CN114034786A - 牡丹花粉和花蕊中植物甾醇的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了牡丹花粉和花蕊中植物甾醇含量的检测方法。本发明所提供的牡丹花粉和花蕊中植物甾醇的检测方法，包括以下步骤：(1)水解；(2)萃取；(3)水洗；(4)衍生化；(5)标准品配制；(6)GC‑MS/MS分析。为了保证牡丹花粉甾醇成分准确检测，本发明采用气质色谱法，同时考察碱水解、酸碱水解对样品中甾醇检测的影响，并优化植物甾醇前处理过程和色谱分析方法，以建立一种简单、重现性好、准确度高的植物甾醇气质分析方法。
Description
技术领域
本发明涉及植物甾醇的检测方法，特别地涉及牡丹花粉和花蕊中植物甾醇的检测方法。
背景技术
牡丹是我国特有的一种观赏药用植物，在我国已有2000多年的栽培历史，其种植面积近百万亩。牡丹全身是宝，其根、茎、叶、花和籽的利用都已经有一定的研究基础，在食品、医疗、保健品等行业展现出较好的前景。但每年产量估计可达数千吨的牡丹花粉，却因研究开发力度较小，致使大量的资源被浪费。2011 年3月，卫计委发布了关于批准牡丹籽油作为新资源食品的公告。牡丹种植面积和开发利用得到大力发展。
花粉是植物体上的雄性生殖细胞，是植物的精华，被认为是绿色、健康的新型天然保健品和滋补药品原料。在调节新陈代谢、提高机体免疫力、降脂、抗癌、预防前列腺疾病等方面具有显著的疗效。其中类黄酮、脂肪酸、尤其是植物甾醇被认为是其主要的药理活性成分。花粉中关于类黄酮和脂肪酸成分报道较多，但其主要活性成分植物甾醇的测定却研究较少。植物甾醇是一种天然产物，具有降低血液胆固醇、防治前列腺肥大、增强免疫力、抗癌、类激素等多种生理功能，且不会产生副作用，已被广泛应用于功能食品、保健品、化妆品、医药等行业。
由于植物甾醇分析较复杂，文献方法差别较大，此外油样甾醇报道较多，其它食品样品甾醇检测报道却较少，花粉样品更少。
发明内容
为了弥补以上领域的不足，本发明的主要目的是提供一种操作简单，重复性好，准确度和灵敏度高的牡丹花粉和花蕊中植物甾醇含量的检测方法。
本发明所提供的牡丹花粉和花蕊中植物甾醇的检测方法，包括以下步骤：
(1)水解：分别向牡丹花粉、花蕊样品中加入内标，并按照料液比为 1:15～1:35g/mL的比例分别加入氢氧化钾-90％乙醇水溶液，混匀，水浴后冷却至室温，分别得到牡丹花粉、花蕊反应液；
(2)萃取：将牡丹花粉、花蕊反应液分别倒入分液漏斗中，加入水和正己烷萃取，于分液漏斗中静置分层，收集牡丹花粉、花蕊有机层萃取液；
(3)水洗：将牡丹花粉、花蕊萃取液水洗至中性，用无水硫酸钠脱水置旋蒸瓶中，浓缩，氮气吹干，得到干燥样品；
(4)衍生化：在干燥样品中加入衍生剂和吡啶进行硅烷化衍生，涡旋混匀，水浴后氮气吹干；加正己烷定容，过滤膜，分别得到牡丹花粉、花蕊样品待测液；
(5)标准品配制：配制同时含有内标和多种待测植物甾醇的系列标准溶液，按照所述步骤(4)的方法进行硅烷化衍生，并进行气质分析；以甾醇标准品的浓度为横坐标，其峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，得到内标标准工作曲线；
(6)GC-MS/MS分析：将样品待测液和标准品分别注入气质色谱仪进行分析，通过标准品、保留时间、NIST14质谱库以及相关文献对样品进行定性分析；利用待测液中植物甾醇与内标的峰面积比，对应标准曲线，计算所述牡丹花粉、花蕊样品中植物甾醇的含量。
优选地，所述步骤(1)中所述氢氧化钾-90％乙醇水溶液中氢氧化钾在90％乙醇水溶液中的浓度为3～6moL/L。
优选地，步骤(2)中所述萃取为：分液漏斗中震摇萃取3～5min。
优选地，所述步骤(2)中所述氢氧化钾-90％乙醇水溶液、水、正己烷的体积比为1:1:2～3:1:5mL/mL/mL。
优选地，所述步骤(4)中所述衍生剂为N,O-双(三甲基硅)三氟乙酰胺(含1％三甲基氯硅烷)；所述样品与衍生剂的质量体积比为2:1～1:2mg/μL。
优选地，所述步骤(6)中所述GC-MS/MS分析的条件为：色谱柱：HP-5MS；升温程序：200℃保持1min，5℃/min升温至265℃，保持2min，然后以3℃/min 升至283℃，保持5min，以2℃/min升至300℃，保持10min；分流比：15：1；进样口温度：300℃；进样量：1μL；载气为高纯氦气，其流速定：1.0mL/min； EI离子源，电子能量：70eV，传输线温度：300℃，离子源温度：230℃，四级杆温度：150℃，质量扫描范围：40-650m/z。
优选地，所述牡丹花粉样品在水解前需要进行破壁处理；所述牡丹花蕊样品在水解前不需要进行破壁处理。
优选地，所述牡丹花粉的最佳采收时期是露色期，所述牡丹花蕊的最佳采收时期是硬蕾期；如果二者同时采收，选择露色期。
优选地，所述牡丹品种为‘凤丹’。
所述步骤(6)进行定性分析之后，如果所述样品的植物甾醇化学结构中不含有亚甲基侧链或亚乙基侧链或9,19-环丙烷结构，则样品甾醇分析的步骤(1) 改为进行酸碱水解的步骤：向所述样品中加入盐酸-乙醇溶液，混匀，水浴后冷却至室温；再加入氢氧化钾-90％乙醇水溶液，混匀，水浴后冷却至室温，得到反应液，然后上述步骤(2)～步骤(6)进行甾醇检测。
本发明以种植面积最大的油用牡丹主栽品种‘凤丹’花粉为研究对象，对其花粉主要活性成分进行研究。为保证牡丹花粉甾醇成分的准确检测，本发明采用 GC-MS进行检测，同时考察碱水解、酸碱水解对样品中甾醇提取的影响，并优化植物甾醇前处理过程和色谱分析方法，旨在建立一种简单、重现性好、准确度高的植物甾醇分析方法。此外，由于花粉在收集过程中会产生大量的花蕊(花药去花粉后的部分)，二者可能存在相似的活性成分，因此本发明首次对其进行平行研究，为牡丹资源的挖掘奠定基础。同时本发明还考察了不同时期和温差破壁对其植物甾醇含量的影响。旨在为牡丹花粉和花蕊的合理采收时间和科学检测提供依据，也为其它食品甾醇成分的准确检测提供参考。
附图说明
为了说明而非限制的目的，现在将根据本发明的优选实施例、特别是参考附图来描述本发明，其中：
图1为不同采收时间下的‘凤丹’花粉和花蕊。
图2为不同前处理下‘凤丹’花粉和花蕊植物甾醇硅烷化GC-MS色谱图；(A) 花粉碱水解提取(B)花粉酸碱水解提取(C)花蕊碱水解提取(D)花蕊酸碱水解提取；分子量相同的色谱峰标注相同的颜色。
图3为‘凤丹’花粉和花蕊中植物甾醇化学结构式。
图4为异岩藻甾醇、24-亚甲基胆甾醇、环阿屯醇酸催化下可能的代谢机制。
图5为样品甾醇分析流程图。
具体实施方式
需要说明的是，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案作进一步的详细说明。
实施例1、牡丹花粉和花蕊中植物甾醇检测(酸碱水解方法)
1、样品收集
在上午十点前进行采样，采集不同时期‘凤丹’花药(山西省长治市牡丹种植区)，在室温条件下(20～25℃)自然通风干燥，然后反复过筛将花药分成花粉和花蕊两部分(图1)，机械粉碎，过80目筛，在真空干燥箱中干燥3天，完全干燥的花粉和花蕊置于棕色玻璃干燥器中密封保存。
2、植物甾醇的酸碱水解提取
(1)水解：准确称取花粉、花蕊样品各0.3g，置于16mL玻璃具塞离心管中，加入0.6mg/mL内标(花粉1mL，花蕊0.2mL)，加2moL/L盐酸-乙醇(5mL)，涡旋混匀，80℃水浴60min，每隔10min震摇一下，冷却至室温。加10mL氢氧化钾-90％乙醇水溶液(4moL/L)，涡旋混匀，80℃恒温震荡60min，每隔10min 震摇一下，冷却至室温，得到反应液。
(2)萃取：将反应液倒入分液漏斗中，加入10mL水，分3次每次加入20 mL正己烷萃取3min左右，于分液漏斗中静置分层，收集萃取液。
(3)水洗：加100mL水，将萃取液水洗3次至中性，无水硫酸钠脱水置旋蒸瓶中。32℃减压浓缩至2mL，用吸管将液体转移置具塞玻璃试管，氮气吹干。
(4)衍生化：加入500μL衍生剂(N,O-双(三甲基硅)三氟乙酰胺(含1％三甲基氯硅烷))和吡啶(1:1,v/v)，涡旋混匀，75℃水浴40min，氮气吹干。加色谱正己烷定容(花粉定容至5mL，花蕊定容至1mL)，过0.22um膜，置进样瓶中。
3、植物甾醇硅烷化的GC-MS/MS分析
分析系统为GC7890A/MS5975C型气相色谱质谱联用仪，色谱柱为HP-5MS (30m×0.25mm×0.25m，Agilent)。升温程序如下：200℃保持1min，5℃/min 升温至265℃，保持2min，然后以3℃/min升至283℃，保持5min，以2℃/min 升至300℃，保持10min。分流比15：1，进样口温度为300℃，进样量1L，载气为高纯氦气，其流速定为1.0mL/min；EI离子源，电子能量为70eV，传输线温度300℃，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，质量扫描范围：40-650m/z。
4、标准曲线的建立
植物甾醇的定量方法采用内标标准曲线法。5α-胆甾烷、豆甾醇、β-谷甾醇，购自北京沃凯生物科技有限公司；菜油甾醇，购自上海麦克林生化科技有限公司； 24-亚甲基胆甾醇购自Sigma公司。将标准品配成一系列不同浓度的标准溶液，使样品中甾醇检测含量都在线性范围内：β-谷甾醇浓度为0.05、0.2、0.8、1.6、 3.2、6.4mg/mL；菜油甾醇浓度为0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1mg/mL；豆甾醇浓度为0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.3mg/mL；24-亚甲基-胆甾醇浓度为0.02、 0.1、0.5、2、4、8mg/mL，其中内标(5α-胆甾烷)浓度为0.12mg/mL。按照步骤3中衍生化进行硅烷化衍生，并进行气质分析。以甾醇标准品的浓度为横坐标，其峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，得到内标标准工作曲线。其中相关系数 r2>0.997，表明线性较好。样品中其它微量成分根据其结构和标准品的相似性对其进行定量，如表1所示。
表1植物甾醇的标准曲线和线性范围
5、植物甾醇结构的鉴定
本发明采用GC-MS/MS对酸碱水解下的‘凤丹’花粉和花蕊植物甾醇成分进行分析，虽然其植物甾醇种类较多且相似性较高，但大部分甾醇实现了较好的分离，如图2所示，其中，B图为花粉酸碱水解提取结果，D图为花蕊酸碱水解提取结果。
通过GC-MS/MS分析，‘凤丹’花粉和花蕊酸碱水解下检出多种植物甾醇同分异构体，这为植物甾醇化合物的结构鉴定带来很大的困难。通过标准品、保留时间、NIST14质谱库和文献，对其植物甾醇化合物进行了反复鉴定，最终在该方法下，‘凤丹’花粉和花蕊中共有16种植物甾醇化合物被鉴定，如表2所示。它们分别为：胆固醇(cholesterol,1)，麦角-5,23-二烯-3β-醇(ergosta-5,23-dien-3β-ol,2)， 24-亚甲基胆甾醇(24-methylenecholesterol,3)，菜油甾醇(campasterol,4)，豆甾醇 (stigmasterol,5)，24-甲基链甾醇(24-methyldesmosterol,6)，△5,23-豆甾二烯醇 (△5,23-stigmastadienol,7)，赤桐甾醇(clerosterol,8)，钝叶醇(obtusifoliol,9)，β-谷甾醇(β-sitosterol,10)，β-香树脂醇(β-amyrin,11)，异岩藻甾醇(isofucosterol,12)，帕克醇(parkeol,13)，△5,24-豆甾二烯醇(△5,24-stigmastadienol,14)，羊毛甾醇 (lanosterol,15)，环阿屯醇(cycloartenol,16)。其中，酸碱水解下，花粉中有13种植物甾醇被鉴定(1，2，3，4，5，6，10，11，12，13，14，15，16)，花蕊中有16种植物甾醇被鉴定(1-16)。其中含有大量同分异构体，其化学结构式如图 3所示。综上可见，‘凤丹’花粉、花蕊都含有丰富的植物甾醇成分，这为其活性功能的实现奠定了基础。
表2‘凤丹’花粉和花蕊中植物甾醇成分的硅烷化鉴定
注：a：相对保留时间，即色谱峰与β-Sitosterol(25.99min)洗脱时间的比值。b：基峰。
6、植物甾醇定量分析
如表3所示，酸碱水解方法下，‘凤丹’花粉中有13种植物甾醇被鉴定，其含量为24-methylenecholesterol>24-methyldesmosterol>ergosta-5,23-dien-3β-ol>campasterol。花蕊植物甾醇种类较花粉更多，在该方法下有16种甾醇被检出，其含量为β-sitosterol>campasterol>24-methyldesmosterol> 24-methylenecholesterol。其中花蕊新增的3种甾醇成分为△5,23-stigmastadienol，clerosterol，obtusifoliol，这些甾醇含量在10.25-38.29mg/100g。虽然花蕊的甾醇种类更多，但就其甾醇总含量来说，花粉(2965.62mg/100g)却是花蕊(1037.14 mg/100g)的3倍左右。主要是因为花粉中24-methylenecholesterol(1134.83 mg/100g)和24-methyldesmosterol(1203.17mg/100g)含量较高是花蕊中 24-methylenecholesterol(135.59mg/100g)和24-methyldesmosterol(158.55mg/100 g)含量的8倍左右。通过对‘凤丹’花粉、花蕊甾醇成分的检测可以得知，花蕊的甾醇种类较花粉更丰富，且主要甾醇成分含量差异较小，可能具有更广的药理活性。而花粉的总甾醇含量比花蕊高很多，且主要甾醇成分 24-methylenecholesterol和24-methyldesmosterol占总甾醇含量的80％左右，是 24-methylenecholesterol和24-methyldesmosterol开发和利用的好原料。
表3酸碱水解方法下‘凤丹’花粉和花蕊中植物甾醇含量(mg/100g,n＝3)
实施例2、牡丹花粉和花蕊中植物甾醇检测(碱水解方法)
在实施例1的基础上将2、植物甾醇的酸碱水解提取(1)水解操作更改为2、植物甾醇的碱水解提取(1)水解：准确称取花粉、花蕊样品各0.3g，分别置于 16mL玻璃具塞离心管中，分别加入0.6mg/mL5α-胆甾烷内标(花粉1mL，花蕊0.2mL)，加入4moL/L氢氧化钾-90％乙醇水溶液(10mL)，涡旋混匀，80℃水浴60min，每隔10min震摇一下，冷却至室温，得到反应液。其他步骤同实施例1。
1、植物甾醇结构的鉴定
本发明采用GC-MS/MS对碱水解下的‘凤丹’花粉和花蕊植物甾醇成分进行分析，虽然其植物甾醇种类较多且相似性较高，但大部分甾醇实现了较好的分离，如图2所示，其中，A图为花粉碱水解提取结果，C图为花蕊碱水解提取结果。
在GC-MS/MS分析中，通过对比标准品、保留时间、NIST14质谱库和文献，对其植物甾醇化合物进行了反复鉴定，最终在该方法下，‘凤丹’花粉和花蕊中共有11种植物甾醇化合物被鉴定，如表2所示。它们分别为：胆固醇(cholesterol,1)， 24-亚甲基胆甾醇(24-methylenecholesterol,3)，菜油甾醇(campasterol,4)，豆甾醇 (stigmasterol,5)，钝叶醇(obtusifoliol,9)，β-谷甾醇(β-sitosterol,10)，β-香树脂醇(β-amyrin,11)，异岩藻甾醇(isofucosterol,12)，△5,24-豆甾二烯醇 (△5,24-stigmastadienol,14)，羊毛甾醇(lanosterol,15)，环阿屯醇(cycloartenol,16)。其中，碱水解下，花粉中有6种植物甾醇被鉴定(3，5，10，11，12，16)，花蕊中有11种植物甾醇被鉴定(1，3，4，5，9，10，11，12，14，15，16)。其中含有大量同分异构体，其化学结构式如图3所示。综上可见，‘凤丹’花粉、花蕊都含有丰富的植物甾醇成分，这为其活性功能的实现奠定了基础。
2、植物甾醇定量分析
通过表4可知，‘凤丹’花粉中6种植物甾醇含量为24-methylenecholesterol> β-sitosterol>cycloartenol，花蕊植物甾醇种类较花粉更多，检出11种，其含量为 24-methylenecholesterol>β-sitosterol>campasterol>isofucosterol。其中花蕊新增的5种甾醇成分为cholesterol、lanosterol、campasterol、△5,24-stigmastadienol、obtusifoliol，这些甾醇成分除campasterol(155.36mg/100g)含量较高，其它甾醇含量在9.04-15.89mg/100g。此外二者相同的甾醇成分花蕊也比花粉含量高(除 24-methylenecholesterol)。虽然花蕊的甾醇种类更多，但就其甾醇总含量来说，花粉(3009.57mg/100g)却是花蕊(910.44mg/100g)的3倍多。主要是因为花粉中24-methylenecholesterol高达2857.69mg/100g是花蕊 24-methylenecholesterol(348.28mg/100g)的8倍多。通过对‘凤丹’花粉、花蕊甾醇成分的检测可以得知，花蕊的甾醇种类较花粉更丰富，且主要甾醇成分含量差异较小，可能具有更广的药理活性。而花粉的总甾醇含量比花蕊高很多，且主要甾醇成分24-methylenecholesterol占总甾醇含量的95％，是 24-methylenecholesterol开发和利用的好原料。
表4碱水解方法下‘凤丹’花粉和花蕊中植物甾醇含量(mg/100g,n＝3)
3、植物甾醇提取方法(碱水解和酸碱水解)比较
分别采用碱水解和酸碱水解对‘凤丹’花粉、花蕊植物甾醇进行测定，如表3 和表4所示，无论是花粉还是花蕊，两种方法下测定的甾醇种类和部分甾醇的含量存在较大差异，但总甾醇含量相近。通过甾醇化合物结构可以发现，花粉和花蕊中存在大量甾醇同分异构体，且两种检测方法下每种同分异构体的含量差异较大。我们以甾醇种类最多的花蕊为研究对象，对三个时期花蕊样品中所测得的植物甾醇同分异构化合物的含量进行归纳，其结果如表5。可以发现，在两种检测方法下有三组同分异构体甾醇总含量之比接近1。通过结构的相似性和总含量的接近，可以得出结论‘凤丹’花粉和花蕊在强酸条件下异岩藻甾醇、24-亚甲基胆甾醇、环阿屯醇会降解，部分异构化为同分异构体，从而使‘凤丹’花粉和花蕊在酸碱水解下检测出更多的甾醇成分，但同碱水解相比，其总甾醇含量却相差无几。进一步推测，含有亚甲基侧链，亚乙基侧链和9,19-环丙烷结构的植物甾醇在强酸条件下，可能也会发生重排反应，异构为同分异构体。其可能的反应机制如图 4所示。
即对于‘凤丹’花粉、花蕊或其它含有这三种基团(亚甲基侧链，亚乙基侧链和9,19-环丙烷结构)的甾醇样品来说，只能选择碱水解来进行甾醇的检测，但如果样品中甾醇成分不含这三种基团，酸碱水解则可能更适合其甾醇成分的检测。其它样品的甾醇检测方法如图5所示。
表5碱水解和酸碱水解下‘凤丹’花蕊中植物甾醇同分异构体的含量(mg/100g, n＝3)
注：nd：含量较低未检测到。比值：碱水解总甾醇含量/酸碱水解总甾醇含量。
实施例3、牡丹花粉和花蕊中植物甾醇检测方法的优化
由于植物甾醇分析较复杂，文献方法差别较大，此外油样甾醇报道较多，其它食品样品甾醇检测报道较少，花粉样品更少。为了保证牡丹花粉和花蕊植物甾醇测定结果的准确性，我们对植物甾醇的提取和分析的关键参数进行了优化，其优化方面如下。其他步骤同实施例1。
1、植物甾醇的提取方法优化
在实施例1的基础上对操作2、植物甾醇的提取中关键参数进行优化，每一次甾醇检测只设置一个操作步骤的改变，其他步骤不变同实施例1。考察的操作步骤如下：
(1)水解：①碱水解提取：不加酸，碱的浓度分别为1、2、4、6moL/L。②酸碱水解提取：酸浓度保持不变，碱的浓度分别为2、4、6、8moL/L。两种方法下，无论是花粉还是花蕊当碱浓度为4moL/L时，其检测的甾醇总含量最高，是较为合适的碱水解和酸碱水解浓度。如表6和表7所示。
(2)萃取：①分液漏斗中萃取3min。②离心管中涡旋萃取1min。③离心管中超声萃取10min。对这三种萃取方法的考察可以发现，涡旋萃取，易发生乳化现象，较难分层。超声萃取，萃取效率低。分液漏斗中萃取，萃取效率较高，且分层较快。
(3)衍生剂用量(150μL、250μL、300μL)，可以发现当衍生剂为150μL，花粉甾醇峰衍生不彻底，衍生剂为250μL和300μL时，衍生彻底，故衍生剂用量为250μL。
表6碱水解下不同碱浓度对‘凤丹’花粉和花蕊甾醇含量的影响(mg/100g,n＝3)
注：1：碱的浓度。2：含量较低未检测到。3：总甾醇的含量。
表7酸碱水解下不同碱浓度对‘凤丹’花粉和花蕊甾醇含量的影响(mg/100g,n＝3)
注：1：碱的浓度。2：含量较低未检测到。3：总甾醇的含量。
2、植物甾醇硅烷化的GC-MS/MS分析方法优化
在实施例1的基础上对操作3、植物甾醇硅烷化的GC-MS/MS分析中关键参数进行优化，每一次甾醇检测只设置一个操作步骤的改变，其他步骤不变同实施例1。考察的方面如下：
(1)进样口温度(280℃、300℃)，结果显示进样口温度300℃较280℃部分主峰分离效果更好点。
(2)分流比(10:1、15:1、20:1、40:1)，分流比为10:1时样品量太大，主峰太高，部分峰的分离效果较差，当分流比为40:1和20:1时，部分小峰未识别出来，综合来看分流比为15:1较合适。
(3)流速(1mL/min、1.2mL/min、1.5mL/min)，流速为1.5mL/min时部分峰分离效果较差，流速为1mL/min和1.2mL/min时甾醇峰分离效果更好一些，最终选择流速流速为1mL/min。
(4)洗脱梯度。由于‘凤丹’花粉和花蕊中植物甾醇结构相似且成分多，出峰时间较集中，需要优化洗脱梯度。为了使内标与其它成分分离，其分离温度设在265-270℃。为了优化峰2、3、4和峰10、11、12的分离(如图2)，升温速率为2-3℃/min，温度设置在280-285℃较为合适。
实施例4、破壁及不同花期的牡丹花粉和花蕊中植物甾醇的检测
1、样品收集
在上午十点前进行采样，采集不同时期‘凤丹’花药(山西省长治市牡丹种植区)，在室温条件下(20～25℃)自然通风干燥，然后反复过筛将花药分成花粉和花蕊两部分(图1)，机械粉碎，过80目筛，在真空干燥箱中干燥3天，完全干燥的花粉和花蕊置于棕色玻璃干燥器中密封保存。
2、花粉和花蕊破壁处理
采用温差法对收集的‘凤丹’花粉和花蕊进行破壁处理：称取适量花粉和花蕊粉末在多层锡箔纸的包裹下，放入-70℃冰箱内冷冻24h，取出后迅速放入95℃水浴锅中水浴10min进行温差破壁。
3、植物甾醇的检测
基于实施例1和实施例2可知，‘凤丹’花粉、花蕊在强酸条件下会使其中的甾醇成分24-methylenecholesterol、cycloartenol、isofucosterol发生重排，部分异构化为同分异构体，因此我们采用碱水解的方法(实施例2)对样品中的甾醇成分进行检测。此外，破壁可能会使样品中的甾醇成分更好的被检测，而不同花发育时期的花粉和花蕊甾醇含量也可能存在差异，因此我们对此进行了考察。破壁及不同采收时期(硬蕾期、露色期、初开期，如图1)的牡丹花粉、花蕊植物甾醇含量结果见表8和表9。
表8碱水解下不同时期破壁前后‘凤丹’花粉植物甾醇的含量(mg/100g,n＝3)
注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。nd：含量较低未检测到。
表9碱水解下不同时期破壁前后‘凤丹’花蕊植物甾醇的含量(mg/100g,n＝3)
注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。nd：含量较低未检测到。
在结构鉴定中，‘凤丹’花粉中我们检测到6种植物甾醇成分，其中有2种甾醇成分(stigmasterol，β-amyrin)是首次在牡丹花粉中被鉴定。‘凤丹’花蕊中则检测出11种植物甾醇，其甾醇种类比花粉丰富，却首次被用来进行植物甾醇研究。与牡丹花粉相比，‘凤丹’花蕊中有5种甾醇成分(stigmasterol，β-amyrin， lanosterol，△5,24-stigmastadienol，obtusifoliol)是首次被鉴定；同其它品种花粉相比，有2种甾醇成分(△5,24-stigmastadienol，obtusifoliol)是首次被鉴定。
破壁前后比较可以看出，不同时期，破壁使‘凤丹’花粉甾醇检测含量增加，对花蕊的甾醇含量影响不大。因此，破壁适合花粉甾醇的检测，而花蕊甾醇检测则不需要破壁。可见甾醇成分的检测并不都需要样品破壁处理，要视样品而定。
通过对‘凤丹’花粉和花蕊硬蕾期、露色期、初开期三个阶段的植物甾醇含量分析可以发现，‘凤丹’花粉的最佳采收时期是露色期，花蕊的最佳采收时期是硬蕾期，但二者同时采收，考虑到总甾醇的含量，露色期较为合适。本发明为‘凤丹’花粉和花蕊的合理采收时间提供依据。
上述具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限制。本领域技术人员应该明白的是，取决于设计要求和其他因素，可以发生各种各样的修改、组合、子组合和替代。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明保护范围
Claims (10)
1.牡丹花粉和花蕊中植物甾醇的检测方法，包括以下步骤：
(1)水解：分别向牡丹花粉、花蕊样品中加入内标，并按照料液比为1:15～1:35g/mL的比例分别加入氢氧化钾-90％乙醇水溶液，混匀，水浴后冷却至室温，分别得到牡丹花粉、花蕊反应液；
(2)萃取：将牡丹花粉、花蕊反应液分别倒入分液漏斗中，加入水和正己烷萃取，于分液漏斗中静置分层，收集牡丹花粉、花蕊有机层萃取液；
(3)水洗：将牡丹花粉、花蕊萃取液水洗至中性，用无水硫酸钠脱水置旋蒸瓶中，浓缩，氮气吹干，得到干燥样品；
(4)衍生化：在干燥样品中加入衍生剂和吡啶进行硅烷化衍生，涡旋混匀，水浴后氮气吹干；加正己烷定容，过滤膜，分别得到牡丹花粉、花蕊样品待测液；
(5)标准品配制：配制同时含有内标和多种待测植物甾醇的系列标准溶液，按照所述步骤(4)的方法进行硅烷化衍生，并进行气质分析；以甾醇标准品的浓度为横坐标，其峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，得到内标标准工作曲线；
(6)GC-MS/MS分析：将样品待测液和标准品分别注入气质色谱仪进行分析，通过标准品、保留时间、NIST14质谱库以及相关文献对样品进行定性分析；利用待测液中植物甾醇与内标的峰面积比，对应标准曲线，计算所述牡丹花粉、花蕊样品中植物甾醇的含量。
2.根据权利要求1所述的牡丹花粉和花蕊中植物甾醇的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中所述氢氧化钾-90％乙醇水溶液中氢氧化钾在90％乙醇水溶液中的浓度为3～6moL/L。
3.根据权利要求1所述的牡丹花粉和花蕊中植物甾醇的检测方法，其特征在于：步骤(2)中所述萃取为：分液漏斗中震摇萃取3～5min。
4.根据权利要求1所述的牡丹花粉和花蕊中植物甾醇的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中所述氢氧化钾-90％乙醇水溶液、水、正己烷的体积比为1:1:2～3:1:5mL/mL/mL。
5.根据权利要求1所述的牡丹花粉和花蕊中植物甾醇的检测方法，其特征在于：所述步骤(4)中所述衍生剂为N,O-双(三甲基硅)三氟乙酰胺(含1％三甲基氯硅烷)；所述样品与衍生剂的质量体积比为2:1～1:2mg/μL。
6.根据权利要求1所述的牡丹花粉和花蕊中植物甾醇的检测方法，其特征在于：所述步骤(6)中所述GC-MS/MS分析的条件为：色谱柱：HP-5MS；升温程序：200℃保持1min，5℃/min升温至265℃，保持2min，然后以3℃/min升至283℃，保持5min，以2℃/min升至300℃，保持10min；分流比：15：1；进样口温度：300℃；进样量：1μL；载气为高纯氦气，其流速定：1.0mL/min；EI离子源，电子能量：70eV，传输线温度：300℃，离子源温度：230℃，四级杆温度：150℃，质量扫描范围：40-650m/z。
7.根据权利要求1所述的牡丹花粉和花蕊中植物甾醇的检测方法，其特征在于：所述牡丹花粉样品在水解前需要进行破壁处理；所述牡丹花蕊样品在水解前不需要进行破壁处理。
8.根据权利要求1所述的牡丹花粉和花蕊中植物甾醇的检测方法，其特征在于：所述牡丹花粉的最佳采收时期是露色期，所述牡丹花蕊的最佳采收时期是硬蕾期；如果二者同时采收，选择露色期。
9.根据权利要求1所述的牡丹花粉和花蕊中植物甾醇的检测方法，其特征在于：所述牡丹品种为‘凤丹’。
10.根据权利要求1所述的牡丹花粉和花蕊中植物甾醇的检测方法，其特征在于：所述步骤(6)进行定性分析之后，如果所述样品的植物甾醇化学结构中不含有亚甲基侧链或亚乙基侧链或9,19-环丙烷结构，则样品甾醇分析的步骤(1)改为进行酸碱水解的步骤：向所述样品中加入盐酸-乙醇溶液，混匀，水浴后冷却至室温；再加入氢氧化钾-90％乙醇水溶液，混匀，水浴后冷却至室温，得到反应液，然后按照权利要求1所述步骤进行甾醇检测。
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