CN101825617A - 气相色谱/质谱联和高效液相色谱测定中药里安定成分的方法 - Google Patents
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Abstract
一种气相色谱/质谱联和高效液相色谱测定中药里安定成分的方法是采用溶剂抽提，气相色谱/质谱联合高液相色谱的对中药里安定成分的测定分析法。所用气相色谱采用DB-5MS柱，30米长，0.25毫米内径的色谱柱，液相色谱分析采用了3个色谱柱串联。这使色谱分析呈现了高分辨特性，确保了准确定性。样品制备采用乙醇试剂，对人无毒，有利环保。液相色谱流动相也采用乙醇，避免了分析中制备样品的沉淀也有利环境保护。中药成分极其复杂，分离和鉴定都较困难，本方法开拓了中药中安定成分的检测方法。
Description
技术领域
本发明属于一种测定中药里安定成分的方法，具体涉及一种气相色谱/质谱联和高效液相色谱测定中药里安定成分的方法。
背景技术
目前世界上，有不少神经疾病患者。其表现是较严重的焦虑、失眠、惊厥、癫癎等。他们常常需要使用一些安定情绪的药品。治疗神经疾病的药物有几十种。其中，西药是化学合成的，有一定组成结构和较固定的分析方法。我国是中药发源地，中药来源丰富，常常也有较好的疗效。但目前许多中药的成分不为人知，严重影响它的利用。为保护和开发我国的中药资源，建立一些现代化的分析方法，搞清楚中药的成分是有必要的，经检索，未发现对中药里安定成分的测定方法的文献报导。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用溶剂抽提，气相色谱/质谱联合高液相色谱的对中药里安定成分的测定分析法。
本发明所指中药里安定成分是指具有一定结构的，与西药对应的对神经有稳定作用的成分。
本发明具体的测定分析法包括如下步骤：
一、测定仪器和实施条件：
①.Waters Breeze 1525高效液体色谱仪，美国制造，仪器配有Waters1525Binary高效液体色谱泵，Dualλ2487紫外检测器，色谱柱型号为VP-ODS SHIMADZU，4.6x150mm，3个色谱柱，日本制造，分析中以3个色谱柱串联使用，色谱流动相为乙醇，流速0.6毫升/分，色谱柱压为2400PSI，柱温14℃，紫外波长选在254nm；
②菲尼根跟踪气相色谱/质谱(GC-MS)分析仪由美国菲尼根公司提供，气相色谱/质谱分析的条件：色谱柱是一个DB-5MS柱，30米长，0.25毫米内径，薄膜厚度为0.25毫。载气为氦气1.0ml/min，初始温度为70℃，保持4分钟，然后以10℃/分钟上升率，最后加热至250℃，停留3分钟，电子轰击为70电子伏，原子质量范围为30-350；
③试剂和样品
试剂乙醇为分析纯试剂，由天津市博迪化工有限公司生产；中药：路路通，云南制药厂生产；枣仁安神颗粒，黑龙江济仁药业有限公司生产；
外标物为西药(说明书中具有安定作用)：纯舒乐安定，其来自艾司唑仑片(Estazolam Tablets)，化学名为6-苯基-8-氯-4H-〔1，2，4〕-三氮唑〔4，3-α(1，4)苯并二氮杂卓定，天津太平洋制药有限公司生产；纯氯硝安定，来自氯硝西泮片(Clonazepam Tablets)，化学名为1，3-二氢-7-硝基-5-(2-氯苯基)-2H-1，4-苯并二氮杂卓-2-酮，由江苏恩华药业股份有限公司生产；
二、中药中安定成分的分析方法
(1)中药成分的抽提和制备
将中药研磨成粉末，称取0.1-0.5克，将其置于50毫升三角瓶中，加入50毫升乙醇，将三角瓶置于超声波设备中，进行1小时处理，再放置24小时，过滤，以清液进行仪器分析；
(2)中药中安定成分的定性分析
(一)、色谱/质谱(GC/MS)定性
①色谱保留值定性法：在相同的色谱条件下，中药分离谱图中的组分，若其色谱保留时间和对应的纯试剂的色谱保留时间是一致的，说明中药具有对应外标物的安定成分；若其色谱保留时间和对应的纯试剂的色谱保留时间不同，说明中药不具有对应外标物的安定成分；
②质谱比较定性法：中药分离谱图中的组分，若其质谱特征图和所对应的纯试剂的质谱特征图是基本一致，即其质谱图的质荷比(m/z)相同，并具有较高的匹配度，说明中药具有对应外标物的安定成分。若其质谱特征图和对应的纯试剂的质谱特征图不同，说明中药不具有对应外标物的安定成分；
关于GC/MS定性的补充说明：通常，对一个未知物的分离谱图的每个色谱峰，GC/MS仪器都可以给出可能的化合物，和相应的匹配度。有时候，这种定性是亦是准确的，甚至不需要纯试剂再核实。但本工作对所确定的组分还以纯化合物进行了再核实。因为这种多种定性总是更为准确，周全。
(二)、高效液相色谱(HPLC)定性：以HPLC分离中药时，对所确定的成分，若其色谱保留时间和对应的纯试剂的色谱保留时间是一致，说明中药具有对应外标物的安定成分。若其色谱保留时间和对应的纯试剂的色谱保留时间不一致的，说明中药不具有对应外标物的安定成分；
(3)中药成分的定量测定
在前述定性的基础上，采用高效液相色谱外标法定量，以所确定中药成分的对应试剂为外标物，其制备如下：
将外标物研磨成粉末，称取0.01-0.05克，置其于50毫升三角瓶中，加入50毫升乙醇。将三角瓶置于超声波设备中，进行1小时的处理，放置24小时。过滤，取清液进行仪器分析，过程中滤纸和三角瓶都需要称重以计算真正的溶解浓度。
外标法定量时，其计算公式如下
W％＝R样/R外标×C外标/C样×V外标/V样×100％-----------------------(1)
式中W％代表中药成分中所含安定成分的重量百分含量，R样代表中药中所含安定成分的HPLC响应值，R外标代表外标安定的HPLC响应值，C外和C样分别代表外标和中药所配制的浓度(克/毫升)，V外标和V样分别代表外标和中药在色谱分析中的进样量(微升)
本发明的特点
1.建立了一个分析方法，此法可以鉴别中药中的安定成分。
2.所用气相色谱采用DB-5MS柱，30米长，0.25毫米内径的色谱柱，液相色谱分析采用了3个色谱柱串联。这使色谱分析呈现了高分辨特性，确保了准确定性。样品制备采用乙醇试剂，对人无毒，有利环保。液相色谱流动相也采用乙醇，避免了分析中制备样品的沉淀也有利环境保护。
3.中药成分极其复杂，分离和鉴定都较困难，本方法开拓了中药中安定成分的检测方法。
附图说明
图1纯氯硝安定的分子结构图
图2气质分析中枣仁安神颗粒的分离图
图3气质分析中纯氯硝安定的分离图
图4气质分析中枣仁安神补脑剂所确定氯硝安定的质谱图
图5气质分析中纯氯硝安定的质谱图
图6中药枣仁安神颗粒的高效液相色谱分离谱图
图7纯氯硝安定的高效液相色谱分离谱图
图8纯舒乐安定的分子结构图
图9气质分析中路路通中药的分离图
图10气质分析中纯舒乐安定的分离图
图11气质分析中路路通中舒乐安定成分的质谱图
图12气质分析中纯舒乐安定的质谱图
图13中药路路通的高效液相色谱分离谱图
图14纯舒乐安定的高效液相色谱分离谱图
具体实施方式
实施例1：枣仁安神颗粒的测定
一.测定仪器和实施条件：
①.Waters Breeze 1525高效液体色谱仪，美国制造，仪器配有Waters1525Binary高效液体色谱泵，Dualλ2487紫外检测器，色谱柱型号为VP-ODS SHIMADZU，4.6x150mm，日本制造，分析中以3个色谱柱串联使用，色谱流动相为乙醇，流速0.6毫升/分，色谱柱压为2400PSI，柱温14℃，紫外波长选在254nm；
②菲尼根跟踪气相色谱/质谱(GC-MS)分析仪由美国菲尼根公司提供，气相色谱/质谱分析的条件：色谱柱是一个DB-5MS柱，30米长，0.25毫米内径，薄膜厚度为0.25毫。载气为氦气1.0ml/min，初始温度为70℃，保持4分钟，然后以10℃/分钟上升率，最后加热至250℃，停留3分钟，电子轰击为70电子伏，原子质量范围为30-350；
③试剂和样品
试剂乙醇为分析纯试剂，由天津市博迪化工有限公司生产；
中药：枣仁安神颗粒由黑龙江济仁药业有限公司生产；
西药(说明书中具有安定作用)：纯氯硝安定，来自氯硝西泮片(Clonazepam Tablets)，化学名为1，3-二氢-7-硝基-5-(2-氯苯基)-2H-1，4-苯并二氮杂卓-2-酮，由江苏恩华药业股份有限公司生产；
二、中药安神颗粒中安定成分的分析方法
1.中药枣仁安神颗粒抽提和制备
将中药枣仁安神颗粒研磨成粉末，称取一份0.4821克，将其置于三角瓶中，加入50毫升乙醇将三角瓶置于超声波设备中，进行1小时处理。放置24小时，过滤，取清液进行仪器分析。
样品进行气相色谱/质谱(GC-MS)和高效液相色谱(HPLC)分析。
2.中药枣仁安神颗安定成分的定性方法
2.1.GC-MS定性
①色谱的保留值定性法：在相同的色谱条件下，中药分离谱图中所确定组分的色谱保留时间应该和所对应的纯试剂有一致的色谱保留时间；
②质谱比较定性法：中药分离谱图中所确定组分的质谱图应该和所对应的纯试剂质谱图基本一致，即质谱图的质荷比(m/z)相同；
2.2.HPLC定性：以HPLC分离中药时，所确定中药成分的色谱保留时间和对应的准纯样的色谱保留时间应该一致；
3.中药枣仁安神颗安定成分的定性结果，
最终，分析结果确定，枣仁安神颗粒中含有氯硝安定成分，定性依据汇总于表1。其中，在GC/MS分析中，氯硝安定的色谱保留时间为28.02分；“枣仁安神”所确定组分的色谱保留时间为28.02分。氯硝安定MS的质荷比为39，51，63，75，89，102.125，133，151，164，177，193，205，213，234，252，268，280，286，314；所确定组分的质荷比为39，51，63，75，89，102.125，133，151，164，177，193，205，213，234，252，268，280，286，314。以MS分析“枣仁安神”，其匹配度达95％。HPLC分析中，纯氯硝安定的色谱保留时间为8.36分，“枣仁安神”所确定组分的色谱保留时间为8.36分。可以看到，“枣仁安神”药中确切地存在氯硝安定成分。
4.枣仁安神颗中安定成分的定量方法和结果
在前述定性的基础上，采用高效液相色谱外标法定量。以确定中药成分的对应试剂为外标物，其制备如下：
将氯硝安定研磨成粉末，称取0.01克，置其于50毫升三角瓶中，加入50毫升乙醇。将三角瓶置于超声波设备中，进行1小时处理，放置24小时。过滤，取清液进行仪器分析，过程中滤纸和三角瓶均需称重以计算真正的溶解浓度。此配制液一方面是HPLC分析的外标，也是GC/MS分析时的核实标准(定性部分已述)
外标法定量时，其计算公式如下
W％＝R样/R外标×C外标/C样×V外标/V样×100％-----------------(1)
式中W％代表中药成分中所含安定成分的重量百分含量，R样代表中药中所含安定成分的HPLC响应值，R外标代表外标安定的HPLC响应值，C外和C样分别代表外标和中药所配制的浓度(克/毫升)，V外标和V样分别代表外标和中药在色谱分析中的进样量(微升)
定量结果示于表3，中药枣仁安神颗中氯硝安定含量为0.0118％(平均值)。
实施例2：中药路路通的测定
一.测定仪器和实施条件：
①.Waters Breeze 1525高效液体色谱仪，美国制造，仪器配有Waters1525Binary高效液体色谱泵，Dualλ2487紫外检测器，色谱柱型号为VP-ODS SHIMADZU，4.6x150mm，日本制造，分析中以3个色谱柱串联使用，色谱流动相为乙醇，流速0.6毫升/分，色谱柱压为2400PSI，柱温14℃，紫外波长选在254nm；
②菲尼根跟踪气相色谱/质谱(GC-MS)分析仪由美国菲尼根公司提供，气相色谱/质谱分析的条件：色谱柱是一个DB-5MS柱，30米长，0.25毫米内径，薄膜厚度为0.25毫。载气为氦气1.0ml/min，初始温度为70℃，保持4分钟，然后以10℃/分钟上升率，最后加热至250℃，停留3分钟，电子轰击为70电子伏，原子质量范围为30-350；
③试剂和样品
试剂乙醇为分析纯试剂，由天津市博迪化工有限公司生产；
中药：路路通，云南制药厂生产；
西药(说明书中具有安定作用)：纯舒乐安定，来自艾司唑仑片(Estazolam Tablets)，化学名为6-苯基-8-氯-4H-〔1，2，4〕-三氮唑〔4，3-α(1，4)苯并二氮杂卓定，天津太平洋制药有限公司生产；
二、中药路路通中安定成分的分析方法
1.中药路路通的抽提和制备
将中药路路通研磨成粉末，称取一份0.5103克，将其置于三角瓶中，加入50毫升乙醇将三角瓶置于超声波设备中，进行1小时处理。放置24小时。过滤，取清液进行仪器分析。
样品进行气相色谱/质谱(GC-MS)和高效液相色谱(HPLC)分析。
2.中药路路通中安定成分的定性方法
1.GC-MS定性
①色谱保留值定性法：在相同的色谱条件下，中药分离谱图中所确定组分的色谱保留时间应该和所对应的纯试剂有一致的色谱保留时间。
②质谱比较定性法：中药分离谱图中所确定组分的质谱图应该和所对应的纯试剂质谱图基本一致，即质谱图的质荷比(m/z)相同。
2.HPLC定性：中药成分分离中，所确定中药成分的色谱保留时间和对应标准物(纯样)的色谱保留时间应该一致。
3.中药路路通安定成分的定性结果
最终，分析结果确定，路路通中含有舒乐安定成分，定性依据汇总于表1。其中，在GC/MS分析中，舒乐安定的色谱保留时间为28.70分；“路路通”所确定组分的色谱保留时间为28.70分。MS分析时，舒乐安定的质荷比为44，51，63，77，89，102，129，137，190，205，213，231，239。269，270，294；路路通中所确定组分的质荷比为44，51，63，77，89，102，129，137，190，205，213，231，239。269，270，294。MS分析时，“路路通”的匹配度达95％。HPLC分析中，舒乐安定的色谱保留时间为8.66分，“路路通”所确定组分的色谱保留时间为8.66分。可以看到，“路路通”药中确切地存在舒乐安定成分。
4.路路通中安定成分的定量方法和结果
在前述定性的基础上，采用高效液相色谱外标法定量。以确定中药成分的对应试剂为外标物，其制备如下：
将中药路路通确定的安定成分(舒乐安定)研磨成粉末，称取0.0112克，置其于50毫升三角瓶中，加入50毫升乙醇。将三角瓶置于超声波设备中，进行1小时处理，放置24小时。过滤，取清液进行仪器分析，过程中滤纸和三角瓶均需称重以计算真正的溶解浓度。此配制液一方面是HPLC分析的外标，也是GC/MS分析时的核实标准(定性部分已述)外标法定量时，其计算公式如下
W％＝R样/R外标×C外标/C样×V外标/V样×100％----------------(1)
式中W％代表中药成分中所含安定成分的重量百分含量，R样代表中药成分中所含安定成分的HPLC响应值，R外标代表外标安定HPLC响应值，C外和C样分别代表外标和中药所配制的浓度(克/毫升)，V外标和V样分别代表外标和中药在色谱分析中的进样量(微升)
定量结果示于表3，中药路路通中的舒乐安定含量为0.0270％(平均值)。
表1中药枣仁安神颗粒中氯硝安定成分的确定
| 分析系统 | 定性比较 | 枣仁安神药 | 纯氯硝安定 | 谱图 |
| 气相色谱/质谱分析 | 色谱保留时间(分) | 28.02 | 28.02 | 图2，图3 |
| 比较① | 质谱比较匹配度 | 95％ | 100％ | 图4，图5 |
| 比较② | 质谱的质核比 | 39，51，63，75，89.102.125，133，151164，177，193，205，213，234，252，268，280，286，314 | 39，51，63，75，89.102.125，133，151164，177，193，205，213，234，252，268，280，286，314 | 图4，图5 |
| 高效液相色谱分析 | 色谱保留时间(分) | 8.36 | 8.36 | 图6，图7 |
2中药路路通中舒乐安定成分的确定
| 分析系统 | 定性比较 | 中药路路通 | 纯舒乐安定 | 谱图 |
| 气相色谱/质谱分析 | 色谱保留时间(分) | 28.70 | 28.70 | 图9，图10 |
| 比较① | 质谱比较匹配度 | 93.5％ | 100％ | 图11，图12 |
| 比较② | 质谱的质核比 | 44，51，63，77，89，102，129，137，190，205，213，231，239。269，270，294 | 44，51，63，77，89，102，129，137，190，205，213，231，239。269，270，294 | 图11，图12 |
| 高效液相色谱分析 | 色谱保留时间(分) | 8.66 | 8.66 | 图13，图14 |
表3中药中安定成分的定量结果
| 分析体系高效液相色谱 | 枣仁安神颗粒中氯硝安定含量 | 路路通中舒乐安定含量 |
| 定量方法 | W％ | W％ |
| 色谱外标法① | 0.0116 | 0.0260 |
| ② | 0.0120 | 0.0274 |
| 平均 | 0.0118 | 0.0270 |
| 色谱图图号 | 图6，图7 | 图13，图14 |
Claims (1)
1.一种气相色谱/质谱联和高效液相色谱测定中药里安定成分的方法，其特征在于包括如下步骤：
本发明具体的测定分析法包括如下步骤：
一、测定仪器和实施条件：
①.Waters Breeze 1525高效液体色谱仪，美国制造，仪器配有Waters1525 Binary高效液体色谱泵，Dualλ2487紫外检测器，色谱柱型号为VP-ODS SHIMADZU，4.6x150mm，3个色谱柱，日本制造，分析中以3个色谱柱串联使用，色谱流动相为乙醇，流速0.6毫升/分，
色谱柱压为2400PSI，柱温14℃，紫外波长选在254nm；
②菲尼根跟踪气相色谱/质谱分析仪由美国菲尼根公司提供，气相色谱/质谱分析的条件：色谱柱是一个DB-5MS柱，30米长，0.25毫米内径，薄膜厚度为0.25毫，载气为氦气1.0ml/min，初始温度为70℃，保持4分钟，然后以10℃/分钟上升率，最后加热至250℃，停留3分钟，电子轰击为70电子伏，原子质量范围为30-350；
③试剂和样品
试剂乙醇为分析纯试剂；
外标物为西药：纯舒乐安定，其来自艾司唑仑片，化学名为6-苯基-8-氯-4H-〔1，2，4〕-三氮唑〔4，3-α(1，4)苯并二氮杂卓定；纯氯硝安定，来自氯硝西泮片，化学名为1，3-二氢-7-硝基-5-(2-氯苯基)-2H-1，4-苯并二氮杂卓-2-酮；
(1)中药成分的抽提和制备
将中药研磨成粉末，称取0.1-0.5克，加入50毫升乙醇，置于超声波设备中，进行1小时处理，再放置24小时，过滤，以清液进行仪器分析；
(2)中药中安定成分的定性分析
(一)、色谱/质谱定性
①色谱保留值定性法：在相同的色谱条件下，中药分离谱图中的组分，若其色谱保留时间和对应的纯试剂的色谱保留时间是一致的，说明中药具有对应外标物的安定成分；若其色谱保留时间和对应的纯试剂的色谱保留时间不同，说明中药不具有对应外标物的安定成分；
②质谱比较定性法：中药分离谱图中的组分，若其质谱特征图和所对应的纯试剂的质谱特征图是基本一致，即其质谱图的质荷比为m/z相同，并具有较高的匹配度，说明中药具有对应外标物的安定成分，若其质谱特征图和对应的纯试剂的质谱特征图不同，说明中药不具有对应外标物的安定成分；
(二)、高效液相色谱定性：以HPLC分离中药时，对所确定的成分，若其色谱保留时间和对应的纯试剂的色谱保留时间是一致，说明中药具有对应外标物的安定成分，若其色谱保留时间和对应的纯试剂的色谱保留时间不一致的，说明中药不具有对应外标物的安定成分；
(3)中药成分的定量测定
在前述定性的基础上，采用高效液相色谱外标法定量，以所确定中药成分的对应试剂为外标物，其制备如下：
将外标物研磨成粉末，称取0.01-0.05克，加入50毫升乙醇，置于超声波设备中，进行1小时的处理，放置24小时，过滤，取清液进行仪器分析，过程中滤纸和三角瓶都需要称重以计算真正的溶解浓度；
外标法定量时，其计算公式如下
W％＝R样/R外标×C外标/C样×V外标/V样×100％--------------------(1)
式中W％代表中药成分中所含安定成分的重量百分含量，R样代表中药中所含安定成分的HPLC响应值，R外标代表外标安定的HPLC响应值，C外和C样分别代表外标和中药所配制的浓度，浓度单位为克/毫升，V外 标和V样分别代表外标和中药在色谱分析中的进样量，进样量单位为微升。
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