CN107884488B

CN107884488B - 一种大叶蒟提取物、药材及其相关产品中抗抑郁有效成分的含量测定方法

Info

Publication number: CN107884488B
Application number: CN201711057434.5A
Authority: CN
Inventors: 丁秀娟; 陈武; 朱莹莹; 季佳炜; 蒋毅
Original assignee: Suzhou Yihua Biological Medicine Technology Ltd By Share Ltd
Current assignee: Suzhou Yihua Biological Medicine Technology Ltd By Share Ltd
Priority date: 2017-11-01
Filing date: 2017-11-01
Publication date: 2019-05-03
Anticipated expiration: 2037-11-01
Also published as: CN107884488A

Abstract

本发明涉及一种大叶蒟提取物、药材及其相关产品中抗抑郁有效成分的含量测定方法，配制指标成分溶液为对照品溶液；配制供试品溶液；对供试品溶液和对照品溶液进行测定；计算指标成分的含量；根据指标成分的含量折算供试品溶液中大叶蒟提取物、药材及其相关产品中抗抑郁有效成分的含量。本发明提供的含量测定分析方法适用于对大叶蒟提取物、药材及其相关产品中多种抗抑郁有效成分的总含量进行测定，并可同时进行有效的定性和定量分析，该测定方法操作简便、快捷、准确、分离效果好，且精密度、重复性、稳定性良好。

Description

一种大叶蒟提取物、药材及其相关产品中抗抑郁有效成分的含量测定方法

技术领域

本发明属于医疗领域中的分析方法，特别是涉及一种大叶蒟提取物、药材及其相关产品中抗抑郁有效成分的含量测定方法。

背景技术

大叶蒟Piper laetispicum C.DC,为胡椒科胡椒属植物，主要分布在我国广东、广西、云南及海南省。民间用于活血、消肿、止痛，主治跌打损伤、淤血肿痛。申请人经过多年系统研究，动物实验及临床实验发现其有关提取物具有显著的抗抑郁活性，以及一定的抗焦虑、镇痛、镇静等生物活性，并且已经申请了两项与大叶蒟相关的中国发明专利及多项国际专利，其中第一项中国发明专利(专利号：ZL 03115911.7)公开了一种大叶蒟有效部位提取物的制备方法，利用该方法制备得到的大叶蒟提取物可以用于抑郁症或其它情感障碍性疾病的治疗或预防等，第二项中国发明专利(专利号：ZL 200410084791.7)公开了另外一种大叶蒟有效部位提取物的制备方法、利用该方法制备得到的大叶蒟提取物抗抑郁药理活性更佳。同时，申请人自主研发的大叶蒟相关产品正在进行临床试验中。

大叶蒟抗抑郁物质基础研究已经取得了显著的进展，大量文献报道大叶蒟中含有的多种酰胺类生物碱成分正是大叶蒟抗抑郁的物质基础。

分析方法的建立有助于加快大叶蒟及其相关产品抗抑郁物质基础的进一步研究，也为今后大叶蒟相关产品的质量研究提供技术支持。但是由于大叶蒟中生物碱成分种类繁多，结构及理化性质均比较相近，分离难度较大，因此有关大叶蒟及其相关产品有效成分含量测定分析方法鲜见报道。中国专利CN2011110318120.2同时检测大叶蒟中12个酰胺类生物碱的液相分析方法，虽然其公开了一种液相分析方法，但是该方法只是针对该专利中所涉及的12个酰胺类生物碱类化合物，并不能很好的分离大叶蒟中其它生物碱类成分以及其它非生物碱类成分。同时，由于大叶蒟中酰胺类生物碱种类繁多，涉及众多对照品，且研究发现，有的对照品如N-异丁基癸-反-2-反-4-二烯酰胺在固态极易分解，有的对照品如5’-甲氧基-3’,4’亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺在溶液状态下极不稳定，所以每次含量测定时采用常规的外标法或者标准曲线法测定总含量，使用所有的对照品同时测定太过繁杂，基本没有可行性，导致相关产品工业化生产的质量标准控制也是非常困难的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简便快捷的大叶蒟提取物、药材及其相关产品中抗抑郁有效成分的含量测定方法。

为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：

本发明的一个目的是提供一种大叶蒟提取物、药材及其相关产品中抗抑郁有效成分的含量测定方法，包括如下步骤：

(1)、配制指标成分溶液作为对照品溶液；

(2)、配制大叶蒟提取物、药材及其相关产品溶液作为供试品溶液；

(3)、利用高效液相色谱对所述的供试品溶液和所述的对照品溶液进行测定；

(4)、计算所述的指标成分的含量；

(5)、根据所述的指标成分的含量折算所述的供试品溶液中抗抑郁有效成分的含量。

优选地，所述的指标成分为5’-甲氧基-3’,4’-亚甲基二氧基桂皮酸四氢吡咯、3’,4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺、5’-甲氧基-3’,4’亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺、1-[(2E)-5-(3,4-亚甲基二氧苯基)]四氢吡咯、4,5-二氢荜拨明宁碱、芝麻素、(2E,6E)-N-异丁基-7-(3，4-次甲二氧苯基)七碳二烯酰胺、(2E,4E,7E)-N-异丁基-9-(3，4-次甲二氧苯基)九碳二烯酰胺、N-异丁基癸-反-2-反-4-二烯酰胺、1-[(2E,4E)-2,4-癸二烯酰]四氢吡咯、(2E,4E,9E)-N-异丁基-11-(3，4-次甲二氧苯基)十一碳二烯酰胺、(2E,4E)-N-异丁基十二碳-2，4-二烯酰胺、(2E,4E)-N-异丁基-13-苯基-2，4-二烯酰胺、(2E,4E)-N-异丁基-15-苯基-2，4-二烯酰胺、(2E,4E,14Z)-N-异丁基二十烷-2,4,14-三烯酰胺中的一种或多种。

进一步优选地，所述的指标成分为3’,4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺和/或5’-甲氧基-3’,4’亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺。

最为优选地，所述的指标成分为3’,4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺。

本发明中，大叶蒟提取物、大叶蒟药材、或者大叶蒟的相关产品以甲醇进行超声溶解、过滤得到所述的供试品溶液。

本发明中，大叶蒟提取物包括大叶蒟粗提物和大叶蒟精提物，当采用大叶蒟粗提物配制所述的供试品溶液时，所述的供试品溶液的浓度为4～10mg/mL；当采用大叶蒟精提物配制所述的供试品溶液时，所述的供试品溶液的浓度为0.5～1.5mg/mL。

根据一种实施方式，所述的大叶蒟粗提物的制备方法为：取大叶蒟药材经前处理后，加乙醇以回流、浸渍、渗漉、超声中任意一种提取方法进行提取，浓缩干燥，获得所述的大叶蒟提取物。

根据一种实施方式的优选方式，所述的大叶蒟粗提物的制备方法为：将大叶蒟药材进行切制或粉碎后，用适量体积浓度为80％～95％的乙醇进行浸渍20～30小时，然后补加体积浓度为80％～95％的乙醇至大叶蒟药材重量的10-30倍，渗漉提取得大叶蒟提取液，浓缩干燥，得到大叶蒟提取物。

根据另一种实施方式，所述的大叶蒟精提物的制备方法为：取大叶蒟药材，经前处理后，加乙醇以回流、浸渍、渗漉、超声中任意一种提取方法进行提取，获得粗提物，然后以大孔树脂进行有效成分的富集、纯化和精制，浓缩干燥，得到以酰胺类生物碱为主的有效部位提取物即为所述的大叶蒟提取物。

根据另一种实施方式的优选方式，所述的大叶蒟精提物的制备方法为：

步骤(1)、将大叶蒟药材进行切制或粉碎后，加入10～30倍大叶蒟药材重量的体积浓度为80％～95％的乙醇进行浸渍或渗漉得粗提液；

步骤(2)、将步骤(1)得到的粗提液浓缩至含醇量为35％～45％，并控制浓缩温度不超过70℃；

步骤(3)、将经步骤(2)浓缩后的粗提液上非极性或中极性大孔吸附树脂柱，依次用2～6倍大叶蒟药材重量的体积浓度为30％～50％的乙醇溶液、50％～70％的乙醇溶液进行洗脱，弃去洗脱液；

步骤(4)、再用4～8倍大叶蒟药材重量的体积浓度为80％～95％的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩至褐色黏稠状浸膏，真空干燥并控制温度不超过70℃，得到所述的大叶蒟提取物。

根据又一种实施方式，所述的供试品溶液的制备方法为：取大叶蒟药材，粉碎，过2号筛，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇适量，室温超声处理30分钟，取出振摇，溶液转移至容量瓶中，药渣加甲醇适量，同上，重复超声处理2次，合并溶液，转移至同一容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经微孔滤膜滤过得到所述的供试品溶液。

根据又一种实施方式的优选方式，所述的供试品溶液的具体制备方法为：取大叶蒟药材2g，粉碎，过2号筛，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇50ml，室温超声处理30分钟，取出振摇，溶液转移至100ml容量瓶中，药渣加甲醇20ml，同上，重复超声处理2次，合并溶液，转移至同一容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经微孔滤膜滤过得到所述的供试品溶液。

优选地，所述的高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱为反相色谱柱、检测器为DAD检测器或紫外检测器、流动相为甲醇-乙腈-水体系或甲醇-水体系或乙腈-水体系，洗脱程序为梯度洗脱或等度洗脱，柱温20-40℃，检测波长为210-320nm。

进一步优选地，所述的高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱为C18柱、检测器为DAD检测器、流动相为甲醇-乙腈-水体系，洗脱程序为梯度洗脱，柱温30-40℃，检测波长为210-280nm。

更为优选地，所述的高效液相色谱的色谱条件为：

色谱柱：C18(4.6mm×250mm，5.0μm)

流速：1mL/min

柱温：柱温40℃

检测波长：240nm

流动相：甲醇-乙腈-水

洗脱程序：梯度洗脱

时间(min)	甲醇(％)	乙腈(％)	水(％)
				0	10	0	90
30	50	50	0
				35	50	50	0
45	10	0	90

最为优选地，所述的色谱柱为Prontosil 120-5-C18-SH色谱柱。

具体地，所述的指标成分的含量的计算方法为外标法或标准曲线法。

具体地，所述的大叶蒟提取物、药材及其相关产品中抗抑郁有效成分包括如下化合物：

化合物1：5’-甲氧基-3’,4’-亚甲基二氧基桂皮酸四氢吡咯，

化合物2：3’,4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺，

化合物3：5’-甲氧基-3’,4’亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺，

化合物4：1-[(2E)-5-(3,4-亚甲基二氧苯基)]四氢吡咯，

化合物5：4,5-二氢荜拨明宁碱，

化合物6：芝麻素，

化合物7：(2E,6E)-N-异丁基-7-(3，4-次甲二氧苯基)七碳二烯酰胺(风藤酰胺)，

化合物8：(2E,4E,7E)-N-异丁基-9-(3，4-次甲二氧苯基)九碳二烯酰胺，

化合物9：N-异丁基癸-反-2-反-4-二烯酰胺，

化合物10：1-[(2E,4E)-2,4-癸二烯酰]四氢吡咯，

化合物11：(2E,4E,9E)-N-异丁基-11-(3，4-次甲二氧苯基)十一碳二烯酰胺(大叶蒟素)，

化合物12：(2E,4E)-N-异丁基十二碳-2，4-二烯酰胺，

化合物13：(2E,4E)-N-异丁基-13-苯基-2，4-二烯酰胺，

化合物14：(2E,4E)-N-异丁基-15-苯基-2，4-二烯酰胺，

化合物15：(2E,4E,14Z)-N-异丁基二十烷-2,4,14-三烯酰胺。

本发明中，所述的大叶蒟提取物、药材及其相关产品中抗抑郁有效成分中化合物1至15的提取方法包括如下步骤：

步骤1，提取：取胡椒属植物大叶蒟根及根茎切成段状，粗粉碎，置于渗漉桶中，加入20倍药材量体积浓度为95％的乙醇，渗漉提取得粗提液；

步骤2，萃取：粗提液浓缩至无醇味，以乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取物。

步骤3，乙酸乙酯萃取物经硅胶拌样，加入填有硅胶的色谱柱中，用石油醚-丙酮梯度洗脱，反复柱层析，薄层法检测，合并同一单点化合物，得馏分P1-P4，P1经中压制备色谱分离、反复重结晶得化合物1-4，P2经进一步柱层析、高效液相制备色谱分离得化合物9、化合物10，P3经进一步重结晶得到化合物5，P4经再次硅胶柱层析，薄层法检测，合并同一单点化合物到馏分Q1-Q3，Q1经重结晶得到化合物6，Q2经高效制备色谱分离的化合物7、化合物8、化合物11，Q3经高效制备色谱分离的化合物12-15；

由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明提供的含量测定分析方法适用于对大叶蒟提取物、药材及其相关产品中多种抗抑郁有效成分的总含量进行测定，并可同时进行有效的定性和定量分析，该测定方法操作简便、快捷、准确、分离效果好，且精密度、重复性、稳定性良好，有助于加快大叶蒟抗抑郁有效成分的进一步研究，也为今后大叶蒟相关产品的质量控制提供技术支持。

附图说明

附图1为本发明大叶蒟提取物中抗抑郁活性成分的含量测定HPLC图谱，15个色谱峰从左到右依次为化合物1～15；

附图2为附图1的局部放大图；

附图3为实施例2的线性回归曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 高效液相含量测定方法考察

1、对照品溶液的制备

步骤4，精密称取化合物1-15各对照品适量，分别配制成浓度为1.0mg/ml的对照品溶液。

2、供试品溶液的制备

按下述方法制备供试品溶液6批，批次编号分别为EX.1-EX.6。

称取大叶蒟药材1kg，粉碎机打成粗粉，过2号筛，精密称定，置渗漉桶中，加入体积浓度为95％乙醇适量常温浸渍24小时，然后加入同浓度乙醇至药材量的20倍，进行渗漉得粗提液，粗提液浓缩至含醇量为40％，上样于已经处理好的D101大孔树脂柱，流穿后依次以4倍量体积浓度为40％的乙醇溶液、2倍量体积浓度为60％乙醇溶液洗脱，洗脱液弃去；继续用6倍量体积浓度为95％乙醇洗脱，收集95％的乙醇洗脱液，浓缩干燥，得到大叶蒟提取物，取提取物约40mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加甲醇至近刻度，超声使溶解，取出加甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜滤过，即得。

3、高效液相含量测定分析方法的研究

3.1 色谱柱的选择：由于大叶蒟及其相关产品中抗抑郁有效成分主要为酰胺类生物碱，所以在色谱条件考察时选择以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱为主。

发明人依次考察了Kromasil 100-5 C18色谱柱、ZORBAX SB-C18色谱柱、Dikma-C18色谱柱及Prontosil 120-5-C18-SH色谱柱，经对比分析，发现Prontosil 120-5-C18-SH色谱柱的分离效果比较理想。

3.2 流动相的选择：分别考察了甲醇-水，乙腈-水，甲醇-乙腈-水等流动相系统，结果经试验比较优选甲醇-乙腈-水系统，然后又考察了等度洗脱及梯度洗脱程序，经试验比较，优选甲醇-乙腈-水梯度洗脱各成分分离效果最佳。

3.3 柱温及流速的选择：依次考察了20℃、30℃、35℃、40℃、45℃不同柱温，以及0.8、1.0、1.2、1.5ml/min不同流速对各成分分离效果的影响，经试验比较，优选柱温40℃，流速1.0ml/min时，分离效果最佳。

3.4 检测器及检测波长选择：选用全波长扫描，结果测得各成分在240nm处均有较大吸收，因此选择在240nm波长下进行检测。

3.5 含量测定方法考察

3.5.1 仪器和试剂

仪器：采用Agilent 1200高效液相色谱仪，Chemstation Edition色谱工作站。

试剂：化合物1-15对照品，均为自制，纯度≧98％。

甲醇：色谱纯甲醇；乙腈：色谱纯乙腈；水：哇哈哈纯净水。

3.5.2 色谱条件

色谱柱：Prontosil 120-5-C18-SH；流动相：甲醇-乙腈-水；流速：1ml/min；柱温：40℃；检测器：DAD检测器；检测波长：240nm；进样量：10μl；梯度洗脱程序见表1。

表1

Time(min)	甲醇(％)	乙腈(％)	水(％)
				0	10	0	90
30	50	50	0
				35	50	50	0
45	10	0	90

4、化合物1-15线性关系考察

精密量取按上述1项制得的化合物1-15对照品溶液适量，置10ml棕色容量瓶中，加甲醇稀释，定容，摇匀，即得混合对照品溶液，再将混合对照品溶液用甲醇稀释成不同浓度对照品溶液，制备成标准曲线所需的6个浓度的混合对照品溶液，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图，以峰面积(y)为纵坐标，浓度(x)为横坐标进行线性回归，结果表明各成分在相应浓度范围内成良好的线性关系，线性范围、回归方程、相关系数见表2。

表2

5、大叶蒟提取物中抗抑郁有效成分化合物1-15总含量的测定

吸取按上述2项制备的供试品溶液10ul，注入液相色谱仪，进行测定，HPLC图谱参见图1。

6、含量计算

6.1 外标法：取各对照品一定浓度的峰面积作为样品中各成分相应的“点”，经计算，累加而得提取物中化合物1-15总含量。

6.2 标准曲线测定法：提取物中各成分以其经线性关系考察过的各回归方程计算，然后累加而得样品提取物中化合物1-15总含量。

以HPLC外标法和标准曲线法分别测定大叶蒟提取物EX.1-EX.6中抗抑郁有效成分化合物1-15的总含量结果见表3。表3数据显示，运用外标法和标准曲线法对大叶蒟提取物中化合物1-15总含量的测定结果差异不大，即运用HPLC外标法和标准曲线法对大叶蒟提取物进行含量测定能够比较客观地反映大叶蒟提取物中化合物1-15的总含量。本申请中，各化合物的含量以及大叶蒟提取物中有效成分的总含量均为质量百分比含量。

表3

7、以化合物2即3’,4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺为指标对照，折算大叶蒟提取物中化合物1-15总含量

虽然运用HPLC外标法和标准曲线法对大叶蒟提取物进行含量测定能够比较客观地反映大叶蒟提取物中化合物1-15的总含量。但是以上2种含量测定方法涉及的对照品数量多达15个，发明人在对化合物1-15的研究中发现，某些化合物稳定性较差，如化合物9即N-异丁基癸-反-2-反-4-二烯酰胺在固态下极易分解，化合物1即5’-甲氧基-3’,4’-亚甲基二氧基桂皮酸四氢吡咯、化合物3即5’-甲氧基-3’,4’亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺等在溶液状态下很不稳定，某些化合物如化合物15(2E,4E,14Z)-N-异丁基二十烷-2,4,14-三烯酰胺在大叶蒟药材及提取物中含量较低，对照品的制备也有一定的困难，所以每次含量测定时采用常规的外标法或者标准曲线法，使用所有的15个对照品进行对照，累加计算大叶蒟提取物中化合物1-15的总含量太过繁杂，也不太现实，这对大叶蒟相关产品工业化生产的质量标准控制也是非常困难的。

大叶蒟中抗抑郁活性成分大多为酰胺类生物碱成分，结构相似，最大紫外吸收波长相近甚至相同，因此，发明人认为从化合物1-15中，选择其中1个成分作为含量测定指标，折算15个化合物的总含量，是简单可行的方法，因此，发明人分别以化合物1-15作为指标对照品，折算大叶蒟提取物EX.1-EX.6中化合物1-15的总含量，含量测定结果见表4。表4数据显示，分别以化合物1-15为指标进行含量测定折算时，以化合物5、化合物6和化合物8为指标时的偏差特别大，以化合物7、化合物9和化合物10为指标折算总含量与真实值偏差也比较大，化合物11、化合物12、化合物13、化合物14、和化合物15在大叶蒟药材及提取物中含量偏低，且在高效液相色谱色谱图中保留时间靠后，在梯度洗脱程序中，色谱图基线容易漂移，仪器自动积分时，峰面积系统误差较大，所得数据容易失真，所以不予考虑。化合物1、化合物2、化合物3、化合物4偏差较小，以之作为指标对照折算化合物1-15总含量，能够比较真实，客观的反应出提取物的实际总含量，而化合物1、化合物3、化合物4在溶液状态下不如化合物2稳定，所以发明人认为优选化合物2即3’,4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺作为指标对照品，折算大叶蒟提取物中化合物1-15总含量最为客观。

实施例2、高效液相含量测定方法学验证

1、色谱条件与系统适应性

色谱柱：Prontosil 120-5-C18-SH,4.6×250mm,5.0um；流动相：甲醇-乙腈-水；梯度洗脱；流速：1ml/min；柱温：40℃；检测器：DAD检测器；检测波长：240nm；梯度洗脱程序见表5：

表5

理论塔板数按以3’,4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺计应不低于20000。

2、线性关系考察

精密量取按实施例1第1项制得的3’,4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺对照品溶液适量，用甲醇稀释成不同浓度对照品溶液，制备成标准曲线所需的6个浓度的对照品溶液，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图，以峰面积(y)为纵坐标，浓度(x)为横坐标进行线性回归，线性回归曲线见附图3，结果表明3’,4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺在相应浓度范围内成良好的线性关系，回归方程为：y＝34336x+46.366R²＝0.9999(n＝6)。

3、仪器精密度试验

精密称取对照品3’,4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺3.0mg，置100ml容量瓶中，加甲醇至近刻度，超声处理使溶解，补加甲醇至刻度，摇匀。按上述色谱条件和系统适应性项下的色谱条件进行测定，重复进样6次，进样量10ul，测得峰面积，计算RSD。结果，测得RSD值为0.973％，表明仪器精密度良好。

4、重复性试验

按实施例1第2项的方法制备大叶蒟提取物，并从该大叶蒟提取物中取9份，设计3个不同浓度，每个浓度分别按实施例1第2项的方法制备成3份供试品溶液，按上述色谱条件和系统适应性项下的色谱条件进行测定，进样量10ul，记录色谱图，计算化合物3’,4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺的平均含量为2.023％，RSD为1.743％。结果显示本方法重复性良好。

5、稳定性试验

取实施例1第2项制得的大叶蒟提取物供试品溶液，在室温条件下，分别于0、2、4、6、8、12h按上述色谱条件和系统适应性项下的色谱条件进行测定，记录色谱图，测定化合物3’,4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺峰面积及化合物1-15总的峰面积，计算RSD分别为2.680％和2.514，结果显示供试品溶液在12小时内稳定性良好。

6、准确度试验

取同一批号已知含量大叶蒟提取物9份，设计3个不同浓度，每个浓度分别制备3份供试品溶液，加甲醇时加入近刻度，然后3个浓度中分别按提取物中对照品3’,4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺实际含量的约80％、100％和120％精密加入一定量的对照品，超声处理使溶解，取出加甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜滤过，即得，吸取10μl注入液相色谱仪进行测定。

回收率＝(测得对照品总量-提取物所含对照品的量)/加入对照品的量×100％。

计算低、中、高3个加入量的平均回收率，结果见表6，结果显示，方法的准确度较好。

表6

实施例3 大叶蒟提取物中抗抑郁活性成分含量测定

1、色谱条件：

色谱仪器：采用Agilent 1200高效液相色谱仪，Chemstation Edition色谱工作站；色谱柱：Prontosil 120-5-C 18-SH；流动相：甲醇-乙腈-水；流速：1ml/min；柱温：40℃；检测器：DAD检测器；检测波长：240nm；进样量：10μl；梯度洗脱程序见表7：

表7

2、对照品溶液的制备：

称取化合物3’,4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺和5’-甲氧基-3’,4’亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺对照品适量，精密称定，置100ml容量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，取出，加甲醇至刻度，配制成浓度分别为0.02mg/mL和0.16mg/mL的混合对照品溶液。

3、供试品溶液的制备：

按照下述方法制备3批供试品溶液，编号分别为A、B、C。

称取大叶蒟药材1kg，粉碎机打成粗粉，过2号筛，精密称定，置渗漉桶中，加入体积浓度为95％乙醇适量常温浸渍24小时，然后加入同浓度乙醇至药材量的20倍，进行渗漉得粗提液，粗提液浓缩至含醇量为40％，上样于已经处理好的D101大孔树脂柱，流穿后依次以4倍量体积浓度为40％的乙醇溶液、2倍量体积浓度为60％乙醇溶液洗脱，洗脱液弃去；继续用6倍量体积浓度为95％乙醇洗脱，收集95％的乙醇洗脱液，浓缩干燥，得到大叶蒟提取物。

取大叶蒟提取物约40mg，精密称定，置50ml棕色容量瓶中，加甲醇至近刻度，将容量瓶置超声波清洗仪超声处理使溶解，取出加甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

4、样品测定：按上述色谱条件，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算化合物3’,4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺(化合物2)和5’-甲氧基-3’,4’亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺(化合物3)的含量及化合物1-15总含量(Total)。结果见表8。

表8

Compound	A	B	C
				化合物2(％)	4.622	4.902	4.330
化合物3(％)	21.344	21.907	20.275
				Total(％)	64.869	65.839	60.819

实施例4 大叶蒟提取物中抗抑郁活性成分含量测定

1、色谱条件：

色谱仪器：采用Agilent 1200高效液相色谱仪，Chemstation Edition色谱工作站；色谱柱：Prontosil 120-5-C18-SH；流动相：甲醇-乙腈-水；流速：1ml/min；柱温：40℃；检测器：DAD检测器；检测波长：240nm；进样量：10μl；梯度洗脱程序见表9：

表9

2、对照品溶液的制备

称取化合物3’,4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺和5’-甲氧基-3’,4’亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺对照品适量，精密称定，置100ml容量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，取出，加甲醇至刻度，配制成浓度为0.02mg/mL和0.16mg/mL的混合对照品溶液。

3、供试品溶液的制备

按下述方法制得供试品溶液3批，编号分别为D、E、F。

称取大叶蒟药材1kg，粉碎机打成粗粉，过2号筛，精密称定，置渗漉桶中，加入体积浓度为95％乙醇适量常温浸渍24小时，然后加入同浓度乙醇至药材量的20倍，进行渗漉得大叶蒟提取物液，浓缩干燥，得到大叶蒟提取物。

取大叶蒟提取物约40mg，精密称定，置10ml棕色容量瓶中，加甲醇至近刻度，将容量瓶置超声波清洗仪超声处理使溶解，取出加甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

4、样品测定：

按上述色谱条件，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算化合物3’,4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺(化合物2)和5’-甲氧基-3’,4’亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺(化合物3)的含量及化合物1-15总含量(Total)。结果见表10。

表10

Compound	D	E	F
				化合物2(％)	1.968	1.359	1.414
化合物3(％)	11.225	5.662	6.407
				Total(％)	29.396	14.990	17.877

实施例5 大叶蒟药材中抗抑郁活性成分含量测定

1、色谱条件：

色谱仪器：采用Agilent 1200高效液相色谱仪，Chemstation Edition色谱工作站；

色谱柱：Prontosil 120-5-C18-SH；流动相：甲醇-乙腈-水；流速：1ml/min；柱温：40℃；检测器：DAD检测器；检测波长：240nm；进样量：20μl；梯度洗脱程序见表11：

表11

2、对照品溶液的制备：

3、供试品溶液的制备：

按下述方法制得供试品溶液4批，批号分别为1、2、3、4。

称取大叶蒟药材约2g，粉碎机打成粗粉，过2号筛，精密称定，置具塞锥形瓶中，加分析纯甲醇约50ml，室温超声处理(功率160W，频率59kHz)30分钟，取出振摇，溶液转移至100ml棕色容量瓶中，药渣加分析纯甲醇20ml同上，重复超声处理2次，合并溶液，转移至同一容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得供试品溶液。

4、样品测定：按上述色谱条件，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20ul，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算化合物3’,4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺(化合物2)和5’-甲氧基-3’,4’亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺(化合物3)的含量及化合物1-15总含量(Total)。结果见表12。

表12

Compound	批次1	批次2	批次3	批次4
					化合物2(％)	0.114	0.108	0.103	0.107
化合物3(％)	0.476	0.398	0.419	0.442
					Total(％)	1.345	1.254	1.276	1.307

实施例6：大叶蒟相关产品中抗抑郁活性成分含量测定

1、色谱条件：

色谱仪器：采用Agilent 1200高效液相色谱仪，Chemstation Edition色谱工作站；色谱柱：Prontosil 120-5-C18-SH；流动相：甲醇-乙腈-水；流速：1ml/min；柱温：40℃；检测器：DAD检测器；检测波长：240nm；进样量：10μl；梯度洗脱程序见表13：

表13

2、对照品溶液的制备

3、供试品溶液的制备：

按照下述方法制备3批供试品溶液，编号分别为A、B、C。

将大叶蒟提取物作为药物原料，按照药学领域的常规生产方法制备成规格为0.2g/粒(每粒含大叶蒟提取物20mg)的胶囊剂。

取大叶蒟提取物胶囊内容物约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50ml甲醇，密塞，称定重量，超声处理使溶解，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀、滤过即得供试品溶液。

4、样品测定：按上述色谱条件，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算化合物3’,4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺(化合物2)和5’-甲氧基-3’,4’亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺(化合物3)的含量及化合物1-15总含量(Total)。结果见表14。

表14

Compound	A	B	C
				化合物2(％)	0.469	0.456	0.441
化合物3(％)	2.043	1.995	1.970
				Total(％)	6.129	5.963	5.728

以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种大叶蒟提取物、药材及其相关产品中抗抑郁有效成分的含量测定方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）、配制指标成分溶液作为对照品溶液；

（2）、配制大叶蒟提取物、药材及其相关产品溶液作为供试品溶液；

（3）、利用高效液相色谱对所述的供试品溶液和所述的对照品溶液进行测定；

（4）、计算所述的指标成分的含量；

（5）、根据所述的指标成分的含量折算所述的供试品溶液中抗抑郁有效成分的含量；

所述的指标成分为3’, 4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺；

所述的高效液相色谱的色谱条件为：检测器为DAD 检测器或紫外检测器，

色谱柱：C18(4.6mm×250mm，5.0μm)

流速：1mL/min

柱温：柱温 40℃

检测波长：240nm

流动相：甲醇-乙腈-水

洗脱程序：梯度洗脱

时间（min）甲醇（%）乙腈（%）水(%) 0 10 0 90 30 50 50 0 35 50 50 0 45 10 0 90

所述的大叶蒟提取物、药材及其相关产品中抗抑郁有效成分包括如下化合物中化合物2与其它任意1个或几个化合物的组合：

化合物1：5’-甲氧基-3’, 4’-亚甲基二氧基桂皮酸四氢吡咯，

化合物2：3’, 4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺，

化合物4：1-[(2E)-5-(3,4-亚甲基二氧苯基)]四氢吡咯，

化合物5：4,5-二氢荜拨明宁碱，

化合物6：芝麻素，

化合物7：(2E,6E)-N-异丁基-7-（3，4-次甲二氧苯基）七碳二烯酰胺，

化合物8：(2E,4E,7E)-N-异丁基-9-（3，4-次甲二氧苯基）九碳二烯酰胺，

化合物9：N-异丁基癸-反-2-反-4-二烯酰胺，

化合物10：1-[(2E,4E)-2,4-癸二烯酰]四氢吡咯，

化合物11：(2E,4E,9E)-N-异丁基-11-（3，4-次甲二氧苯基）十一碳二烯酰胺，

化合物12：(2E,4E)-N-异丁基十二碳-2，4-二烯酰胺，

化合物13：(2E,4E)-N-异丁基-13-苯基-2，4-二烯酰胺，

化合物14：(2E,4E)-N-异丁基-15-苯基-2，4-二烯酰胺，

化合物15：(2E, 4E, 14Z) -N-异丁基二十烷-2,4,14-三烯酰胺；

所述的供试品溶液中抗抑郁有效成分的总含量的计算公式为（总峰面积值÷3’, 4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺的峰面积值）×3’, 4’-亚甲基二氧基桂皮酸异丁基酰胺的含量。

2.根据权利要求1所述的大叶蒟提取物、药材及其相关产品中抗抑郁有效成分的含量测定方法，其特征在于：大叶蒟提取物、大叶蒟药材、或者大叶蒟的相关产品以甲醇进行超声溶解、过滤得到所述的供试品溶液。

3.根据权利要求2所述的大叶蒟提取物、药材及其相关产品中抗抑郁有效成分的含量测定方法，其特征在于：所述的大叶蒟提取物的制备方法为：取大叶蒟药材经前处理后，加乙醇以回流、浸渍、渗漉、超声中任意一种提取方法进行提取，浓缩干燥，获得所述的大叶蒟提取物；或者，取大叶蒟药材，经前处理后，加乙醇以回流、浸渍、渗漉、超声中任意一种提取方法进行提取，获得粗提物，然后以大孔树脂进行有效成分的富集、纯化和精制，浓缩干燥，得到以酰胺类生物碱为主的有效部位提取物即为所述的大叶蒟提取物。

4.根据权利要求1所述的大叶蒟提取物、药材及其相关产品中抗抑郁有效成分的含量测定方法，其特征在于：所述的指标成分含量的计算方法为外标法或标准曲线法。

5.根据权利要求1或2所述的大叶蒟提取物、药材及其相关产品中抗抑郁有效成分的含量测定方法，其特征在于：所述的大叶蒟药材包括大叶蒟地上部分、地下部分或全株，所述的大叶蒟相关产品包括大叶蒟相关制剂。