CN110294731B - 一种利用南欧丹参提取高蒙胧木素的方法及其获得的产品和所用的响应面优化工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用南欧丹参提取高蒙胧木素的方法及其获得的产品和所用的响应面优化工艺。本发明在单因素实验时,以浸膏重量和南欧丹参主要药效成分高蒙胧木素含量的总体评价为指标,考察提取时间、提取次数、乙醇浓度和液料比等因素的影响。选取提取时间、乙醇浓度和液料比,以高蒙胧木素含量为指标,利用Box‑Benhnken中心组合原理进行三因素三水平试验,得到最佳提取工艺条件为提取时间89min、乙醇浓度77%,液料比45ml/g。在此提取条件下得到高蒙胧木素的含量为0.72mg/ml,与模型预测的0.73mg/ml偏差较小。这说明响应面法优化后的高蒙胧木素提取工艺稳定可行,可推广于产业应用。
Description
技术领域
本发明涉及植物有效成分提取技术领域,具体涉及一种利用南欧丹参提取高蒙胧木素的方法及其获得的高蒙胧木素产品和所用的响应面优化工艺。
背景技术
罗补甫克比日丸是一种常用的民族药成方制剂,具有温补脑肾、益心填精,可用于治疗阳痿、早泄、体虚消瘦、抑郁和神经衰弱的功效。罗补甫克比日丸是和田维吾尔药业股份有限公司的拳头产品,已经获得CFDA的注册批准。作为罗补甫克比日丸的主要原料药之一,南欧丹参(学名:Salvia sclarea L.,别名红拜合曼、克孜力拜合曼),是唇型科鼠尾草属植物,两年或多年生草本植物,根部分木质化,株高约1米,茎四棱形,直立,被细毛或绿紫色,多分枝;叶对生,有长柄,叶片椭圆形或长椭圆形。轮伞花序,每轮5~6朵小花,花两性,小坚果卵圆形,非褐色,光滑。花期7~9月,种子成熟期8~10月;南欧丹参以以根入药,有生干生热,补心壮阳,,肥体填精,爽心悦志,燥湿固精,消除黄疸,温宫生辉等功效。主治湿寒性或粘液质性疾病,如心悸阳痿,羸瘦精少,心烦意乱,早泄、遗精、滑精、黄疸、宫寒面暗等。目前有关南欧丹参中有效成分高蒙胧木素的提取工艺研究鲜见报道。因此开发和优化南欧丹参有效成分的提取工艺至关重要。
目前,提取工艺的优化方法多为正交设计法和均匀设计法,此类方法的缺点是不能考察各因素之间的相互作用,同时也很难考察多个响应值与因素之间的交互作用关系。响应面法是通过构造一个具有明确表达式的多项式来表达函数,将体系的响应量作为一个或多个因素的函数,运用图形技术将这种函数关系显示出来,通过回归分析得到响应量和影响因素的回归关系,从而求得最佳提取工艺的一种数学方法。与正交法相比,响应面法用少量的试验组就可以得出结果,并且响应面法拟合度较高,能够为实际生产提供可靠地参考。另外,响应面优化法考虑了试验随机误差,同时将复杂的未知的函数关系在小区域内用简单的一次或二次多项式模型来拟合,计算比较简便,是解决实际问题的有效手段。
综上所述,响应面法的优点是在实验条件优化过程中可以连续地对试验因素的各个水平进行分析,克服了正交试验只能对一个个孤立的试验点进行分析和不能给出直观图形的缺陷。但目前尚未见使用响应面分析法对南欧丹参药材的提取工艺进行优化的相关报道。基于上述理由,提出本申请。
发明内容
针对现有技术存在的问题,本发明的目的在于提供一种利用南欧丹参提取高蒙胧木素的方法及其获得的高蒙胧木素产品和所用的响应面优化工艺。本发明以南欧丹参为原料,利用加热回流方法提取高蒙胧木素,并通过响应面法优化了提取高蒙胧木素的醇溶液浓度、提取时间及液料比等工艺条件,为南欧丹参的进一步研究和利用奠定基础。
为了实现本发明的上述第一个目的,本发明采用的技术方案如下:
一种利用南欧丹参提取高蒙胧木素的方法,所述方法包括如下步骤:
将干燥南欧丹参粉碎后过筛,得到样品粉末;然后将所述样品粉末与乙醇水溶液按照10~50ml乙醇水溶液/1g样品粉末的液料比混合摇匀,获得混合分散液,再将所述混合分散液加热回流提取30~150min;其中:所述乙醇水溶液的体积浓度为30~100%。
进一步地,上述技术方案,所述回流提取温度为70~90℃。
本发明的第二个目的在于提供上述所述利用南欧丹参提取高蒙胧木素的方法提取得到的高蒙胧木素产品。
本发明的第三个目的在于提供一种响应面法优化南欧丹参中高蒙胧木素的提取工艺,包括以下步骤:
(1)将南欧丹参供试样品烘干后粉碎,过筛,得到样品粉末;
(2)将所述样品粉末中高蒙胧木素的提取工艺进行预实验,得出影响高蒙胧木素提取率的因素为乙醇水溶液浓度、提取时间、液料比和提取次数;并根据单因素多水平实验,筛选出乙醇水溶液浓度、提取时间、液料比和提取次数的参数范围;
(3)根据步骤(2)中预实验筛选出的各参数范围,固定提取次数为1次,以乙醇水溶液浓度、提取时间、液料比3个因素为考察对象,以供试品溶液中高蒙胧木素含量及浸膏重量作为考察指标,设计3因素3水平试验表;
(4)对步骤(3)中的实验数据进行多元线性回归和二项拟合并建立回归方程,得到以供试品溶液中高蒙胧木素含量为响应值的响应曲面图;通过对试验结果分析,得到高蒙胧木素的最佳提取工艺参数。
进一步地,上述技术方案,步骤(4)中所述回归方程如下:Y=138.76-1.27A+3.47B+2.55C+0.84AB+0.81AC-1.68BC-1.81A2-2.47B2+0.89C2,其中:Y表示高蒙胧木素含量,A为提取时间(min),B为乙醇水溶液的体积浓度(%),C为液料比(ml/g)。
进一步地,上述技术方案,步骤(2)所述单因素多水平实验的方法步骤具体如下:
(a)乙醇水溶液体积浓度的试验
以5个水平进行乙醇水溶液体积浓度的单因素实验:固定乙醇水溶液提取1次,液料比为25ml/g,提取时间40min,测量在乙醇水溶液体积浓度分别为30%、50%、70%、90%、100%时的高蒙胧木素含量和浸膏重量。
(b)液料比参数范围的试验
以5个水平进行液料比的单因素实验:固定纯乙醇提取1次,提取时间40min,测量在液料比分别为10ml/g、20ml/g、30ml/g、40ml/g、50ml/g时的高蒙胧木素含量和浸膏重量。
(c)提取时间参数范围的试验
以5个水平进行提取时间的单因素实验:固定纯乙醇提取1次,液料比为25ml/g,测量在提取时间分别为30min、60min、90min、120min、150min时的高蒙胧木素含量和浸膏重量。
进一步地,上述技术方案,步骤(4)中所述高蒙胧木素的最佳提取工艺参数为:液料比45ml/g,提取时间89min,乙醇水溶液的体积浓度77%。
进一步地,上述技术方案,步骤(1)所述过筛采用的筛号为4号筛,所述4号筛的筛孔内径为0.39mm。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
(1)本发明通过单因素多水平结合响应面法确定的高蒙胧木素的提取工艺参数,经多样品重复试验,供试品溶液中高蒙胧木素的含量稳定性很好,供试品溶液中高蒙胧木素的含量在12h内稳定。
(2)本发明采用单因素多水平结合响应面法优化南欧丹参中高蒙胧木素的回流提取工艺,为南欧丹参的进一步研究和利用奠定基础。
(3)本发明仅通过少量的实验,就可合理有效地优化南欧丹参中高蒙胧木素的回流提取工艺,操作简便。
(4)当提取条件为:液料比45ml/g,提取时间89min,乙醇水溶液的体积浓度77%,可获得含量为0.72mg/ml的高蒙胧木素,与模型预测的0.73mg/ml偏差较小,说明响应面法优化后的高蒙胧木素提取工艺稳定可行,可推广于产业应用。
附图说明
图1中(a)、(b)分别为实施例1中乙醇水溶液体积浓度对高蒙胧木素含量及浸膏重量的影响结果图。
图2中(a)、(b)分别为实施例1中液料比对高蒙胧木素含量及浸膏重量的影响结果图。
图3中(a)、(b)分别为实施例1中提取时间对高蒙胧木素含量及浸膏重量的影响结果图。
图4为实施例1中乙醇水溶液体积浓度和提取时间对高蒙胧木素含量影响的响应面二维等高线图。
图5为实施例1中乙醇水溶液体积浓度和提取时间对高蒙胧木素含量影响的响应面三维图。
图6为实施例1中液料比和提取时间对高蒙胧木素含量影响的响应面二维等高线图。
图7为实施例1中液料比和提取时间对高蒙胧木素含量影响的响应面三维图。
图8为实施例1中液料比和乙醇水溶液体积浓度对高蒙胧木素含量影响的响应面二维等高线图。
图9为液料比和乙醇水溶液体积浓度对高蒙胧木素含量影响的响应面三维图。
具体实施方式
下面通过实施案例和附图对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施,现给出详细的实施方式和具体的操作过程来说明本发明具有创造性,但本发明的保护范围不限于以下的实施案例。
本发明下述各实施例中的南欧丹参从新疆地区采集得到,经相关专业人员鉴定为唇形科植物红拜合曼Salvia haematodes Linn的干燥根。
本发明下述各实施例中采用的实验仪器有戴安3000高效液相色谱仪(在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、UV检测器、Chromeleon色谱工作站,美国DIONEX公司)、UV-1800PC型紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)、Q5200B型超声波清洗器(昆山市超声波仪器有限公司)和HH-4恒温水浴锅(金坛市科兴仪器厂)。
实验试剂有高蒙胧木素(穗花杉双黄酮)对照品(中国生物制品研究所)和除色谱纯乙腈外的其它国产分析纯有机试剂。
一、本发明下述各实施例中高蒙胧木素的优化提取工艺的原理及高蒙胧木素的含量测定方法、浸膏的制备以及测试方法稳定性测试、重复性测试、加样回收率测试方法如下:
1.1高蒙胧木素提取工艺的优化原理
本发明是以高蒙胧木素的含量和浸膏重量为评价指标,将干燥南欧丹参粉碎过筛后加入一定量的乙醇水溶液进行回流提取,先通过单因素实验确定因素水平,然后在单因素试验结果的基础上,根据Box-Benhnken中心组合实验设计原理,综合单因素实验结果,选取乙醇水溶液浓度、液料比和提取时间3个因素作为响应变量,再通过响应面分析法对南欧丹参的乙醇回流提取条件进行优化,以期获得较多的高蒙胧木素,为未来欧丹参粉的生产和应用提供参考。
1.2高蒙胧木素的含量测定方法
1.2.1供试品溶液的制备
将干燥南欧丹参粉碎后过4号筛得到样品粉末。精密称取样品粉末1.0000g,放于50ml圆底烧瓶中,加入适量乙醇溶液,摇匀。称重后加热回流提取。补足重量后过滤,即得供试品溶液。
1.2.2对照品溶液的制备
精密称取高蒙胧木素10.0mg,置于5ml容量瓶中,加乙醇溶解,摇匀,即得对照品溶液,浓度为2.0mg/ml。
1.2.3色谱条件
高蒙胧木素含量测定的色谱条件为:色谱柱BDS Hypersil C18(250mm×4.6mm,5μm),流动相:乙腈-0.02%磷酸二氢钾溶液(26-74),检测波长289nm,柱温30℃,流速:1.0ml/min,进样量:10ul。
1.2.4标准曲线的绘制
按倍数关系将对照品溶液分别稀释成2.0mg/ml、1.5mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml和0.1mg/ml。取10μl进样测定。以对照品浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线,得到回归方程:Y=2^107X-412234(r=0.9998)。在高蒙胧木素浓度为0.1-2.0mg/ml时与峰面积呈良好的线性关系。
1.3浸膏的制备
精密称取样品粉末1.0000g,放于圆底烧瓶中,加入适量乙醇,回流提取一定时间。过滤,减压回收溶剂,105℃干燥至恒重,即得。
1.4方法学考察
1.4.1精密度实验
取同一份供试品溶液,连续进样6次,按照上述色谱条件测定峰面积,计算RSD值为1.33%,表明仪器精密度良好。
1.4.2稳定性实验
取同一份供试品溶液,按上述色谱条件测定峰面积,每隔2h测量1次,共测定5次。计算RSD值为1.55%。表明供试品溶液中高蒙胧木素的含量在12h内稳定。
1.4.3重复性实验
按上述制备方法,取同一批样品6份制备供试品溶液。按上述色谱条件测定峰面积,计算RSD值为1.56%。表明该法重复性良好。
1.4.4加样回收率
精密称取同一批样品6份,每份1.0000g。任选3份,分别加入1mg对照品。按上述制备方法制备6份供试品溶液。用上述色谱条件测定峰面积,计算平均回收率为91%,RSD值为1.60%。
二、以下通过实施例1具体阐释南欧丹参供试样品中高蒙胧木素提取参数优化方法:
实施例1一种响应面法优化南欧丹参中高蒙胧木素的提取工艺,包括以下步骤:
(1)将南欧丹参供试样品烘干后粉碎,过4号筛得到样品粉末;
(2)将所述样品粉末中高蒙胧木素的提取工艺进行预实验,得出影响高蒙胧木素提取率的因素为乙醇水溶液浓度、提取时间、液料比和提取次数;并根据单因素多水平实验,筛选出乙醇水溶液浓度、提取时间、液料比和提取次数的参数范围;
(2.1)乙醇水溶液体积浓度参数范围选择
以5个水平进行乙醇水溶液体积浓度的单因素实验。固定乙醇水溶液提取1次,液料比为25ml/g,提取时间40min,测量在乙醇水溶液体积浓度分别为30%、50%、70%、90%、100%时的高蒙胧木素含量和浸膏重量。乙醇水溶液体积浓度对高蒙胧木素含量及浸膏重量的影响结果分别见图1中(a)、(b)所示。
由图1(a)可以看出,当乙醇水溶液体积浓度为90%时,高蒙胧木素的含量最高。当乙醇浓度继续增加时,高蒙胧木素的含量降低。由图1(b)可以看出,随着乙醇浓度的增加,浸膏的重量逐渐升高。故最佳提取浓度为90%。
(2.2)液料比参数范围选择
以5个水平进行液料比的单因素实验。固定纯乙醇提取一次,提取时间40min,测量在液料比分别为10ml/g、20ml/g、30ml/g、40ml/g、50ml/g时的高蒙胧木素含量和浸膏重量。液料比对高蒙胧木素含量及浸膏重量的影响结果分别见图2中(a)、(b)所示。由图2可以看出,液料比对高蒙胧木素含量和浸膏重量均随着液料比的增长而增长,因此最佳液料比为50mg/ml。
(2.3)提取时间参数范围选择
以5个水平进行提取时间的单因素实验。固定纯乙醇提取一次,液料比为25ml/g,测量在提取时间分别为30min、60min、90min、120min、150min时的高蒙胧木素含量和浸膏重量。提取时间对高蒙胧木素含量及浸膏重量的影响结果分别见图3中(a)、(b)所示。由图3(a)可以看出,随着提取时间的增长,高蒙胧木素含量呈下降趋势。但由图3(b)可以看出,浸膏重量随着时间的增长先上升后下降,90min时浸膏重量达到最大值。因此最佳提取时间为90min。
(3)根据步骤(2)中预实验筛选出的各参数范围,固定提取次数为1次,以乙醇水溶液浓度、提取时间、液料比3个因素为考察对象,以供试品溶液中高蒙胧木素含量及浸膏重量作为考察指标,根据Box-Benhnken中心组合实验设计原理,综合单因素实验结果,选取液料比、乙醇浓度和提取时间3个因素,采用3因素3水平响应面方法设计3因素3水平试验表,如表1所示。实验设计和结果如表2所示。
表1:响应面法试验设计中的因素水平
表2:实验设计和结果
(4)根据步骤(3)表1中试验因素水平,采用响应面分析软件Design-ExpertVersion 8.0.6对步骤(3)中的实验数据进行多元线性回归和二项拟合,得回归方程如下:Y=138.76-1.27A+3.47B+2.55C+0.84AB+0.81AC-1.68BC-1.81A2-2.47B2+0.89C2,其中:Y表示高蒙胧木素含量,A为提取时间(min),B为乙醇水溶液的体积浓度(%),C为液料比(ml/g)。方差分析见表3。
表3:方差分析结果表
由表3方差分析结果可知,回归方程一次项中3个因素对高蒙胧木素含量及浸膏重量影响的顺序为B>C>A,其中,B、C影响非常显著,A影响显著;交互项BC对高蒙胧木素含量及浸膏重量有显著影响;二次项A2、B2影响显著,C2无显著影响。以上分析表明,本发明中料液比是影响高蒙胧木素含量及浸膏重量的最主要的因素。
(5)试验结果分析与优化
利用Design-Expert软件根据回归方程进行绘图分析,得到回归方程的响应面三维图及响应面二维图,如图4~9所示。
由图4~9可确定南欧丹参的最佳提取工艺为乙醇浓度77.15%,提取时间88.79min,液料比45ml/g。考虑到实际操作,最终将其确定为乙醇浓度77%,液料比45ml/g,提取时间89min。
(6)验证实验
在响应面法优化所得的最佳提取条件下,对南欧丹参进行3次平行提取试验,得到高蒙胧木素的平均含量为0.72mg/ml,与理论高蒙胧木素含量的绝对误差为1.39%,RSD为1.36%。这说明响应面法优化后的高蒙胧木素提取工艺稳定可行,可推广于产业应用。
Claims (4)
1.一种响应面法优化南欧丹参中高蒙胧木素的提取工艺,其特征在于:包括以下步骤:
(1)将南欧丹参供试样品烘干后粉碎,过筛,得到样品粉末;
(2)将所述样品粉末中高蒙胧木素的提取工艺进行预实验,得出影响高蒙胧木素提取率的因素为乙醇水溶液浓度、提取时间、液料比和提取次数;并根据单因素多水平实验,筛选出乙醇水溶液浓度、提取时间、液料比和提取次数的参数范围;
(3)根据步骤(2)中预实验筛选出的各参数范围,固定提取次数为1次,以乙醇水溶液浓度、提取时间、液料比3个因素为考察对象,以供试品溶液中高蒙胧木素含量及浸膏重量作为考察指标,设计3因素3水平试验表;
(4)对步骤(3)中的实验数据进行多元线性回归和二项拟合并建立回归方程,得到以供试品溶液中高蒙胧木素含量为响应值的响应曲面图;通过对试验结果分析,得到高蒙胧木素的最佳提取工艺参数;所述高蒙胧木素的最佳提取工艺参数为:液料比45ml/g,提取时间89min,乙醇水溶液的体积浓度77%。
2.根据权利要求1所述的响应面法优化南欧丹参中高蒙胧木素的提取工艺,其特征在于:步骤(4)中所述回归方程如下:Y=138.76-1.27A+3.47B+2.55C+0.84AB+0.81AC-1.68BC-1.81A2-2.47B2+0.89C2,其中:Y表示高蒙胧木素含量,A为提取时间(min),B为乙醇水溶液的体积浓度(%),C为液料比(ml/g)。
3.根据权利要求1所述的响应面法优化南欧丹参中高蒙胧木素的提取工艺,其特征在于:步骤(2)所述单因素多水平实验的方法步骤具体如下:
(a)乙醇水溶液体积浓度的试验
以5个水平进行乙醇水溶液体积浓度的单因素实验:固定乙醇水溶液提取1次,液料比为25ml/g,提取时间40min,测量在乙醇水溶液体积浓度分别为30%、50%、70%、90%、100%时的高蒙胧木素含量和浸膏重量;
(b)液料比参数范围的试验
以5个水平进行液料比的单因素实验:固定纯乙醇提取1次,提取时间40min,测量在液料比分别为10ml/g、20ml/g、30ml/g、40ml/g、50ml/g时的高蒙胧木素含量和浸膏重量;
(c)提取时间参数范围的试验
以5个水平进行提取时间的单因素实验:固定纯乙醇提取1次,液料比为25ml/g,测量在提取时间分别为30min、60min、90min、120min、150min时的高蒙胧木素含量和浸膏重量。
4.根据权利要求1所述的响应面法优化南欧丹参中高蒙胧木素的提取工艺,其特征在于:步骤(1)所述过筛采用的筛为4号筛,所述4号筛的筛孔内径为0.39mm。
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