CN102411036B - 松花粉超临界萃取物中β-谷甾醇的含量的测定方法 - Google Patents
松花粉超临界萃取物中β-谷甾醇的含量的测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及松花粉超临界萃取物中活性物质β-谷甾醇的含量测定方法，运用气相色谱-质谱联用法和高效液相色谱法对甾醇类成分进行了分析测定。包括步骤如下：通过气相色谱-质谱联用分析，确定松花粉超临界萃取物中甾醇类的主要成分是β-谷甾醇；皂化法提取；高效液相色谱法测定β-谷甾醇的含量。本发明首次针对松花粉超临界萃取物中的甾醇类成分建立了简便可行的提取分析方法，手段先进、准确度、精密度良好，能通过β-谷甾醇的含量测定评价松花粉超临界萃取物的质量情况。
Description
技术领域
本发明涉及一种松花粉超临界萃取物中活性成分β-谷甾醇的含量的测定方法。
背景技术
松花粉( Pollen Pini) 是松科植物马尾松( Pinus massonina lamb) 、油松( Pinus tabulaefermiscarr)
等植物于春季花刚开时将雄球采摘，晒干，搓下花粉，收集，除去杂质所得的淡黄色细花粉，为《中国药典》收载品种 [参见：ChP(中国药典) . 2010. VolⅠ(一部):191] 。松花粉的开发利用在我国有着悠久的历史，所含的多种生物活性物质对人体的生命活动有重要的调节作用，具有抗衰老、抗疲劳、调节血脂、降血糖、护肝、美容等多种药理作用。文献报道松花粉中含有丰富的植物甾醇，主要由β-谷甾醇、菜油甾醇及少量豆甾醇等组成。植物甾醇具有降低胆固醇的显著作用，可以用于防治心血管疾病。其中，β-谷甾醇具有燥湿化痰、降低胆固醇、抗癌、抗炎等作用，疗效显著[参见：杜孟浩，王敬文，张金萍. 松花粉超临界二氧化碳萃取物降血脂功能实验研究.[J]中国现代医学杂志.2008,18(21):3171；高爱新，王舟莲，王敬文等. 超临界CO2萃取技术提取松花粉中植物甾醇的研究. [J] 食品科技. 2010,35(4):208]。
超临界CO2 萃取是一种新兴的分离技术，具有无易燃性、无化学反应、无毒、无污染、安全性高、操作简单等优点，在天然产物提取中越来越受到重视。对松花粉进行超临界CO2萃取，可以避免有机溶剂的残留，提高生产效率，同时在提取过程中不易破坏松花粉中的有效物质，大大提高甾醇的萃取量，具有广阔的市场前景[参见：邵兴军，丁德华，郦宏岩等. 超临界CO2萃取松花粉中有效成分的方法. [P] 中国专利：200810155138.3，2009-03-18；冯武，范国栋，刘嘉宝. 云南松花粉超临界CO2脱脂研究. [J] 云南林业科技.2003,(1):63；] 。
松花粉活性成分复杂，虽被《中国药典》收载，规定了制法、显微鉴别和检查项目，但未对其活性有效成分的含量做出质控标准。松花粉超临界萃取物作为具有市场前景的中药提取物，其活性成分的研究文献很少，尚未见针对松花粉超临界萃取物进行甾醇成分的提取、GC-MS鉴别和测定技术的文献及专利。本发明首次针对超临界流体萃取松花粉中的甾醇成分进行了全面分析，并对其主成分β-谷甾醇建立了简便可行的提取分析方法，为测定松花粉超临界萃取物中的的β-谷甾醇提供了一个可行的方案，同时也为进一步合理开发和综合利用该萃取物提供了参考依据。
发明内容
本发明的目的在于设计提供一种针对超临界流体萃取松花粉中甾醇类活性成分进行含量测定方法的技术方案。
本发明的技术方案如下：
一种松花粉超临界萃取物中谷甾醇的含量的测定方法，它包括如下步骤：
步骤1. 标准储备液的制备：精密称取β-谷甾醇对照品，置10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得100 μg·ml-1β-谷甾醇标准储备液；
步骤2. 供试样品溶液的制备：精密称取松花粉超临界萃取物2.0000 g，置250 ml三颈烧瓶中，加入40mL 1 mol∙L-1
KOH无水乙醇溶液，于95℃皂化回流3 h，加一倍蒸馏水稀释，用无水乙醚提取非皂化合物4~5次，合并提取液，经少量蒸馏水多次洗涤至中性，再用0.5 mol∙L-1 KOH水溶液充分振荡洗涤3次，最后用水洗成中性，加无水硫酸钠过夜脱水干燥，过滤，回收乙醚，得非皂化合物，称重，精密称取0.01 g非皂化合物，用甲醇溶解，定容于10 ml容量瓶，离心后取上清液稀释10倍，得供试样品溶液；
步骤3. 气相色谱-质谱条件：色谱条件：柱温：从240℃开始，以15℃·min-1的速度升到285℃，并保持30 min；气化温度为300℃；载气为高纯度氦气，流量1.0 ml·min-1；进样量：10 µl；质谱条件：EI离子源，电子能量70Ev，离子源温度200℃；
步骤4. β-谷甾醇的测定：取上述供试品溶液或β-谷甾醇标准溶液进行高效液相色谱分析，色谱条件：色谱柱：Shim-park C18柱（150mm×4.6mm）；流动相：甲醇；流速：1.0 ml∙min-1；检测波长：210 nm；进样量：20 µl。
本发明方法是在取上述供试品溶液适量进行GC/MS分析，所得各组份的保留指数与质谱图数据入NIST数据库进行检索，得甾醇中的主要成分是β-谷甾醇，约占总含量的74.01%。故选取β-谷甾醇作为测定甾醇含量的标准品。
方法建立后，以正交实验对料液比、KOH醇溶液浓度及皂化反应温度这三个条件进行优化，确定最优提取条件为：料液比1∶20，KOH醇溶液浓度1 mol·L-1，皂化反应温度95℃。以上述最优条件对皂化反应提取时间进行单因素考察，得出3 h为最优提取时间。
有益效果
本发明首次针对超临界流体萃取松花粉中的甾醇类成分建立了全面的分析方案，并对其主成分β-谷甾醇建立了简便可行的提取分析方法，手段先进、准确度、精密度良好，为测定松花粉超临界萃取物中的的β-谷甾醇提供了一个可靠的技术方案，同时也为进一步合理开发和综合利用该萃取物提供了参考依据。
附图说明
图1 松花粉超临界CO2萃取物供试样品总离子流色谱图；
图2 β-谷甾醇标准品色谱图；
图3 松花粉超临界CO2萃取物供试品（b）色谱图。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。
一、实验部分
仪器与试药
1200L型气相色谱/质谱联用仪（德国Varian）；液相色谱仪（日本岛津）包括：LC-10AD泵、Shimpark C18柱、SPD-20A紫外检测器、SPD-M10A DAD检测器、CLASS-VP 工作站；XT-102A型电子天平（瑞士Precisa）等。
松花粉超临界CO2萃取物（SFE-PP，江苏江大源生态生物科技有限公司）；β-谷甾醇对照品（Sigma-Aldrich公司，USA）；除高效液相色谱法用甲醇为色谱纯外，其余试剂为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。
实验方法
标准储备液的制备：精密称取β-谷甾醇对照品适量置10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得100 μg·ml-1β-谷甾醇标准储备溶液。
2.2 供试样品溶液的制备：精密称取松花粉超临界萃取物2.0000 g，置250 ml三颈烧瓶中，加入40mL 1 mol∙L-1
KOH无水乙醇溶液，于95℃皂化回流3 h，加一倍蒸馏水稀释，用无水乙醚提取非皂化合物4~5次，合并提取液，经少量蒸馏水多次洗涤至中性，再用0.5 mol∙L-1 KOH水溶液充分振荡洗涤3次，最后用水洗成中性，加无水硫酸钠过夜脱水干燥，过滤，回收乙醚，得非皂化合物，称重。精密称取0.01 g非皂化合物，用甲醇溶解，定容于10 ml容量瓶，离心后取上清液稀释10倍，得供试样品溶液。
2.3 GC/MS条件：色谱条件：柱温：从240℃开始，以15℃·min-1的速度升到285℃，并保持30 min；气化温度为300℃；载气为高纯度氦气，流量1.0 ml·min-1。进样量：10 µl。质谱条件：EI离子源，电子能量70Ev，离子源温度200℃。
2.4 β-谷甾醇的测定：取上述供试品溶液或β-谷甾醇标准溶液进行高效液相色谱分析，色谱条件：色谱柱：Shim-park C18柱（150mm×4.6mm）；流动相：甲醇；流速：1.0 ml∙min-1；检测波长：210 nm；进样量：20 µl。
1. GC/MS法对SFE-PP中甾醇成分的定性分析
取供试品溶液适量按2.3项下进行GC/MS分析，所得各组份的保留指数与质谱图数据入NIST数据库进行检索。可得甾醇中的主要成分是β-谷甾醇，约占总含量的74.01%。故选取β-谷甾醇作为测定甾醇含量的标准品。提取物经鉴定的主要成分见下表1。总离子流色谱图见图1。
表1 超临界萃取松花粉提取物的化学成分
| 主要甾醇类成分 | 保留时间(min) | 峰面积(%) |
| 菜油甾醇 | 19.13 | 14.82 |
| 豆固醇 | 19.94 | 0.74 |
| 乙基异胆甾醇 | 21.46 | 0.95 |
| β-谷甾醇 | 22.81 | 74.01 |
| 岩皂甾醇 | 23.26 | 5.13 |
| 环阿屯醇 | 25.93 | 2.04 |
| 甲烯基环阿屯醇 | 28.77 | 2.31 |
2. 色谱峰的鉴定
精密量取2.1项下的β-谷甾醇标准溶液和2.2项下的供试样品溶液按2.4项下进行色谱分析，得色谱图2和图3。β-谷甾醇保留时间（tR）均为17min左右。
3. 标准曲线的绘制
精密量取β-谷甾醇标准储备液0.50 ml、1.00 ml、2.00 ml、3.00 ml置5 ml量瓶中，加甲醇稀释并定容得β-谷甾醇标准溶液，取β-谷甾醇标准溶液及储备液按2.4项下进行色谱分析，以β-谷甾醇标准品的浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，对所得数据进行回归，求出回归方程为 y = 2141.1x + 1146.3（r =0.9999, n =5），结果表明，在实验浓度范围内β-谷甾醇的峰面积与浓度呈良好的线性关系。
4. 精密度实验
精密吸取浓度为20、30、60 μg·ml-1的β-谷甾醇标准溶液，按2.4项下进行色谱分析。每个浓度平行测定3份，以考察方法的日内精密度；以上三个浓度的标准溶液，每天测一次，连续3天，以考察方法的日间精密度。结果见表2。
表2 β-谷甾醇精密度实验结果 (n=3)
5. 加样回收率实验
精密移取一定体积已知含量的样品溶液和对照品溶液，制成低、中、高3个浓度的溶液，按2.4项下进行色谱分析。每个浓度平行测定3份，计算β-谷甾醇的加样回收率。结果见表3。
表3 β-谷甾醇加样回收率实验结果 (n=3)
Tab 3 Recovery test of β-sitosterol (n=3)
6. 供试样品中β-谷甾醇的含量测定
取2.2项下供试品溶液进行测定，按标准曲线计算出供试品溶液中的β-谷甾醇浓度。然后根据下式计算SFE-PP样品中β-谷甾醇的含量，数据见表4。
X=
式中：X——样品中β-谷甾醇含量，μg·g-1
——依据标曲计算出被测液中β-谷甾醇的浓度，μg·ml-1
M——提取得的非皂化合物的总质量，g
——测定用量瓶体积，ml
——稀释倍数，ml
——测定取样质量，g
——SFE-PP样品的质量，g
表4 β-谷甾醇测定结果
Tab 4 Quantitation of β-sitosterol in the SFE-PP
7. 皂化反应时间和提取工艺优化
在预实验的基础上，单因素实验考察不同的皂化反应时间（1、3、5、7 h）对β-谷甾醇总含量的影响，得出皂化时间为3 h时，提取的β-谷甾醇含量最大。皂化时间1 h时含量低，可能是由于提取不完全；而随着皂化时间的延长，长时间的高温可能会导致β-谷甾醇被破坏。
采用L9（34）表设计正交实验，优化皂化反应中的物料与KOH醇溶液用量比、KOH醇溶液浓度及皂化反应温度，以β-谷甾醇含量为指标的正交实验结果可以看出，三种因素对SFE-PP样品中非皂化合物的提取的影响为反应温度> KOH醇溶液浓度>物料与KOH醇溶液用量比。以β-谷甾醇含量高者选出最佳工艺为：KOH醇溶液浓度为1 mol∙L-1、物料与KOH醇溶液用量比为1∶20、皂化反应温度为95℃。
处方工艺的验证：按最优处方准确称取2.0 g SFE-PP样品，加入40ml 1 mol∙L-1的KOH无水乙醇溶液后加塞密封，95℃皂化回流3 h。皂化反应后加一倍蒸馏水稀释，用无水乙醚提取非皂化合物4~5次，合并提取液，经少量蒸馏水多次洗涤至中性，再用0.5 mol∙L-1 KOH水溶液充分振荡洗涤3次，最后用水洗成中性，加无水硫酸钠过夜脱水干燥，过滤，回收乙醚，得非皂化合物。精密称取0.01 g非皂化合物，用分析纯甲醇溶解，定容于10 ml量瓶，离心后取上清液稀释10倍，在实验设定条件下进行HPLC测定，进一步计算得β-谷甾醇含量为32.22 mg·g-1。
Claims (1)
1.一种松花粉超临界萃取物中谷甾醇的含量的测定方法，其特征是它包括如下步骤：
步骤1. 标准储备液的制备：精密称取β-谷甾醇对照品，置10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得100 μg·ml-1β-谷甾醇标准储备液；
步骤2. 供试样品溶液的制备：精密称取松花粉超临界萃取物2.0000 g，置250 ml三颈烧瓶中，加入40mL 1 mol∙L-1
KOH无水乙醇溶液，于95℃皂化回流3 h，加一倍蒸馏水稀释，用无水乙醚提取非皂化合物4~5次，合并提取液，经少量蒸馏水多次洗涤至中性，再用0.5 mol∙L-1
KOH水溶液充分振荡洗涤3次，最后用水洗成中性，加无水硫酸钠过夜脱水干燥，过滤，回收乙醚，得非皂化合物，称重，精密称取0.01 g非皂化合物，用甲醇溶解，定容于10 ml容量瓶，离心后取上清液稀释10倍，得供试样品溶液；
步骤3. 气相色谱-质谱条件：色谱条件：柱温：从240℃开始，以15℃·min-1的速度升到285℃，并保持30 min；气化温度为300℃；载气为高纯度氦气，流量1.0 ml·min-1；进样量：10 µl；质谱条件：EI离子源，电子能量70Ev，离子源温度200℃；
步骤4. β-谷甾醇的测定：取上述供试样品溶液或β-谷甾醇标准溶液进行高效液相色谱分析，色谱条件：色谱柱：Shim-park C18柱，规格：150mm×4.6mm；流动相：甲醇；流速：1.0 ml∙min-1；检测波长：210 nm；进样量：20 µl；所述的β-谷甾醇标准溶液如下法配制：精密量取β-谷甾醇标准储备液0.50 ml、1.00 ml、2.00 ml、3.00 ml置5 ml量瓶中，加甲醇稀释并定容得β-谷甾醇标准溶液。
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