CN101912436A

CN101912436A - 苜蓿皂苷的超声波提取方法

Info

Publication number: CN101912436A
Application number: CN2010102692579A
Authority: CN
Inventors: 魏臻武; 杨云
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2010-08-31
Filing date: 2010-08-31
Publication date: 2010-12-15

Abstract

本发明涉及苜蓿皂苷的提取，具体是一种利用超声波提取苜蓿皂苷的方法。具体是按料液比1g：5-15ml将苜蓿草粉加入体积分数为30%-70%的甲醇中，在超声波条件下提取1-3次，每次10-30分钟，超声波提取工作频率设定为800Hz，温度为20℃。本发明的提取方法与现有技术相比，具有工艺简单，收率高的优点，并且在常温下进行还保证了苜蓿皂苷的生物活性不受影响。

Description

苜蓿皂苷的超声波提取方法

技术领域

本发明涉及苜蓿皂苷的提取，具体是一种利用超声波提取苜蓿皂苷的方法。

背景技术

苜蓿皂苷是豆科植物苜蓿属植物紫花苜蓿（Medicago sativa L.）重要的生物活性成分，属齐墩果烷型的五环三萜类化合物，具有多种生物学功能及药理活性，在医药、保健上都有很好的应用，同时也是导致反刍动物臌胀病的主要物质。

随着苜蓿皂苷的生物活性愈来愈受到人们的重视，其应用也越来越广泛，对它的开发己逐渐深入到食品、保健、医药和日用化工等多个领域，应用前景非常广阔。我们可以利用苜蓿皂苷的药理活性，如抑制胆固醇在肠道的吸收、防治心脑血管疾病、降压、抗菌、消炎、减热、镇痛、强壮等方面的功效，将所提取的有效物质制成胶囊、片剂的保健品，既服用简便又用药体积小：而且还可以作为食品的天然甜味剂、保护剂、发泡剂、增味剂和抗氧化剂等。苜蓿皂苷毒性低、可开发成有用的降血脂及治疗冠心病的药物。以上苜蓿产品加工依赖于苜蓿皂苷有效的提取方法。

名称为一种苜蓿提取物及其制备方法和用途的中国专利申请（申请号200610037420），公开了苜蓿提取物皂苷的制备方法以及它在制备降血脂与抗动脉粥样硬化的药物方面用途。它包括下列步骤：取苜蓿青干草、切碎，用浓度为６５％的乙醇回流提取１-３次，合并提取液，过滤，滤液回收溶剂，浓缩，得一次浓缩液；将一次浓缩液分别按下述步骤之一或组合进行处理：ａ.将一次浓缩液喷雾或真空干燥，过筛，得苜蓿粗提取物；ｂ.一次浓缩液加入乙醇至乙醇浓度达６５％-８５％，搅匀，静置１２-４８小时，弃沉淀，上清液回收乙醇，得二次浓缩液，将经醇沉提取的二次浓缩液喷雾或真空干燥，过筛，得苜蓿醇沉提取物；ｃ.一次浓缩液加入大孔树脂上柱中吸附，用水和５５％-９５％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，得二次浓缩液，将经上柱提取的二次浓缩液喷雾或真空干燥，过筛，得苜蓿上柱提取物。

上述方法存在以下不足之处：单纯的将苜蓿草切碎影响苜蓿利用率；乙醇溶剂提取皂苷类化合物容易含有大量的油脂及糖类杂质；回流提取过程由于需要加热过程，对苜蓿皂苷的生物活性有影响（吴立军. 天然药物化学[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2004.），并且回流过程复杂，费时费工，且初次提取回收率较低，一般为0.3%-0.7%之间。而普通的浸渍法提取率仅在0.1%-0.4%之间。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种利用超声波提取苜蓿皂苷的方法。

本发明所说的苜蓿皂苷的超声波提取方法：是按料液比1g：5-15ml将苜蓿草粉加入体积分数为30%-70%的甲醇中，在超声波条件下提取1-3次，每次10-30分钟，超声波提取工作频率设定为800Hz，温度为20℃，所获产品即为苜蓿皂苷产品。

本发明较好的方案是按料液比1g：15ml将苜蓿草粉加入体积分数为70%的甲醇中，在超声波条件下提取3次，每次20分钟。

针对于回流提取方法中苜蓿利用率的问题，本方法采用粉碎机粉碎，提高利用率，且采用超声波提取方法，可增加溶剂穿透力，提高有效成分溶出速度和溶出数量，而且对有效成分的破坏更少，该过程不需要加热，降低了对有效成分的破坏。

对不同浓度甲醇、不同料液比及不同提取时间和次数条件进行单因素实验对比，然后对超声提取因素正交实验采用提取结果差异较大的水平，甲醇浓度为30%、50%、70%，料液比(g/ml)为1:5、1:10、1:15，超声提取次数为1、2、3次，超声提取时间为10、20、30min的条件，筛选出苜蓿皂苷最佳提取工艺，最佳提取条件为70%的甲醇，苜蓿草粉15倍量，超声波提取三次，每次20min。应用该最佳条件对苜蓿皂苷的提取得率达到0.6%-0.9%之间。

本发明的提取方法与现有技术相比，具有工艺简单，收率高的优点，并且在常温下进行还保证了苜蓿皂苷的生物活性不受影响。

附图说明

图1是甲醇浓度对苜蓿总皂苷得率的影响，

图2 是料液比对苜蓿总皂苷得率的影响，

图3 是提取次数对苜蓿总皂苷得率的影响，

图4 是提取时间对苜蓿总皂苷得率的影响。

具体实施方式

下述实施例中所说的甲醇浓度指体积分数，料液比单位为g/ml。

1.试验目标

本试验设计采用香草醛显色，紫外分光光度法测定含量，通过单因素试验确定苜蓿皂苷超声波提取法的提取工艺，设计正交试验筛选最佳提取工艺，为苜蓿皂苷快速、高效率的提取提供理论依据。本实验提取所用苜蓿材料为盛花期自选品系GL0601，实验材料于2007年9月种植，2009年5月10日采集。

2.试验内容

2.1标准工作曲线和回归方程的建立

精确称取齐墩果酸标准品5mg于25 mL容量瓶中，然后用甲醇溶解并定容，作为标准溶液。吸取标准溶液3mL置于100mL锥形瓶中，挥去甲醇，吸取加入新鲜配制的0.6 mL 5%的香草醛-冰醋酸溶液。再精确加入2.4mL高氯酸，加塞，振混摇匀，置于65℃水浴条件下加热15 min，冰水冷却5 min，精确加入15 mL冰乙酸，摇匀。以未加入标准品的相同试剂作为空白。

依次精确吸取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4mL标准溶液分别置于1cm石英比色皿中，用冰醋酸补足3mL，在400-600nm下用分光光度计测定最大吸收波长，结果于544nm下有最大吸收峰，测定各自的吸光度（A）值。以吸光度为纵坐标，浓度（C，m /V）为横坐标绘制曲线，计算标准曲线的回归方程为：

C=0.0144A+0.0012　r=0.998

根据2002年国家药典进行稳定性、精密度和加样回收率试验。

2.2单因素实验确定正交实验因素水平

精确称取GL0601苜蓿地上部分全株草粉1.00g，分别放入28个150mL锥形瓶中，放入超声波提取器中，工作频率设定为800Hz，温度为20℃，试验条件按照单因素实验表进行，筛选正交实验条件。

2.3超声波提取苜蓿皂苷正交实验

精确称取GL0601苜蓿地上部分全株草粉1.00g，分别放入9个150mL锥形瓶中，放入超声波提取器中，工作频率设定为800Hz，温度为20℃，试验按照单因素实验确定的条件进行正交实验提取。

2.4样品苜蓿总皂苷测定方法

按照实验设计的参数提取苜蓿总皂苷，合并提取液后用定量滤纸过滤，然后浓缩成干浸膏，用20mL水将浸膏溶解，然后用石油醚萃取脱脂，水溶液再用等体积的水饱和正丁醇分别萃取3次，然后将水饱和的正丁醇萃取液合并浓缩，用甲醇溶解并定容在10mL的容量瓶中，备用。精密吸取皂苷提取液0.1mL放入100mL锥形瓶中，70℃水浴蒸干，显色方法采用香草醛-高氯酸进行显色，采用分光光度法测定苜蓿总皂苷的含量，检测波长为544nm。

苜蓿皂苷得率（%）=浸提液中总皂苷的量/原料的总质量×100%

3.试验方案

3.1 试验地点和供试材料

样品采集地为扬州大学实验农牧场，该地区位于江苏江淮平原南端。东经119°39′、北纬32°39′。属于亚热带湿润气候，常年气候温和，多数年份从6月中旬到7月中旬，形成雨季，即“梅雨季节”。2009年平均气温15.8℃，7月最热，平均气温为28.5℃。1月最冷，平均气温为1.2℃，无霜期225d。年降水量965.6mm。供试样品为苜蓿自选品系GL0601盛花期，实验材料于2007年9月种植，2009年5月10日采集。采样地样品种植采用随机区组设计，3次重复。在试验地3个小区重复中每一小区随机取样3株，采集样品包括地上全部分。

3.2材料及处理

测定样品采用四分法取样，取其中500g样品地上部分全株经电热鼓风干燥箱在65℃烘干至恒重后，用小型的植物样本粉碎机粉碎，过孔径0.165mm筛，放在干燥器中，备用。

3.3试剂和仪器

齐墩果酸（昆明科翔生物科技有限公司）；其他试剂均为分析纯。

测定所用设备为：H H-4恒温数显水浴锅（金坛市荣华仪器制造有限公司）；722N可见分光光度计（上海精科）；JZ7122植物粉碎机（上海日晖微电机厂）；CQ12-25超声波清洗机（宁波新芝科器研究所）；RE-85Z旋转蒸发仪（上海青浦沪西仪器厂）。

3.4苜蓿皂苷提取的单因素实验

3.4.1甲醇浓度的选择

在料液比1：10，提取时间20min，提取3次的条件下，加入不同体积分数的甲醇进行提取实验。当甲醇浓度为65%时，溶剂对总皂苷的提取效果最好；甲醇浓度小于65%时，提取得率随浓度的增加而增加；而当甲醇浓度高于65%时，随着甲醇浓度的增大，提取得率逐渐减小。因此，甲醇浓度选择65%时提取效率较好（图1）。

3.4.2料液比的选择

在甲醇浓度为70%，提取时间20min，提取3次的条件下，以不同的料液比进行提取实验，当料液比为1：15时，提取得率达较高值，此后，再提高溶剂用量，得率增加缓慢，因此，料液比为1：15比较合适（图2）。

3.4.3提取次数的选择

在甲醇浓度为70%，料液比为1：10，提取时间20min的条件下，提取次数依次增加，当提取次数为2次时，提取得率达较高值，此后，再增加提取次数，得率增加缓慢，因此，提取次数2次比较合适（图3）。

3.4.4提取时间的影响

在甲醇浓度为70%，料液比为1：10，提取3次的条件下，按不同提取时间进行提取实验，提取时间20min时提取效果比较高（图4）。

3. 5超声波提取法提取苜蓿地上部分植株总皂苷正交试验结果

根据单因素实验对比，超声提取因素采用提取结果差异较大的水平，甲醇浓度为30%、50%、70%，料液体积比为1:5、1:10、1:15，超声提取次数为1、2、3次，超声提取时间为10、20、30min的条件（表1）。

结果表明，影响浸渍法提取苜蓿总皂苷的主次因素为A>C>D>B，即依次为甲醇浓度、提取次数、提取时间、甲醇使用量，最佳提取工艺条件是A₃B₃C₃D₂，即用15倍苜蓿粉末量的70%甲醇提取苜蓿3次，每次20min。

4．试验结果

4.1超声波提取法中甲醇浓度（A）、料液体积比（B）、提取次数（C）和提取时间（D）对苜蓿总皂苷含量的影响均具有显著性差异（P<0.05），各因素在所选水平上对苜蓿皂苷提取效果的影响为：A>C>D>B。

4.2采用超声波法提取有效成分，最佳提取工艺为A₃B₃C₃D₂，即15倍苜蓿粉末量的70%甲醇提取苜蓿3次，每次20min。

Claims

1.一种苜蓿皂苷的超声波提取方法，其特征在于，是按料液比1g：5-15ml将苜蓿草粉加入体积分数为30%-70%的甲醇中，在超声波条件下提取1-3次，每次10-30分钟，超声波提取工作频率设定为800Hz，温度为20℃。

2.根据权利要求1所述的苜蓿皂苷的超声波提取方法，其特征在于，是按料液比1g：15ml将苜蓿草粉加入体积分数为70%的甲醇中，在超声波条件下提取3次，每次20分钟。