离心管备用。

3.根据权利要求1或2中所述的方法，其特征在于，所述60％甲醇和80％甲醇均使用磷酸调节pH值。

4.一种用于确定桔霉素回收率的方法，其特征在于，是在其样品的制备过程中加入桔霉素标准品；其过程具体包括：

A、取三个100mL酱油的液体样品，分别按9.6μg、12.0μg、14.4μg加入桔霉素标准品；在45℃±2℃下减压浓缩至无液体滴出，浓缩物冷冻至固态后冷冻干燥2天，收集粉末状样品；或者，

取三个100mL米醋的液体样品，分别按4.8μg、6.0μg、7.2μg加入桔霉素标准品；在45℃±2℃下减压浓缩至无液体滴出，浓缩物冷冻至固态后冷冻干燥2天，收集粉末状样品；或者，

取三个10.0g腐乳样品，加入20mL 60％乙醇溶液，用打浆机进行匀浆处理后，分别按4.8μg、6.0μg、7.2μg加入桔霉素标准品；或者，

将大米样品放入粉碎机中粉碎成粉末，取三份样品，各称取20.0g，分别按1.0μg、1.2μg、1.5μg加入桔霉素标准品；

B、向前一步骤所得样品中加入50mL 60％乙醇溶液，置于超声仪中超声20min，收集上清液，沉淀物再加入50mL 60％乙醇溶液，置于超声仪中超声20min，收集上清液；合并上清液进行减压蒸发至无液体滴出；干燥后加入10mL甲醇复溶，收集上清液，重复提取一次，合并上清液；离心后取出上清液减压蒸发至无液体滴出；放至干燥状态后，2.0mL甲醇定容，移至2mL离心管备用；

经处理后的样品经过下述分离提纯后获得桔霉素，具体包括以下步骤：

(1)选用酸性氧化铝为提纯柱的柱填料，柱体积为3mL，装柱量为0.5g～1.0g，使用干法上柱；

(2)用10mL甲醇预淋洗柱，然后上样，样品过柱后，先用20mL pH 2.5的60％甲醇洗脱杂质，再用40mL pH 2.1的80％甲醇洗脱桔霉素，收集洗脱液，水浴旋转蒸干，得到提纯自样品的桔霉素；

所述不同浓度的甲醇均为甲醇与加水后总体积的百分比；上样和洗脱时的流速均为1mL/min。