CN108904607A - 一种从新品种油芍籽壳提取多酚类物质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从新品种油芍籽壳提取多酚类物质的方法，包括如下步骤：采用超声辅助、乙醇溶液浸提芍药籽壳粉末，提取液浓缩干燥，测定多酚含量，并选择乙醇体积分数、液料比和提取时间三个因素进行单因素实验，根据Box‑Benhnken设计原则进行三因素三水平实验设计，确定最佳提取工艺参数；利用该提取工艺参数获得萃取液，在该萃取液中加入非离子表面活性剂和辅助萃取剂涡旋、离心。本发明利用超声波提取与浊点萃取相结合的方法，与优化后的超声波提取多酚物质方法相比，提取率高近1.5倍，萃取条件温和，提取剂对环境友好、提取成本低等特点，并且将废弃的油芍籽壳重新利用，不但可以使其变废为宝，还能极大的解决环境污染问题。

Description

一种从新品种油芍籽壳提取多酚类物质的方法
技术领域
本发明属于植物成分提取领域，具体涉及一种从新品种油芍籽壳提取多酚类物质的方法。
背景技术
芍药，是一种用于治疗多种疾病的传统中药，品种上可分为赤芍和白芍，皆以根为药，白芍不结种或种粒很小；赤芍结种，但产量低。工业上一般从芍药根茎中提取其有效活性成分。而油芍是经过20多年赤芍与杭芍通过杂交育出的新品种，不仅根系发达，而且结籽量获得突破，4年以上芍药的产籽量不低于450斤/亩，8年后甚至达亩产800斤以上。经过实验分析，芍药籽油含有对人体有益的不饱和脂肪酸达95%以上，是目前检测到的最好功能性食用和保健用油，且不含任何转基因成分，出油率也远高于大豆油。而榨油过程中剩下的芍药籽壳利用率并不高，研究发现，油芍籽壳中含有多酚类物质。目前为止，国内学者仅仅研究了油牡丹籽壳中的芍药苷和丹皮酚的含量和测定方法，以及油牡丹籽壳中黄酮类化合物及多酚类化合物的提取工艺，然而关于油芍籽壳的组成与多酚类化合物的工艺研究报道很少。因此通过深入研究和开发芍药籽壳这一废弃资源，不但可以使其变废为宝，还能极大的解决环境污染问题。
目前，多酚类物质的提取方法主要有：有机溶剂浸提法、超声波提取、微波提取等方法。响应面法可以实现应用较少的试验数据在给定的范围内找到因素与响应值之间明确的函数表达式，从而得出最佳因素组合及最优响应值，因而比其它优化方法更具明显优势。但仅使用响应面优化超声波提取多酚，提取率比较低，难以达到纯化的目的。浊点萃取法以其操作步骤简单，应用范围广、提取产率高、提取温度低、不使用挥发性有机溶剂、活性成分在提取过程中不易变性、经济、安全、具有易于放大、对环境友好等特点，被广泛应用于分析领域，但其在天然植物活性成分提取方面应用的比较少。而利用浊点萃取法获得的提取液在与其它分析技术联用时需要先除去表面活性剂。因为常用的表面活性剂在UV区域有很强的背景吸收，并且从色谱柱上洗脱表面活性剂需用几个小时，操作时间长。
本发明所利用的响应面优化超声波提取结合浊点萃取方法这两种方法的有机结合可以使超声波提取发挥到最优状态，同时也能发挥浊点萃取的优点，使萃取效果更强。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种从新品种油芍籽壳提取多酚类物质的方法，在单因素实验基础上，根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理设计三因素三水平实验，采用统计软件Design expert 8.0.0进行多元回归分析，确定油芍籽壳总多酚最佳超声提取工艺；同时结合浊点萃取的方法，使多酚的提取率更高，并改善了现在浊点萃取方法存在的不足，提供了一种新型的提取油芍籽壳中多酚类物质的方法，对于多酚物质提取具有指导意义。既解决了油芍籽壳污染环境和资源浪费的问题，同时开发了芍药的利用价值。
一种从新品种油芍籽壳提取多酚类物质的方法，包括如下步骤：
（1）芍药籽脱壳获得籽皮，干燥、粉碎后，得到芍药籽壳粉末；
（2）采用超声辅助、乙醇溶液浸提芍药籽壳粉末，提取液浓缩干燥，测定多酚含量；
（3）选择乙醇浓度、液料比和提取时间三个因素对步骤（2）进行单因素实验，确定乙醇体积分数、液料比和提取时间的最优水平，在最优水平两侧对称选2个水平，根据Box-Benhnken设计原则进行三因素三水平实验设计，以乙醇浓度、液料比和提取时间为自变量，以总多酚含量为响应值，建立总多酚含量的多元二次方程，得到芍药籽壳总多酚含量为响应面值的响应曲面图，再通过对试验结果的分析，确定芍药籽壳总多酚的最佳提取工艺参数，根据该最佳提取工艺参数超声提取，过滤，滤液待用；其中各因素对于芍药籽壳总多酚含量影响的排序为料液比>乙醇体积分数>提取时间；
（4）取步骤（3）得到的滤液2mL，加入3mL的去离子水、0.1-0.3mL非离子表面活性剂和0.3-0.9mL辅助萃取剂，涡旋，离心，得到表面活性剂相及水相，多酚类物质被提取到表面活性剂相；
（5）用紫外分光光度法测定非离子表面活性剂相中多酚类物质的含量。
所述步骤（3）中芍药籽壳总多酚的最佳提取工艺参数为：乙醇体积分数为60%-80%，料液比为1:20-1:30，提取时间为20-40min。
所述步骤（3）中芍药籽壳总多酚的最佳提取工艺参数为：乙醇体积分数为80%，料液比为1:25，提取时间为20min。
所述步骤（4）中非离子表面活性剂为脂肪醇聚氧乙烯醚AEO-9。
所述步骤（4）中辅助萃取剂为正己醇。
所述步骤（4）中涡旋时间为1-3min，离心速度为3000-5000r/min，离心时间为10-20min。
所述步骤（5）中，先用对照品没食子酸绘制标准曲线，计算出回归方程，再将测得的吸光度值代入回归方程计算总多酚浓度，总多酚含量=总多酚的质量/芍药籽壳粉末的质量。
本发明具有以下有益效果：（1）本发明工艺简单易操作，并且所选原料为废弃物油芍籽壳，不仅解决了环境污染问题，而且开发了芍药的利用价值；（2）本发明利用Box-Benhnken设计原则和效应面分析法，借助统计软件简便、可靠地进行优化试验和数据分析，对油芍籽壳总多酚提取的工艺进行优化，取得了较好的效果；（3）本发明采用响应面优化超声波提取结合浊点萃取的方法既能克服响应面优化超声波提取提取效率低的缺点，使提取率提高到近1.5倍。（单独利用响应面优化超声波提取时多酚含量为9.9460mg/g，而 利用响应面优化超声波提取结合浊点萃取的方法多酚含量达到14.34mg/g，使提取率提高到近1.5倍），又能克服单纯利用浊点萃取法获得的提取液在与其它分析技术联用时需要先除去表面活性剂的缺点。因为该方法是在利用超声波提取后的滤液中又重新加入去离子水和少量的辅助萃取剂正己醇，使纯化后的提取液中含有的表面活性剂浓度大大降低，不需要再先除去表面活性剂，就可以直接与其它分析技术联用，并且还可以大大缩短萃取时间。（4）与现有多酚物质的提取方法相比，提取中所用有机溶剂量大幅减少，提取剂对环境友好、提取成本低等特点，同时操作条件温和，适用于低含量多酚类物质的提取。本发明为油芍籽壳内在质量的评价提供参考，为油芍新品种的推广应用奠定基础。
附图说明
图1乙醇体积分数对油芍籽壳总多酚含量的影响示意图。
图2料液比对油芍籽壳总多酚含量的影响示意图。
图3超声时间对油芍籽壳总多酚含量的影响示意图。
图4没食子酸吸光度标准曲线。
图5乙醇体积分数与料液比对总多酚含量的交互作用的响应面图。
图6乙醇体积分数与料液比对总多酚含量的交互作用的等高线图。
图7乙醇体积分数与提取时间对总多酚含量的交互作用的响应面图。
图8乙醇体积分数与提取时间对总多酚含量的交互作用的等高线图。
图9料液比与提取时间对总多酚含量的交互作用的响应面图。
图10料液比与提取时间对总多酚含量的交互作用的等高线图。
具体实施方式
以下提供本发明基于响应面优化油芍籽壳多酚超声提取工艺的方法，步骤如下：
（1）油芍籽壳预处理：称取适量油芍籽壳用水冲洗干净，置于40℃烘箱中烘干至恒重，粉碎，用粒度为40目的筛子筛分后称取3g油芍籽壳粉末；
（2）采用超声辅助、乙醇溶液浸提油芍籽壳中总多酚化合物，选择乙醇浓度、液料比和提取时间三个因素对步骤（1）处理好的油芍籽壳材料进行单因素实验，确定乙醇浓度、液料比和提取时间的最优水平，在最优水平两侧对称选2个水平，根据Box-Benhnken设计原则进行三因素三水平实验设计，以乙醇浓度、液料比和提取时间为自变量，以总多酚含量为响应值， 建立总多酚含量的多元二次方程为：
Y=2.91+0.079X1+0.11X2-0.065X3-0.11X1X2+0.053X1X3+8.068E-004X2X3+0.097X1 2-0.064X2 2+0.052X2 2；
式中响应值为油芍籽壳总多酚含量，变量参数X1为乙醇体积分数，变量参数X2为料液比，变量参数X3为提取时间，最终确定最佳乙醇浓度为80%，最佳料液比为1:25，最佳提取时间为20min，油芍籽壳总多酚的含量为9.9460mg/g。
按照所述的变量参数，称取经步骤（1）预处理的油芍籽壳粉末，粉末中加入乙醇溶液，乙醇体积分数为80%，摇晃均匀，放入超声波清洗仪中，设定超声提取时间为20min，超声频率为70HZ，进行超声提取总多酚，过滤，滤渣连同滤纸用同浓度乙醇溶液再次提取，合并滤液，挥去乙醇得黄色粘稠状物质，以同浓度的乙醇溶液转移到的容量瓶中，定容、干燥。
（3）总多酚含量的测定方法：Folin-Ciocalteu比色法，将干浸膏使用无水乙醇溶解，并定容到50ml容量瓶中，吸取提取液0.5ml，加入 10% Folin-Ciocalteu试剂2.5 mL，混匀后放置6 min，再加入75 mg/mL碳酸钠溶液 2 mL，混匀后在室温下避光反应2 h，在 760nm 处测吸光度，以没食子酸为标准品，根据吸光度（Y）和浓度（X）的回归方程：Y=5.775x+0.0915，R2=0.9994计算浓度。总多酚含量=总多酚的质量/油芍籽壳粉末的质量。
本发明采用超声波辅助提取方法，在单因素实验的基础上通过Box-Benhnken设计原则建立了乙醇体积分数、料液比和提取时间3个影响因素与总多酚含量响应值之间相互作用的数学模型。根据前期的超声波提取优化的最佳提取参数进行油芍籽壳多酚类物质的提取，提取的粗提液，过滤，滤液用于后面的浊点萃取试验。具体的操作过程为：
1.单因素实验结果
（1）乙醇体积分数对油芍籽壳总多酚含量的影响
称取经步骤（1）预处理后的油芍籽粉末3g，固定料液比1:20g/ml，提取频率为70HZ，提取时间为40min，分别以乙醇体积分数为50%、60%、70%、80%和90%为实验点，考察乙醇体积分数对油芍籽壳总多酚含量的影响，并绘制出如图1所示的油芍籽壳总多酚含量跟随乙醇体积分数变化的曲线图。
由图1可以看出，在其它条件不变情况下，随着乙醇体积分数的升高，总多酚含量先增大后减小，乙醇体积分数在70%时总多酚的含量最高，乙醇体积分数大于70%时总多酚含量随乙醇浓度的增加而降低。可能是因为乙醇体积分数在70%时，醇溶性和水溶性的多酚类物质都能最大程度的溶出，而乙醇体积分数超过70%时，水溶性多酚溶出量减少，故总多酚含量下降。
（2）料液比对油芍籽壳总多酚含量的影响
称取经过步骤（1）预处理后的油芍籽壳粉末3g，固定乙醇体积分数为60%，超声频率为70Hz，提取时间为40min，分别以料液比1:10、1:15、1:20、1:25、1:30为实验点，考察不同料液比对油芍籽壳总多酚含量的影响，并绘制出如图2所示的油芍籽壳总多酚含量随料液比变化的曲线图。
由图2可以看出，在其它条件不变的情况下，随着料液比的扩大，总多酚的提取率不断提高，当料液比升高到1:25g/ml时，总多酚的含量增加到最大，之后增幅逐渐变小。这可能是由于料液比扩大可增加物料与溶剂的接触面积，使得多酚类物质更充分地溶解出来，但料液比过大提取率不再增长。故从多酚含量的角度来看，料液比选择1:25g/ml为宜。
（3）超声提取时间对油芍总多酚含量的影响
称取经步骤（1）预处理后的油芍籽壳粉末3g，固定乙醇体积分数为60%，料液比为1:20g/ml，分别以提取时间10min、20min、30min、40min、50min为实验点，考察不同提取时间对油芍籽壳总多酚含量的影响，并绘制出如图2所示的油芍籽壳总多酚含量跟随超声提取时间变化的曲线图。
由图3可以看出，在其它条件不变情况下，随着提取时间的延长，油芍籽壳总多酚含量呈现先升高后降低的趋势，这是可能是因为提取时间可影响提取溶剂与细胞内的活性物质接触，提取时间越长，溶剂越能够充分渗透到细胞内与活性物质接触溶解，从而提高提取的多酚含量，而提取时间过长时则会导致细胞内的温度过高，造成提取物的氧化，另外还有其他物质的更多溶出，从而降低总多酚的量，故从多酚含量的角度来看，提取时间选择30min为宜。
2.响应面设计与结果
根据单因素试验结果确定的乙醇体积分数、液料比、提取时间最优水平，并在最优水平两侧对称选2个水平，具体因素水平设置见表1。
表1 因素水平设置表
利用Design expert 8.0.0软件根据Box-Benhnken设计原则进行三因素三水平实验设计，实验方案设计与响应值结果见表2。回归方程方差分析见表2。
表2响应曲面设计方案以及响应值
表中：变量参数X1为乙醇体积分数、变量参数X2为料液比、变量参数X3为提取时间。
3. 响应面分析与优化
实验数据采用统计软件Design expert 8.0.0进行多元回归分析，得出实验因素对响应值影响的回归方程为：
Y=2.91+0.079X1+0.11X2-0.065X3-0.11X1X2+0.053X1X3+8.068E-004X2X3+0.097X1 2-0.064X2 2+0.052X2 2；
方程中各项系数绝对值的大小反映了各因素对响应值的影响程度，实验数据响应面方差分析的结果见表3。
表3黄酮含量回归方程的方差分析
注：“P>F”小于0.001表明差异极显著，小于0.01表明差异较显著，小于0.05表明差异显著。表中变量参数X1为乙醇体积分数、变量参数X2为料液比、变量参数X3为提取时间。
由表3可看出，P=0.0009<0.0001表明二次回归方程模型极显著，失拟项P=0.0911>0.05不显著，表明该方程对实验拟合情况好，可以用该模型代替真实实验点对不同反应条件下油芍籽壳总多酚含量的实验进行结果预测和分析。回归模型方程各项的方差分析结果还表明，X1、X2、X3对总多酚含量的影响是较显著，二次项的影响也都是显著的，方程的拟合是较充分的。图5至图10是根据回归方程所绘制的响应面图和等高线图，能直观地描述两个因素之间对响应值的交互作用。从图中可以看出，乙醇体积分数和提取时间交互作用显著，表现为曲线比较陡峭。3个因素对油芍籽壳总多酚含量的影响顺序为，即料液比影响最大，次之乙醇体积分数，最后为提取时间。
4.验证实验
根据所得的回归模型，由统计软件Design expert 8.0.0对实验参数进一步优化，得到油芍籽壳中提取总多酚的最佳条件乙醇体积分数80%，料液比1:25和提取时间20min，在此最佳工艺条件下油芍籽壳中总多酚的提取量为9.9460，在此条件下进行3次验证实验，按照步骤（1）至步骤（3）所述的方法，测得总黄酮提取率的平均值为9.6453，与理论值相比，其相对误差为0.3007，说明响应面法对油芍籽壳多酚提取条件的优化切实可行。
5. 根据上述的超声波提取优化的最佳提取参数进行油芍籽壳多酚类物质的提取，提取的粗提液，过滤，滤液用于后面的浊点萃取。
为了更好理解本发明，下面结合实例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实例。
实施例1
本实施例的从新品种油芍籽壳提取多酚类物质的方法，步骤如下：
（1）取油芍籽壳粉末3g，加入75ml的80%的乙醇溶液，放入超声中提取20min，过滤，滤渣连同滤纸用同浓度乙醇溶液再次提取，合并滤液，将滤液放入样品瓶中备用；
（2）取步骤（1）中样品溶液2ml于10ml刻度离心管中，加入3ml去离子水，加入0.1ml脂肪醇聚氧乙烯醚AEO-9和0.3ml正己醇于离心管中，涡旋2min，3000r/min离心15min，目标物被萃取于离心管上层；
（3）按上述多酚物质检测方法用紫外分光光度法进行检测，计算出多酚类物质的提取量为13.96mg/g。
实施例2
本实施例的从新品种油芍籽壳提取多酚类物质的方法，步骤如下：
（1）取油芍籽壳粉末3g，加入75ml的80%的乙醇溶液，放入超声中提取20min，过滤，滤渣连同滤纸用同浓度乙醇溶液再次提取，合并滤液，将滤液放入样品瓶中备用。
（2）取步骤（1）中样品溶液2ml于10ml刻度离心管中，加入3ml去离子水，加入0.2ml脂肪醇聚氧乙烯醚AEO-9和0.5ml正己醇于离心管中，涡旋2min，3000r/min离心15min，目标物被萃取于离心管上层。
（3）按上述多酚物质检测方法用紫外分光光度法进行检测，计算出多酚类物质的提取量为13.66mg/g。
实施例3
本实施例的从新品种油芍籽壳提取多酚类物质的方法，步骤如下：
（1）取油芍籽壳粉末3g，加入75ml的80%的乙醇溶液，放入超声中提取20min，过滤，滤渣连同滤纸用同浓度乙醇溶液再次提取，合并滤液，将滤液放入样品瓶中备用。
（2）取步骤（1）中样品溶液2ml于10ml刻度离心管中，加入3ml去离子水，加入0.3ml脂肪醇聚氧乙烯醚AEO-9和0.9ml正己醇于离心管中，涡旋2min，3000r/min离心15min，目标物被萃取于离心管上层。
（3）按上述多酚物质检测方法用紫外分光光度法进行检测，计算出多酚类物质的提取量为13.71mg/g。
实施例4
本实施例的从新品种油芍籽壳提取多酚类物质的方法，步骤如下：
（1）取油芍籽壳粉末3g，加入75ml的80%的乙醇溶液，放入超声中提取20min，过滤，滤渣连同滤纸用同浓度乙醇溶液再次提取，合并滤液，将滤液放入样品瓶中备用；
（2）取步骤（1）中样品溶液2ml于10ml刻度离心管中，加入3ml去离子水，加入0.3ml脂肪醇聚氧乙烯醚AEO-9和0.9ml正己醇于离心管中，涡旋1min，4000r/min离心10min，目标物被萃取于离心管上层。
（3）按上述多酚物质检测方法用紫外分光光度法进行检测，计算出多酚类物质的提取量为13.04mg/g。
实施例5
本实施例的从新品种油芍籽壳提取多酚类物质的方法，步骤如下：
（1）取油芍籽壳粉末3g，加入75ml的80%的乙醇溶液，放入超声中提取20min，过滤，滤渣连同滤纸用同浓度乙醇溶液再次提取，合并滤液，将滤液放入样品瓶中备用。
（2）取步骤（1）中样品溶液2ml于10ml刻度离心管中，加入3ml去离子水，加入0.3ml脂肪醇聚氧乙烯醚AEO-9和0.9ml正己醇于离心管中，涡旋3min，5000r/min离心15min，目标物被萃取于离心管上层。
（3）按上述多酚物质检测方法用紫外分光光度法进行检测，计算出多酚类物质的提取量为13.79mg/g。
实施例6
本实施例的从新品种油芍籽壳提取多酚类物质的方法，步骤如下：
（1）取油芍籽壳粉末3g，加入75ml的80%的乙醇溶液，放入超声中提取20min，过滤，滤渣连同滤纸用同浓度乙醇溶液再次提取，合并滤液，将滤液放入样品瓶中备用。
（2）取步骤（1）中样品溶液2ml于10ml刻度离心管中，加入3ml去离子水，加入0.3ml脂肪醇聚氧乙烯醚AEO-9和0.9ml正己醇于离心管中，涡旋2min，5000r/min离心20min，目标物被萃取于离心管上层。
（3）按上述多酚物质检测方法用紫外分光光度法进行检测，计算出多酚类物质的提取量为14.34mg/g。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (7)

1.一种从新品种油芍籽壳提取多酚类物质的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）油芍籽脱壳获得籽皮，干燥、粉碎后，得到芍药籽壳粉末；
（2）采用超声辅助、乙醇溶液浸提芍药籽壳粉末，提取液浓缩干燥，测定多酚含量；
（3）选择乙醇浓度、液料比和提取时间三个因素对步骤（2）进行单因素实验，确定乙醇浓度、液料比和提取时间的最优水平，在最优水平两侧对称选2个水平，根据Box-Benhnken设计原则进行三因素三水平实验设计，以乙醇体积分数、液料比和提取时间为自变量，以总多酚含量为响应值，建立总多酚含量的多元二次方程，得到芍药籽壳总多酚含量为响应面值的响应曲面图，再通过对试验结果的分析，确定芍药籽壳总多酚的最佳提取工艺参数，根据该最佳提取工艺参数超声提取，过滤，滤液待用；
（4）取步骤（3）得到的滤液2mL，加入3mL的去离子水、0.1-0.3mL非离子表面活性剂和0.3-0.9mL辅助萃取剂，涡旋，离心，得到表面活性剂相及水相，多酚类物质被提取到表面活性剂相；
（5）用紫外分光光度法测定非离子表面活性剂相中多酚类物质的含量。
2.根据权利要求1所述的从新品种油芍籽壳提取多酚类物质的方法，其特征在于：所述步骤（3）中芍药籽壳总多酚的最佳提取工艺参数为：乙醇体积分数为60%-80%，料液比为1:20-1:30，提取时间为20-40min。
3.根据权利要求1所述的从新品种油芍籽壳提取多酚类物质的方法，其特征在于：所述步骤（3）中芍药籽壳总多酚的最佳提取工艺参数为：乙醇体积分数为80%，料液比为1:25，提取时间为20min。
4.根据权利要求1所述的从新品种油芍籽壳提取多酚类物质的方法，其特征在于：所述步骤（4）中非离子表面活性剂为脂肪醇聚氧乙烯醚AEO-9。
5.根据权利要求1所述的从新品种油芍籽壳提取多酚类物质的方法，其特征在于：所述步骤（4）中辅助萃取剂为正己醇。
6.根据权利要求1所述的从新品种油芍籽壳提取多酚类物质的方法，其特征在于：所述步骤（4）中涡旋时间为1-3min，离心速度为3000-5000r/min，离心时间为10-20min。
7.根据权利要求1所述的从新品种油芍籽壳提取多酚类物质的方法，其特征在于：所述步骤（5）中，先用对照品没食子酸绘制标准曲线，计算出回归方程，再将测得的吸光度值代入回归方程计算总多酚浓度，总多酚含量=总多酚的质量/芍药籽壳粉末的质量。
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