CN106501382B

CN106501382B - 一种鱼肉中汞化合物的提取和检测方法

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Publication number: CN106501382B
Application number: CN201510566802.3A
Authority: CN
Inventors: 张凤枰; 冷庚; 焦宝玉; 饶瑾瑜; 李林高; 刘耀敏; 王殷洁
Original assignee: University of Electronic Science and Technology of China; Tongwei Co Ltd
Current assignee: University of Electronic Science and Technology of China; Tongwei Co Ltd
Priority date: 2015-09-08
Filing date: 2015-09-08
Publication date: 2020-03-06
Anticipated expiration: 2035-09-08
Also published as: CN106501382A

Abstract

本发明公开了一种鱼肉中汞化合物的提取方法，它包括以下步骤：取鱼肉样品，加入巯基试剂提取，离心，移取出上清液，过滤即得富集汞化合物的提取液,所述巯基试剂的pH值为3.0‑8.0，最佳的为4.0。本发明首次将巯基试剂作为鱼肉样品中汞形态的唯一提取试剂，提取步骤简单，提取试剂用量少，简单、高效、低毒地完成了鱼肉样品中三类形态汞化合物——甲基汞、乙基汞和无机汞的提取。本发明还公开了一种鱼肉中汞化合物的检测方法，该方法无需其他操作，直接将本发明提取方法得到的提取液注入高效液相色谱‑冷蒸汽发生原子荧光光谱系统分析，可以同时快速、准确、稳定、灵敏地检测出鱼肉中三类形态汞化合物的含量，适合推广应用。

Description

一种鱼肉中汞化合物的提取和检测方法

技术领域

本发明属于环境分析化学技术领域，尤其涉及一种鱼肉中汞化合物的提取和检测方法。

背景技术

汞具有高挥发性和高毒性，能对神经系统健康造成危害，并可在生物体内富集，各国均将汞列入优先污染物黑名单。但是，汞的毒性、生物可利用性、迁移性和再迁移性与其化学形态密切相关，一般而言，有机汞的毒性大于无机汞。汞及其化合物能在生物体内进行富集，并通过食物链进行生物放大。因此，对鱼肉中汞形态的准确、高效分析显得意义重大。

对于鱼肉固体样品中汞的形态分析，前处理一直以来都需要着重考虑。用简单、快速、可靠的方法将汞的各形态从复杂基体中提取出来已成为分析化学工作者研究的重点。

中国专利CN 103257199 A公开了一种测定水产品中甲基汞含量的测定方法，其汞化合物的提取方法为，盐酸和氯化钠溶液混合提取，甲苯萃取，L-半胱氨酸溶液反萃取，硫酸溶液酸化，饱和硫酸铜溶液和四苯硼钠溶液衍生，正己烷萃取。该方法测定的目标单一，条件繁琐，有毒试剂众多，对环境易造成二次污染，对实验人员易造成健康危害。

中国专利CN 103335990 A公开了一种测定动物肉体中甲基汞和乙基汞的方法。该方法以盐酸和氯化钠溶液为萃取剂，利用微波辅助萃取。由于微波萃取需要升温和降温的过程，因此在实践中，整体的萃取时间较长，耗费能源较多；同时，该方法在萃取中使用了较高浓度(5mol/L)的盐酸，一方面会对环境易造成二次污染，对实验人员易造成健康危害，另一方面低pH样品还会对后续分析仪器产生损害。

因此，在对鱼肉中汞化合物的提取中，由于现有技术存在提取的汞化合物种类较少、提取过程繁琐、提取试剂毒性大、提取时间长、效率偏低等问题，目前亟需一种高效、快速的、绿色的提取方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种鱼肉中汞化合物的提取方法，优选淡水鱼肉，它包括以下步骤：取鱼肉样品，加入巯基试剂提取，离心，移取出上清液，过滤即得富集汞化合物的提取液,所述巯基试剂的pH值为3.0-8.0。

优选地，所述巯基试剂选自2-巯基乙醇、L-半胱氨酸或双硫腙中的任一种；最优选的试剂巯基试剂为L-半胱氨酸。

优选地，所述鱼肉样品与巯基试剂的重量摩尔比为1:0.025～1.25g/mmol，优选的重量摩尔比为1:0.5g/mmol。。

优选地，所述巯基试剂的pH值为3.0-6.0，最优选的pH值为4.0。

优选地，所述提取为漩涡震荡提取；更优选地，所述漩涡震荡的速率为3000rpm，震荡时间为0.5-30min，优选10min。

优选地，所述鱼肉样品是通过下述步骤制备得到的：取鱼肉搅碎，在-45℃下真空条干燥24h，搅碎至粉状即得。

优选地，所述汞化合物为甲基汞、乙基汞或无机汞中的一种或者几种。

本发明还提供了一种鱼肉中汞化合物的检测方法，它包括以下步骤：

(1)汞化合物标准曲线的建立：

取汞化合物标准溶液，注入高效液相色谱-冷原子荧光光谱联用系统，进行检测，检测条件为：

高效液相色谱：色谱柱为C18反相色谱柱，流速为1.0mL/min，流动相为5％(v/v)乙腈，60mmol/L乙酸铵，10mmol/L L-半胱氨酸；

冷原子荧光光谱：灯电流为30mA，倍增管负高压为270V，载气为流速500mL/min的氩气，溶于5％(m/v)NaOH溶液中的K₂S₂O₈，K₂S₂O₈的浓度2％(m/v)；还原剂为溶于5％(m/v)NaOH中的KBH₄，KBH₄的浓度为2％(m/v)；载流液为7％(v/v)HCl溶液；

(2)待测样品中汞化合物的检测：

取鱼肉样品，按照本发明所述的汞化合物提取方法制备得到富集汞化合物的提取液，作为样品溶液；

取样品溶液，以步骤(1)相同的方法检测，根据步骤(1)的标准曲线得到待测样品中汞化合物的含量。

本发明首次将巯基试剂作为鱼肉样品中汞形态的唯一提取试剂，提取步骤简单，提取试剂用量少，简单、高效、低毒地完成了鱼肉样品中三类形态汞化合物——甲基汞、乙基汞和无机汞的提取。

更进一步的，本发明优选的巯基试剂L-半胱氨酸是一种无毒的天然氨基酸，使本发明的提取方法更为绿色。优选的漩涡震荡的提取方式简单快速，10min内就可以完成，大幅缩短了操作时间，适合于推广应用。

同时，本发明的检测方法无需其他操作，直接将本发明的提取液注入高效液相色谱-冷蒸汽发生原子荧光光谱(HPLC-CVAFS)系统分析，可以同时快速、准确、稳定、灵敏地检测出鱼肉中三类形态汞化合物的含量。试剂简单、微量，设备简单，操作简便。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为采用不同巯基试剂提取鱼肉中甲基汞、乙基汞和无机汞的结果：DTC为双硫腙，L-Cys为L-半胱氨酸，2-ME为2-巯基乙醇。

图2为采用不同浓度L-半胱氨酸提取甲基汞、乙基汞和无机汞的结果。

图3为采用不同pH值的L-半胱氨酸提取甲基汞、乙基汞和无机汞的结果。

图4为实施例4中鱼肉样品加标前的谱图。

图5为实施例4中鱼肉样品加标后的谱图。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。具体如下：

鱼肉来源于成都市农贸市场、超市所售淡水鱼，包括鲫鱼、鲢鱼、草鱼。试剂：

L-半胱氨酸(L-Cys，纯度≥99％，美国Sigma公司)；

乙腈、乙酸铵(均为色谱纯，美国Tedia公司)；

KBH₄、K₂S₂O₈(均为分析纯，成都科龙化工试剂厂)；

HCl、NaOH(均为优级纯，成都科龙化工试剂厂)；

10mg L^-1Hg²⁺标准溶液(德国Merck公司)；

10mg L^-1甲基汞(MeHg⁺)标准溶液：由德国Dr.Ehrenstorfer氯化甲基汞溶于甲醇制得。

10mg L^-1乙基汞(EtHg⁺)标准溶液：由德国Dr.Ehrenstorfer氯化乙基汞溶于甲醇制得。

实验用水为超纯水(美国Millipore公司Integral 3超纯水制备系统)。仪器：

真空冷冻干燥机(北京博医康)；Multi Reax漩涡振荡器(德国Heidolph公司)；LC-20AT高效液相色谱泵(日本岛津公司)；7725i进样阀及100μL样品环(美国Rheodyne公司)；Venusil MP-C18反相液相色谱柱(5μm,4.6×150mm,美国Agela公司)；SA-10形态分析仪(北京吉天仪器公司)；AFS-9130原子荧光光谱仪(北京吉天仪器公司)。

实施例1本发明的提取方法和检测方法

(1)本发明的提取方法

新鲜鲫鱼剖杀后，取两侧鱼肉，剔除鱼刺，置于绞肉机中将鱼肉搅碎至肉酱。然后将样品放入真空冷冻干燥机内，真空条件下以-45℃，真空冷冻干燥24h。然后将干燥后样品置于粉粹机内搅碎至粉状，作为鱼肉样品待用。

取0.2g上述鱼肉样品于25mL锥形离心管内，向其中加入pH＝4.0(0.1molL^-1HCl调节pH值)、浓度为20mmolL^-1的L-半胱氨酸5mL，然后将样品置于漩涡震荡仪，以3000rpm速率震荡提取10min；提取完毕后，将样品置于离心机，以10000rpm速率离心5min；离心完毕后，取上清液，采用注射滤器，使样品过0.22μm滤膜，过滤后样品置于2mL棕色色谱瓶内，即得富集汞化合物的提取液，作为样品溶液。

(2)汞化合物标准曲线的建立

甲基汞、乙基汞标准溶液的配制：准确称取0.1g氯化甲基汞标准品和0.1g氯化乙基汞标准品于250mL烧杯中，然后加入甲醇使其溶解，最终转移至100mL棕色容量瓶内保存。甲基汞和乙基汞标准溶液浓度为10mg/L(以氯化甲基汞和氯化乙基汞计)。

无机汞标准溶液：准确移取1000mg/L的Hg(II)储备液1mL至100mL棕色容量瓶内，并用2％(v/v)硝酸定容。无机汞标准溶液浓度为10mg/L(以汞计)。

所述标准溶液采用高效液相色谱(HPLC)-冷蒸汽发生原子荧光光谱(CVAFS)进行测定。HPLC-CVAFS仪器工作参数见表1，其中，m/v的单位为g/mL。

表1.HPLC-CVAFS仪器工作参数

标准曲线的建立：标准曲线采用5点外标法，分别移取甲基汞、乙基汞和无机汞标准溶液1mL至100mL棕色容量瓶，以超纯水定容。该混合标准溶液浓度为100μg/L。然后用超纯水对此混合标准溶液进行逐级稀释，分别配制50μg/L，20μg/L，10μg/L，5μg/L，1μg/L溶液。以表1所示条件测试上述5组标准溶液，分别得到甲基汞、乙基汞和无机汞的标准曲线。

HPLC-CVAFS测试甲基汞、乙基汞和无机汞性能指标如表2所示。

表2.HPLC-CVAFS测试甲基汞、乙基汞和无机汞性能指标

^a n＝6；^b峰面积；^c浓度(g L^-1)。

可以看出，本发明方法线性关系优异，检出限低。

(3)鱼肉中甲基汞、乙基汞和无机汞的检测

取样品溶液，采用高效液相色谱(HPLC)-冷蒸汽发生原子荧光光谱(CVAFS)进行测定，仪器工作参数与步骤(2)中的参数相同，根据步骤(2)的标准曲线得到待测样品中汞化合物的含量。

实施例2本发明提取方法中各种工艺参数的筛选

下述筛选试验参照实施例1方法，分别筛选了巯基试剂的种类、巯基试剂的用量、巯基试剂不同pH值和震荡漩涡的参数。

1、不同巯基试剂对鱼肉中甲基汞、乙基汞和无机汞提取效果的影响

巯基试剂的种类会影响鱼肉中甲基汞、乙基汞和无机汞的提取效果。为筛选出最好的巯基试剂，考察了2-巯基乙醇(2-ME)、L-半胱氨酸(L-Cys)、双硫腙(DTC)三种巯基试剂对提取回收率的影响。其他工艺参数：巯基试剂的pH＝4.0；三种巯基试剂的用量均为20mmol/L，5mL；提取震荡速率为3000rpm，时间10min；离心条件10000rpm，时间5min；样品加标0.2μg。结果如图1和表3所示。

表3不同巯基试剂提取甲基汞、乙基汞和无机汞的回收率(％)(n＝3)

巯基试剂	甲基汞	RSD％	乙基汞	RSD％	无机汞	RSD％
							DTZ	82.2	5.0	71.9	5.5	90.5	4.8
L-Cys	97.2	6.4	92.3	6.3	103.2	6
							2-ME	70.0	6.7	52.7	7.2	60.2	5.5

实验结果表明，以上三种巯基试剂均能有效提取鱼肉中的甲基汞、乙基汞和无机汞。其中，L-半胱氨酸的提取效果最佳，对甲基汞、乙基汞和无机汞的提取回收率均大于92.3％。

2、巯基试剂的不同用量对鱼肉中甲基汞、乙基汞和无机汞提取效果的影响

巯基试剂的用量会影响鱼肉中甲基汞、乙基汞和无机汞的提取效果。为筛选出最优的巯基试剂用量，考察了浓度范围为1.0-50mmol/L的L-半胱氨酸(即鱼肉与L-半胱氨酸的重量摩尔比为1:0.025～1.25g/mmoL)对提取回收率的影响，也即。其他工艺参数：巯基试剂的pH＝4.0；巯基试剂体积为5mL；提取震荡速率为3000rpm，时间10min；离心条件10000rpm，时间5min；样品加标0.2μg。结果如图2和表4所示。

表4不同L-半胱氨酸用量提取甲基汞、乙基汞和无机汞的回收率(％)(n＝3)

实验结果表明，在鱼肉与L-半胱氨酸的重量摩尔比1:0.025～1.25g/mmoL的比例关系下，L-半胱氨酸均能提取出鱼肉中的甲基汞、乙基汞和无机汞，当比例关系为1:0.5g/mmoL时提取效果最佳。

3、不同巯基试剂的pH值对鱼肉中甲基汞、乙基汞和无机汞提取效果的影响

在本方法中，巯基试剂的pH值对鱼肉中甲基汞、乙基汞和无机汞与巯基试剂中巯基基团的结合有较大影响。因此，巯基试剂的pH值会影响鱼肉中甲基汞、乙基汞和无机汞的提取效果。为筛选出最佳pH值，考察了不同pH值(8.0，6.0，5.0，4.5，4.0，3.5，3.0)对提取效果的影响。其他工艺参数：巯基试剂为20mmol/L的L-半胱氨酸，5mL；提取震荡速率为3000rpm，时间10min；离心条件10000rpm，时间5min；样品加标0.2μg。结果如图3和表5所示。

表5不同巯基试剂pH值提取甲基汞、乙基汞和无机汞的回收率(％)(n＝3)

实验结果表明，当巯基试剂的pH值在3.0-8.0之间时，均能有效提取出鱼肉中甲基汞、乙基汞和无机汞。当巯基试剂的pH值在3.0-6.0之间时，回收率范围为86.6-102.7％，提取效果较佳。当巯基试剂的pH值为4.0时，提取效果最佳

4、不同漩涡震荡时间对鱼肉中甲基汞、乙基汞和无机汞提取效果的影响

漩涡震荡时间会影响鱼肉中甲基汞、乙基汞和无机汞的提取效果。为筛选出最佳的漩涡震荡时间，考察了不同漩涡震荡时间(0.5，1，5，10，20，以及30min)对提取的影响。其他工艺参数：巯基试剂的pH＝4.0；巯基试剂为20mmol/L的L-半胱氨酸，5mL；提取震荡速率为3000rpm；离心条件10000rpm，时间5min；样品加标0.2μg。

实验结果显示，漩涡震荡时间为0.5-30.0min时，均能有效提取出鱼肉中的甲基汞、乙基汞和无机汞。当提取时间从0.5min增加至10min时候，甲基汞、乙基汞和无机汞的回收率随之增加。

继续延长漩涡震荡时间至30min，甲基汞、乙基汞和无机汞的回收率基本维持恒定，甲基汞的回收率在96％左右，无机汞在102％左右，乙基汞在92％左右。综合考虑，选择10min为最优的漩涡震荡提取时间。

实验结果证明，本发明利用漩涡震荡的方式，使鱼肉样品能动态地均匀分散在提取溶液中，这样既增加了巯基试剂与目标化合物的接触面积，又降低了目标物质的传质距离，使得本发明提取方法在10min内即可完成，提取简便、快速、效率高。

实施例4本发明方法的方法学评价

1、方法的专属性

利用本发明实施例1的方法，对成都市农贸市场、超市所售淡水鱼鱼肉中甲基汞、乙基汞和无机汞进行检测，加标量为0.2μg，加标前后的谱图分别如图4和图5所示，

结果表明，甲基汞、乙基汞和无机汞出峰时间间隔明显，无其他杂质干扰，证明本发明的方法分离度好，无内源性杂质干扰，且出峰时间短，检测快速。

2、方法的准确度、重现性、检出限和线性范围

利用本发明实施1的方法，对成都市农贸市场、超市所售淡水鱼鱼肉中甲基汞、乙基汞和无机汞进行检测。样品分别加标1.0μg、0.2μg和0.05μg，分别作为高、中、低三种浓度的标样。测定得到本方法的主要性能指标，结果如表6所示。

表6测定鱼肉中甲基汞、乙基汞和无机汞的性能指标

a：n＝6；b：样品加标1.0μg；c：样品加标0.2μg；d：样品加标0.05μg。

*为同一操作人员，在同样的条件下，在较短时间内做3个样品，然后测定所得结果的RSD.

结果表明，本发明的检测方法准确度高(加标回收均大于90％)、重现性好、灵敏度高、检出限低、线性范围大，同时也证明了本发明的提取方法效果优异。

综上所述，本发明的提取方法首次将巯基试剂作为鱼肉样品中汞形态的唯一提取试剂，提取步骤简单，提取试剂用量少，简单、高效、低毒地完成了鱼肉样品中三类形态汞化合物——甲基汞、乙基汞和无机汞的提取。

本发明的检测方法，该方法无需其他操作，直接将本发明提取方法得到的提取液注入高效液相色谱-冷蒸汽发生原子荧光光谱系统分析，可以同时快速、准确、稳定、灵敏地检测出鱼肉中三类形态汞化合物的含量。试剂简单、微量，设备简单，操作简便，适合推广应用。

Claims

1.一种鱼肉中汞化合物的提取方法，其特征在于：它包括以下步骤：

取鱼肉搅碎，-45℃真空干燥24h，再搅碎至粉状，加入重量摩尔比为1:0.5 g/mmol巯基试剂提取，离心，移取出上清液，过滤即得富集汞化合物的提取液, 所述巯基试剂为pH值4.0的L-半胱氨酸溶液；

所述提取为漩涡震荡提取，速率为3000rpm，时间为10min。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述汞化合物为甲基汞、乙基汞或无机汞中的一种或者几种。

3.一种鱼肉中汞化合物的检测方法，它包括以下步骤：

（1）汞化合物标准曲线的建立：

高效液相色谱：色谱柱为C18反相色谱柱，流速为1.0mL /min，流动相为5%（v/v）乙腈，60mmol/L乙酸铵，10mmol/L L-半胱氨酸；

冷原子荧光光谱：灯电流为30mA，倍增管负高压为270V，载气为流速500 mL/ min的氩气，氧化剂为溶于5%（m/v）NaOH溶液中的K₂S₂O₈，K₂S₂O₈的浓度2%（m/v）；还原剂为溶于5%（m/v）NaOH中的KBH₄，KBH₄的浓度为2%（m/v）；载流液为7%（v/v）HCl溶液；

（2）待测样品中汞化合物的检测：

取鱼肉样品，按照权利要求1或2所述的提取方法制备得到富集汞化合物的提取液，作为样品溶液；

取样品溶液，以步骤（1）相同的方法检测，根据步骤（1）的标准曲线得到待测样品中汞化合物的含量。