CN107677744B - 一种动物组织细胞中形态汞的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种动物组织细胞中形态汞的检测方法，包括以下步骤：(1)标准品溶液的配制；(2)样本前处理：使细胞壁破碎后，用提取剂提取，离心，取上清液过滤后上机；(3)采用超高效液相色谱‑电感耦合等离子体质谱联用法测定，仪器条件:超高效液相色谱的流动相采用乙酸铵、L‑半胱氨酸、甲醇体系，调节pH至2.0‑2.5。本发明具有能排除细胞培养液中的钠离子干扰，极大地提高了方法的稳定性和准确性。
Description
技术领域
本发明属于痕量金属检测领域，具体涉及一种超高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法测定动物组织细胞中的形态汞。
背景技术
含Hg中药在我国传统中药中历史悠久，朱砂为含汞中药中一种，它具有清心镇惊、安神、明目、解毒的功效，临床多用于心悸易惊，失眠多梦，癫痫发狂，惊风，视物昏花，口疮喉痹，疮疡肿毒诸证等，被列为安神药之首，其主要成分为HgS。
含汞物质均为有毒物质，因此服用朱砂存在中毒的风险，用药不当甚至可能导致死亡。目前关于朱砂主要成分HgS在人体内代谢后汞在细胞中的存在形式未见报道，因此分析研究朱砂在人体内代谢后细胞中汞的存在形式对含汞中药在临床上的应用具有指导意义。且目前关于形态汞的检测技术多基于食品内形态汞的测定，而人体细胞内形态汞的检测方法未见报道。研究这些都离不开离体细胞培养以及动物实验，现有技术都是在样品数量巨大的基础上进行的，对于离体细胞以及动物组织的样品量是非常少的，现有技术无法满足在这样的样品量下准确提取其中的汞，并进行检测，找到一种快速、高效、准确的检测方法，测定朱砂在人体内代谢后汞在细胞中形态及含量很有必要，就能更加清楚的了解人体对朱砂的吸收情况，同时更有助于指导朱砂在临床上的准确用量，减少用药风险。
目前食品中形态汞的检测技术主要有：气相色谱法(GC)、气相色谱-原子吸收法(GC-AAS)、高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法(HPLC-ICP/MS)和高效液相色谱-原子荧光光谱法(HPLC-AFS)等。由于气相色谱法的预处理繁琐、干扰因素较多、ECD的选择性差，检出限较高等因素不利于细胞中痕量形态汞的检测；气相色谱-原子吸收法灵敏度低；高效液相色谱-原子荧光光谱法前处理过程复杂，且前处理过程中细胞中汞的形态易发生变化，影响测定结果的准确性。HPLC-ICP/MS检测方法具有接口简单、HPLC的分离效果好，ICP-MS检出限低、线性范围宽、检测器选择性好、多元素同时分析的优势，前处理过程对样品待测成分的干扰少、待测成分原始形态不易改变等优点，较适合于细胞内痕量形态汞的测定，由于Na+对于维持细胞组织正常形态具有重要的作用，在分析细胞组织及培养液的形态汞时，样本中Na+浓度会影响无机汞的出峰形式，影响检测方法的重现性和检测结果的准确性。因此本发明基于超高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用检测技术，得出了一种人体细胞内形态汞的检测方法，首次分析了朱砂主要成分HgS在人体内代谢后在细胞中的存在形式，同时对细胞内的各种汞形态的含量进行了测定,为朱砂及各类含汞中成药的合理应用提供理论依据。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种超高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用的检测方法，可以很好地解决现有技术中存在的问题。
本发明动物组织细胞中形态汞的检测方法，包括以下步骤：
(1)标准品溶液的配制；
(2)样本前处理：使细胞壁破碎后，用提取剂提取，离心，取上清液过滤后上机；
(3)仪器条件：流动相采用乙酸铵、L-半胱氨酸、甲醇体系，调节pH至2.0-2.5。
具体步骤如下：
(1)无机汞、甲基汞、乙基汞标液逐级稀释到1000μg/L后混合,配制成各含100μg/L的汞的混合标液，再用提取液并添加适量D-hanks液，保证其钠离子浓度和样本钠离子浓度一致，逐级稀释无机汞、甲基汞、乙基汞，其浓度梯度均为0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、3μg/L、5μg/L，离心取上清检测；
(2)样本前处理：用100μL的0.3％triton-100常温浸泡细胞样本15min破坏细胞膜后，再加提取剂500μL，超声60min，进一步破坏细胞膜，充分提取样本中形态汞，震荡摇匀，震荡摇匀，4℃以12000rpm离心15min，取上清液过0.22μm滤膜后用UPLC-ICP-MS进行分析；
(3)色谱条件：色谱柱：Althena C18，120A，4.6×250mm，5μm；流动相：10mmol/L乙酸铵、0.05％L-半胱氨酸、5％甲醇、用浓盐酸调pH至2.0-2.5，用一级水定容至1L；流速：1.1mL/min；进样体积：20μL；
(4)质谱条件：ICP-MS工作参数：测定前用1.0μg/L调谐液将仪器条件进行优化，RF功率：1548.6W，接口温度：37.59℃，冷却水流量：3.32L/min，冷却气流量13.920L/min，辅助气流量：0.7918L/min，雾化器气体流量：1.0235L/min，蠕动泵泵速40.0rpm，方向为顺时针，驻留时间为400ms，测定模式：STD，采样质量数为202Hg。
其中提取剂的配制方法为称取0.3012g L-半胱氨酸，0.1919g乙酸铵，甲醇12.5ml，再用水定容至250ml用盐酸调pH至1.5。
本发明与现有技术相比具有的有益效果：本发明基于超高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用检测技术，得出了一种人体细胞内形态汞的检测方法，首次分析了朱砂主要成分HgS在人体内代谢后在细胞中的存在形式，同时对细胞内的各种汞形态的含量进行了测定，为朱砂及各类含汞中成药的合理应用提供理论依据。具体有益效果包括以下几点：
(1)先用0.3％triton-100液破碎细胞膜，超声辅助破碎，从而在样品在很少的情况下不浪费样品量的前提下又不影响细胞组织内形态汞的相互转化情况下完全释放出来，以便形态汞的准确定量。
(2)采用调节pH至2.0-2.5，使得Na+的倒峰的保留时间改变，与无机汞的峰完全分离，使得不影响无机汞的定量，使方法的准确性、稳定性有极大的增加。
(3)数据说明方法可靠，稳定。其中无机汞的r2＝0.9998，f(x)＝16373.8678*x+161.7391；甲基汞的r2＝0.9998，f(x)＝14744.4700*x+214.245；乙基汞的r2＝0.9997，f(x)＝14601.0805*x+69.5239；线性范围：0～5μg/L。回收率在91.6-97.8％之间，八次平行的RSD为1.47-2.19％，最低检测限：无机汞为0.05μg/L；甲基汞为0.082μg/L；乙基汞为0.077μg/L；最低定量限：无机汞为0.083μg/L；甲基汞为0.137μg/L乙基汞为0.128μg/L。
(4)超声前加入提取液在L-半胱氨酸的作用下，可防止无机汞与甲基汞和乙基汞相互转化。
附图说明
图1：采用现有技术得到的细胞中形态汞谱图；
图2：采用本发明得到的细胞中形态汞谱图；
具体实施方式
实施例1
本发明动物组织细胞中形态汞的检测方法，包括以下步骤：
(1)样本前处理：用0.3％的triton处理细胞样本15min后，超声60min，震荡摇匀，取100μL样本液，再加提取剂500μL，震荡摇匀，4℃以12000rpm离心15min，取上清液过0.22μm滤膜后用UPLC-ICP-MS进行分析；
(2)色谱条件：色谱柱：Althena C18，120A，4.6×250mm，5μm；流动相：10mmol/L乙酸铵、0.05％L-半胱氨酸、5％甲醇、用浓盐酸调pH至2.0-2.5，用一级水定容至1L；流速：1.1mL/min；进样体积：20μL；
(3)质谱条件：ICP-MS工作参数：测定前用1.0μg/L调谐液将仪器条件进行优化，其中，赛默飞世尔科技的ICP-MS使用Tune B调谐，其他公司ICP-MS使用具有相同功能的调谐液将仪器条件进行优化，RF功率：1548.6W，接口温度：37.59℃，冷却水流量：3.32L/min，冷却气流量13.920L/min，辅助气流量：0.7918L/min，雾化器气体流量：1.0235L/min，蠕动泵泵速40.0rpm，方向为顺时针，驻留时间为400ms，测定模式：STD，采样质量数为202Hg。
其中提取剂的配制方法为称取0.3012g L-半胱氨酸，0.1919g乙酸铵，甲醇12.5ml，再用水定容至250ml用盐酸调pH至1.5。分析测试得到的色谱图见附图1和附图2。
实施例2
标曲：无机汞、甲基汞、乙基汞标液均采购于中国计量科学研究院，逐级稀释到1000μg/L后混合配制成各含100μg/L的汞的混合标液，再用提取液并添加一定量细胞培养液逐级稀释无机汞、甲基汞、乙基汞，其浓度梯度均为0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、3μg/L、5μg/L，离心取上清检测；上机检测得到到无机汞的r2＝0.9998，f(x)＝16373.8678*x+161.7391；甲基汞的r2＝0.9998，f(x)＝14744.4700*x+214.245；乙基汞的r2＝0.9997f(x)＝14601.0805*x+69.5239；线性范围：0～5μg/L。
实施例3
回收率：在培养的细胞中加入一定量的三种形态汞混合液培养后提取检测得到A组数据；然后同A组数据同等条件下培养同种组织细胞4份，选择其中两份直接提取形态汞，得到B组数据，另两份按A组数据1:1的比例添加三种汞的混合液，摇匀后同等条件提取无机汞，得到C组数据，计算后得到回收率，汞为91.6％；甲基汞为96.7％，乙基汞为97.8％。
实施例4
稳定性：在相同条件下培养8组的细胞中加入等量的三种形态汞混合液培养后提取后，采用上机测试得到数据见表1：
表1：本发明方法的稳定性实验数据
| 平行次数 | 无机汞(μg/L) | 甲基汞(μg/L) | 乙基汞(μg/L) |
| 1 | 0.92 | 0.69 | 1.09 |
| 2 | 0.94 | 0.69 | 1.07 |
| 3 | 0.90 | 0.70 | 1.09 |
| 4 | 0.91 | 0.72 | 1.11 |
| 5 | 0.89 | 0.71 | 1.08 |
| 6 | 0.88 | 0.70 | 1.14 |
| 7 | 0.91 | 0.71 | 1.10 |
| 8 | 0.92 | 0.70 | 1.13 |
| RSD(％) | 2.07 | 1.47 | 2.19 |
最低检测限：仪器自行计算得到无机汞为0.05μg/L；甲基汞为0.082μg/L乙基汞为0.077μg/L；最低定量限：无机汞为0.083μg/L；甲基汞为0.137μg/L乙基汞为0.128μg/L。
Claims (2)
1.一种动物组织细胞中形态汞的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)标准品溶液的配制：无机汞、甲基汞、乙基汞标液逐级稀释到1000μg/L后混合，配制成各含100μg/L的汞的混合标液，再用提取液并添加适量D-hanks，保证其钠离子浓度与样本钠离子浓度一致，逐级稀释无机汞、甲基汞、乙基汞，其浓度梯度均为0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、3μg/L、5μg/L，离心取上清检测；
(2)样本前处理：用100μL 0.3％的triton常温浸泡细胞样本15min破坏细胞膜后，加入提取剂500μL，超声60min，震荡摇匀，取100μL样本液，震荡摇匀，4℃下以12000rpm离心15min，取上清液过0.22μm滤膜后用HPLC-ICP-MS进行分析；
(3)采用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法测定，仪器条件:
色谱条件：色谱柱：Althena C18，120A，4.6×250mm，5μm；流动相：10mmol/L乙酸铵、0.05％L-半胱氨酸、5％甲醇、用浓盐酸调pH至2.0-2.5，用一级水定容至1L；流速：1.1mL/min；进样体积：20μL；
质谱条件：ICP-MS工作参数：测定前用调谐液将仪器条件进行优化，RF功率：1548.6W，接口温度：37.59℃，冷却水流量：3.32L/min，冷却气流量13.920L/min，辅助气流量：0.7918L/min，雾化器气体流量：1.0235L/min，蠕动泵泵速40.0rpm，方向为顺时针，驻留时间为400ms，测定模式：STD，采样质量数为202Hg。
2.如权利要求1所述的一种动物组织细胞中形态汞的检测方法，其特征在于：提取剂的配制方法为称取0.3012g L-半胱氨酸，0.1919g乙酸铵，甲醇12.5mL，再用水定容至250mL用盐酸调pH至1.5。
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