CN103063789B - 同时检测大叶蒟中12个酰胺类生物碱的液相分析方法 - Google Patents
同时检测大叶蒟中12个酰胺类生物碱的液相分析方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种同时检测大叶蒟中12个酰胺类生物碱的液相分析方法，该方法包括以下步骤：步骤1，12个化合物对照品溶液的制备；步骤2，检测样品溶液的制备；步骤3，含量测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定；该方法能够很好的分离12个生物碱并且有效避免了其他杂质的干扰，方法简单、快速、专属性强，稳定性好，可以用于大叶蒟药材及相关产品的质量控制。
Description
技术领域
本发明涉及中药制药领域中的分析方法，尤其是一种液相分析方法。
技术背景
大叶蒟PiperlaetispicumC.DC.，为胡椒科胡椒属植物，主要分布在我国广东、广西、云南及海南省。民间用于活血、消肿、止痛，主治跌打损伤、瘀血肿痛。复旦大学药学院在进行抗抑郁天然药物的筛选时首次发现大叶蒟具有较强的抗抑郁作用，并对其做了比较全面的研究。
目前从大叶蒟各部位中分离得到了20多个化合物，主要为酰胺类生物碱类。实验证明，这类化合物正是大叶蒟抗抑郁的物质基础。
分析方法的建立有助于加快大叶蒟有效成分的进一步研究，也为今后大叶蒟相关产品的质量控制提供了技术支持。但是由于大叶蒟中的生物碱结构、理化性质均比较相近，分离难度较大。仅有一篇文献[董栋，大叶蒟抗抑郁有效成分制备工艺、质量标准及大叶蒟挥发油化学成分研究，2008]中报道了一种简单的HPLC分析方法，该方法只针对其中5个化合物，但不能很好的分离大多数酰胺类生物碱以及其他杂质。因此精度不高，实际操作过程中容易出现差错。
鉴于以上原因，我们开发了能同时检测12个酰胺类生物碱的液相分析方法，可以用于其中任意几种化合物的检测。
发明内容
本发明目的在于开发一种能同时检测大叶蒟中12个酰胺类生物碱的液相分析方法。从而有助于加快大叶蒟抗抑郁有效成分的进一步研究，也为今后大叶蒟相关产品的质量控制提供了技术支持。
为此，本发明提供了一种大叶蒟中12个酰胺类生物碱的含量测定方法，该方法采用了C18色谱柱，二元洗脱系统，以及DAD检测器，用于大叶蒟及相关产品中以下12个酰胺类生物碱中任意1-12个化合物的同时测定；
化合物1：5′-甲氧基-3′，4′-次甲二氧基桂皮酸四氢吡咯；
化合物2：5-′甲氧基-3′，4′-次甲二氧基桂皮酸异丁基酰胺；
化合物3：1-[(2E，4E)-9-(3，4-次甲二氧基苯)七碳二烯酰]四氢吡咯；
化合物4：(2E，4E)-N-异丁基-9-(3，4-次甲二氧基苯)七碳二烯酰胺；
化合物5：1-[(2E，4E，7E)-9-(3，4-次甲二氧基苯)九碳二烯酰]四氢吡咯；
化合物6：1-[(2E，7E)-N-7-(3，4-次甲二氧基苯)九碳二烯酰]四氢吡咯；
化合物7：(2E，4E，7E)-N-异丁基-9-(3，4-次甲二氧基苯)九碳二烯酰胺；
化合物8：墙草碱；
化合物9：(2E，7E)-N-异丁基-7-(3，4-次甲二氧基苯)九碳二烯酰胺；
化合物10：(2E，4E)-N-异丁基-9-苯基九碳二烯酰胺；
化合物11：大叶蒟素；
化合物12：(2E，4E)-N-异丁基-11-苯基十一碳二烯酰胺。
其中所述的C18色谱柱包括填料颗粒为5μm、2.6μm和1.7μm粒径的色谱柱。所述的二元洗脱系统包括甲醇-水体系，乙腈-水体系以及甲醇乙腈混合液-水体系，洗脱程序可以是梯度也可以是等度。所述的检测波长范围为200-320nm，所述的分析仪器包括HPLC和UPLC。
所述HPLC色谱条件为：
A色谱柱：C18(5μm，250mm×4.60mm)
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
吸收波长：216nm，240nm，259nm
流动相：
B色谱柱：C18(2.6μm，100mm×4.60mm)
流速：0.8ml/min
柱温：30℃
吸收波长：216nm，240nm，259nm
流动相：
所述UPLC色谱条件为：
C色谱柱：C18(1.7μm，100mm×2.10mm)
流速：0.2ml/min
柱温：30℃
吸收波长：216nm，240nm，259nm
流动相：
本发明的含量测定方法，包括以下步骤：
步骤1
12个化合物对照品溶液的制备；
步骤2
检测样品溶液的制备；
步骤3
含量测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，得到色谱图，经计算得到12种化合物的含量。
本发明中12个化合物对照品的制备通过以下步骤完成：
步骤一，提取：
取药材胡椒属植物大叶蒟的地上部分，粗粉碎，置于提取罐中，加入50-99％的乙醇，回流提取2小时，滤过，药渣用50-99％的乙醇，回流提取2小时，滤过，合并两次滤液，65℃减压浓缩成RD1.3-1.35的浸膏；
步骤二，粗分离：
浸膏用30-60％的乙醇溶解，加入D101大孔吸附树脂的色谱柱中，用30-60％的乙醇洗脱，洗脱液弃去，换用60-99％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，得到提取物；
步骤三，纯化制备：
提取物经拌样，加入填装有硅胶的色谱柱中，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，薄层法检测，合并同一单点化合物，得到G1-G8，其中G1经石油醚洗涤，再经乙醇-水体系重结晶得到化合物8；G2经Flash快速制备色谱分离，同上重结晶得到化合物10和化合物12；G3经石油醚洗涤，再经乙醇-水体系重结晶得到化合物11；G4同G3处理之后再经高效制备色谱分离得到化合物7和化合物9；G5同G3处理得到化合物4；G6同G3处理得到化合物2；G7经Flash快速制备色谱分离得到化合物3及化合物5和6的混合物，混合物再经高效制备色谱分离得到化合物5和化合物6；G8同G3处理得到化合物1，纯度均大于98％。
本发明优选的含量测定方法，步骤如下：
步骤一，12个化合物对照品溶液的制备：
分别称取化合物1-12，精密称定，用甲醇配制成1-12号化合物含量分别为：90、300、160、80、90、170、190、120、140、100、90、100μg/ml的标准品混和溶液，即为标注储备液，4℃下储存备用。
步骤二，检测样品溶液的制备：
称取大叶蒟药材粉末或其他大叶蒟产品0.5g，加入25倍量甲醇超声提取3次(500W，40KHz)，每次20分钟，滤过，用0.45μm微孔滤膜过滤，待测定。
步骤三，含量测定：
将储备液分别按2倍、4倍、10倍、20倍、40倍、100倍、500、1000倍和10000倍稀释，分别进样10μl，绘制标准曲线和测定最低检测限(LOD)和定量限(LOQ)。
将待测样品进样10μl，通过标准曲线分别计算12个化合物的含量。
本发明的含量测定方法是通过筛选并经过验证获得的，实验内容如下：
以色谱条件A为例，进行分析方法的验证：
1.标准曲线、检测限(LOD)和定量限(LOQ)
将储备液分别按2倍、4倍、10倍、20倍、40倍、100倍、500、1000倍和10000倍稀释，分别进样10μl，绘制标准曲线和测定最低检测限(LOD)和定量限(LOQ)，结果见表1。
表112个化合物标准曲线、最低检出限及定量线
2.准确度和精密度验证
准确度以加样回收率表示，精密度用同批样品的回收率的变异系数表示，重复性以随机选取3日的平均日间变异系数表示。
以6.7倍、10倍和20倍三个水平稀释混合标准品储备溶液，按1∶1(v/v)加入大叶蒟样品中，进样10μl，HPLC分析。根据各组分的峰面积，计算相应浓度的回收率和变异系数。准确度和重复性试验随机选取3日进行测定，每日测定一批，每个浓度进行6样本分析，3日所测定的平均回收率代表该方法的准确度，3日的日内变异系数代表该方法的精密度，3日的日间变异系数代表该方法的重复性。
12个化合物的回收率为85.46-116.36％，变异系数为0.29-2.20％，日间和日内精密度均小于2.20％。
表212个酰胺类生物碱的回收率及变异系数
附图说明
附图1：色谱条件A下，大叶蒟中12个酰胺类生物碱HPLC色谱图；
附图2：色谱条件A下，大叶蒟药材提取物HPLC色谱图；
附图3：色谱条件B下，大叶蒟中12个酰胺类生物碱HPLC色谱图；
附图4：色谱条件C下，大叶蒟中12个酰胺类生物碱HPLC色谱图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
1仪器与试药
HPLC(Agilent1100高效液相色谱仪)；
Milli-Q超纯水系统(法国Millipore公司)；
超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；
大叶蒟酰胺对照品：本课题第二部分制备，纯度均大于98％。大叶蒟根、茎、叶采自海南岛(批号：20090301和20090401)。
实验试剂：色谱甲醇、色谱乙腈(色谱纯，美国Merck公司)；水(去离子水，法国Millipore公司)。
2方法与结果
色谱条件
色谱柱：C18(5μm，250mm×4.60mm)
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
吸收波长：240nm
流动相：
含量测定
步骤一，12个化合物对照品溶液的制备：
分别称取化合物1-12，精密称定，用甲醇配制成1-12号化合物含量分别为：90、300、160、80、90、170、190、120、140、100、90、100μg/ml的标准品混和溶液，即为标注储备液，4℃下储存备用。
步骤二，检测样品溶液的制备：
称取大叶蒟药材粉末或其他大叶蒟产品0.5g，加入25倍量甲醇超声提取3次(500W，40KHz)，每次20分钟，滤过，用0.45μm微孔滤膜过滤，待测定。
步骤三，含量测定：
将储备液分别按2倍、4倍、10倍、20倍、40倍、100倍、500、1000倍和10000倍稀释，分别进样10μl，绘制标准曲线。
将待测样品进样10μl，通过标准曲线分别计算12个化合物的含量。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
大叶蒟药材中12个酰胺类化合物的含量(mg/g)
注：ND-没有检测到
结果表明，12个化合物在根和茎中均能被检测到，在叶子中仅能检测到其中3、4个化合物。大叶蒟根中的化合物含量普遍高于大叶蒟茎。12个化合物中第2号化合物的含量最高，百分含量为0.1-0.2％。其余化合物百分含量均小于0.1％。
实施例2
1仪器与试药
HPLC(Agilent1100高效液相色谱仪)；
Milli-Q超纯水系统(法国Millipore公司)；
超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；
大叶蒟酰胺对照品：本课题第二部分制备，纯度均大于98％。大叶蒟根、茎、叶采自海南岛(批号：20090301和20090401)。
实验试剂：色谱甲醇、色谱乙腈(色谱纯，美国Merck公司)；水(去离子水，法国Millipore公司)。
2方法与结果
色谱条件
色谱柱：C18(2.6μm，100mm×4.60mm)
流速：0.8ml/min
柱温：30℃
吸收波长：240nm
流动相：
含量测定
步骤一，12个化合物对照品溶液的制备：
分别称取化合物1-12，精密称定，用甲醇配制成1-12号化合物含量分别为：90、300、160、80、90、170、190、120、140、100、90、100μg/ml的标准品混和溶液，即为标注储备液，4℃下储存备用。
步骤二，检测样品溶液的制备：
称取大叶蒟药材粉末或其他大叶蒟产品0.5g，加入25倍量甲醇超声提取3次(500W，40KHz)，每次20分钟，滤过，用0.45μm微孔滤膜过滤，待测定。
步骤三，含量测定：
将储备液分别按2倍、4倍、10倍、20倍、40倍、100倍、500、1000倍和10000倍稀释，分别进样10μl，绘制标准曲线。
将待测样品进样10μl，通过标准曲线分别计算12个化合物的含量。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
大叶蒟药材中12个酰胺类化合物的含量(mg/g)
注：ND-没有检测到
实施例3
1仪器与试药
HPLC(WatersUPLC超高效液相色谱仪)；
Milli-Q超纯水系统(法国Millipore公司)；
超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；
大叶蒟酰胺对照品：本课题第二部分制备，纯度均大于98％。大叶蒟根、茎、叶采自海南岛(批号：20090301和20090401)。
实验试剂：色谱甲醇、色谱乙腈(色谱纯，美国Merck公司)；水(去离子水，法国Millipore公司)。
2方法与结果
色谱条件
色谱柱：C18(1.7μm，100mm×2.10mm)
流速：0.2ml/min
柱温：30℃
吸收波长：240nm
流动相：
含量测定
步骤一，12个化合物对照品溶液的制备：
分别称取化合物1-12，精密称定，用甲醇配制成1-12号化合物含量分别为：90、300、160、80、90、170、190、120、140、100、90、100μg/ml的标准品混和溶液，即为标注储备液，4℃下储存备用。
步骤二，检测样品溶液的制备：
称取大叶蒟药材粉末或其他大叶蒟产品0.5g，加入25倍量甲醇超声提取3次(500W，40KHz)，每次20分钟，滤过，用0.45μm微孔滤膜过滤，待测定。
步骤三，含量测定：
将储备液分别按2倍、4倍、10倍、20倍、40倍、100倍、500、1000倍和10000倍稀释，分别进样2μl，绘制标准曲线。
将待测样品进样2μl，通过标准曲线分别计算12个化合物的含量。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
大叶蒟药材中12个酰胺类化合物的含量(mg/g)
注：ND-没有检测到。
Claims (8)
1.一种大叶蒟中12个酰胺类生物碱的含量测定方法，其特征在于，采用了C18色谱柱，二元洗脱系统，以及DAD检测器，用于大叶蒟及相关产品中以下12个酰胺类生物碱中任意1-12个化合物的同时测定；
化合物1：5′-甲氧基-3′,4′-次甲二氧基桂皮酸四氢吡咯；
化合物2：5-′甲氧基-3′，4′-次甲二氧基桂皮酸异丁基酰胺；
化合物3：1-[(2E,4E)-9-(3,4-次甲二氧基苯)七碳二烯酰]四氢吡咯；
化合物4：(2E,4E)-N-异丁基-9-(3,4-次甲二氧基苯)七碳二烯酰胺；
化合物5：1-[(2E,4E，7E)-9-(3,4-次甲二氧基苯)九碳二烯酰]四氢吡咯；
化合物6：1-[(2E,7E)-N-7-(3,4-次甲二氧基苯)九碳二烯酰]四氢吡咯；
化合物7：(2E,4E，7E)-N-异丁基-9-(3,4-次甲二氧基苯)九碳二烯酰胺；
化合物8：墙草碱；
化合物9：(2E,7E)-N-异丁基-7-(3,4-次甲二氧基苯)九碳二烯酰胺；
化合物10：(2E,4E)-N-异丁基-9-苯基九碳二烯酰胺；
化合物11：大叶蒟素；
化合物12：(2E,4E)-N-异丁基-11-苯基十一碳二烯酰胺；
其中，分析仪器包括HPLC或UPLC；采用梯度洗脱；
其中，所述HPLC法，流动相为：溶剂A：乙腈，溶剂B：水，梯度洗脱条件为：0min,55％A，45％B；20min,60％A，40％B；30min,90％A，10％B；32min，55％A，45％B；37min，55％A，45％B；
或，流动相为：溶剂A：甲醇，溶剂B：水，梯度洗脱条件为：0min,57％A，43％B；10min,57％A，43％B；12min,90％A，10％B；13min,57％A，43％B；16min,57％A，43％B；
所述UPLC法，流动相为：溶剂A：乙腈，溶剂B：水，梯度洗脱条件为：0min，48％A，52％B；4.5min，48％A，52％B；7min，52％A，48％B；10min，90％A，10％B；12min，48％A，52％B；14min，48％A，52％B。
2.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于所述的C18色谱柱包括填料粒径为5μm、2.6μm和1.7μm的色谱柱。
3.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于所述的检测波长范围为200-320nm。
4.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于所述HPLC色谱条件为：
A色谱柱：C18，填料粒径为5μm,250mm×4.60mm
流速：1.0ml/min
柱温：30℃
吸收波长：216nm,240nm,259nm
流动相：溶剂A：乙腈，溶剂B：水，
0min,55％A，45％B；20min,60％A，40％B；30min,90％A，10％B；32min，55％A，45％B；37min，55％A，45％B；
B色谱柱：C18，填料粒径为2.6μm,100mm×4.60mm
流速：0.8ml/min
柱温：30℃
吸收波长：216nm,240nm,259nm
流动相：溶剂A：甲醇，溶剂B：水，
0min,57％A，43％B；10min,57％A，43％B；12min,90％A，10％B；13min,57％A，43％B；16min,57％A，43％B。
5.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于所述UPLC色谱条件为：
C色谱柱：C18，填料粒径为1.7μm,100mm×2.10mm
流速：0.2ml/min
柱温：30℃
吸收波长：216nm,240nm,259nm
流动相：溶剂A：乙腈，溶剂B：水，
0min，48％A，52％B；4.5min，48％A，52％B；7min，52％A，48％B；10min，90％A，10％B；12min，48％A，52％B；14min，48％A，52％B。
6.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1
12个化合物对照品溶液的制备；
步骤2
检测样品溶液的制备；
步骤3
含量测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，经计算得到检测样品中12种化合物的含量。
7.根据权利要求6所述的含量测定方法，其特征在于，其中12个化合物对照品的制备通过以下步骤完成：
步骤一，提取：
取药材胡椒属植物大叶蒟的地上部分，粗粉碎，置于提取罐中，加入50-99％的乙醇，回流提取2小时，滤过，药渣用50-99％的乙醇，回流提取2小时，滤过，合并两次滤液，65℃减压浓缩成RD1.3-1.35的浸膏；
步骤二，粗分离：
浸膏用30-60％的乙醇溶解，加入D101大孔吸附树脂的色谱柱中，用30-60％的乙醇洗脱，洗脱液弃去，换用60-99％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，得到提取物；
步骤三，纯化制备：
提取物经拌样，加入填装有硅胶的色谱柱中，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，薄层法检测，合并同一单点化合物，得到G1-G8，其中G1经石油醚洗涤，再经乙醇-水体系重结晶得到化合物8；G2经Flash快速制备色谱分离，同上重结晶得到化合物10和化合物12；G3经石油醚洗涤，再经乙醇-水体系重结晶得到化合物11；G4同G3处理之后再经高效制备色谱分离得到化合物7和化合物9；G5同G3处理得到化合物4；G6同G3处理得到化合物2；G7经Flash快速制备色谱分离得到化合物3及化合物5和6的混合物，混合物再经高效制备色谱分离得到化合物5和化合物6；G8同G3处理得到化合物1。
8.根据权利要求6所述的含量测定方法，其特征在于，步骤如下：
步骤一，12个化合物对照品溶液的制备：
分别称取化合物1-12，精密称定，用甲醇配制成1-12号化合物含量分别为：90、300、160、80、90、170、190、120、140、100、90、100μg/ml的标准品混和溶液，即为标注储备液，4℃下储存备用；
步骤二，检测样品溶液的制备：
称取大叶蒟药材粉末或其他大叶蒟产品0.5g,加入25倍量甲醇，500W、40KHz超声提取3次，每次20分钟，滤过，用0.45μm微孔滤膜过滤，待测定；
步骤三，含量测定：
将储备液分别按2倍、4倍、10倍、20倍、40倍、100倍、500、1000倍和10000倍稀释，分别进样10μl，绘制标准曲线和测定最低检测限和定量限；
将待测样品进样10μl，通过标准曲线分别计算12个化合物的含量。
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