CN103845396B - 山核桃甾醇提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种山核桃甾醇提取物，该提取物中总甾醇重量含量为10～50%，并且所述的总甾醇包括β‑谷甾醇、岩皂甾醇、菜油甾醇和豆甾醇。总甾醇中的β‑谷甾醇重量含量为70‑95%，并且β‑谷甾醇、岩皂甾醇、菜油甾醇、豆甾醇之间的重量比为70～95:1～10:2～12:1～15。本发明还同时提供了上述山核桃甾醇提取物的制备方法。该山核桃甾醇提取物能用于制备降血脂的药物、日用化妆品、或保健品。

Description

山核桃甾醇提取物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及农副产品深加工及综合利用领域。更具体地涉及一种从山核桃中提取的植物甾醇类提取物及其制法和用途。

背景技术

山核桃(Carya)又名“小胡桃”、核桃楸，系国家3级保护的濒危植物。属胡桃科、胡桃属植物，起源于第三纪及白垩纪，是被子植物中较古老的类群之一。山核桃生长在气候优越、土壤肥沃、植被茂盛的自然环境中，属纯野生果类，是集山地之灵气哺育而成，无任何公害污染的天然绿色食品。山核桃属种类较多，约有30种，主产美洲，我国有临安山核桃、大别山山核桃、湖南山核桃、贵州山核桃和云南山核桃5种，另从美洲引入栽培美国山核桃。山核桃属中种植量较大的为美国山核桃和临安山核桃。美国山核桃年产量为78000吨-18000吨，市场价值可达200亿到400亿美元。临安山核桃主产于浙、皖交界的天目山区，临安是浙江山核桃主产地之一。截至2011年，杭州市山核桃种植面积超过80万亩，产值超过23亿元。

山核桃中天然活性成分种类较多，除基本的营养成分外，山核桃中含有的主要功能性成分有：酚酸、黄酮、甾体类、萜类、生物碱、活性多糖、维生素等，其中以酚酸、生育酚、甾醇等为主。目前对山核桃活性成分的研究多局限在具有本国资源特色的山核桃品种上，有其是美国山核桃的研究较为全面和深入。

中国是山核桃生产、利用和研究的古国。然而国内科研工作者对山核桃资源的深入开发和利用上仍处于探索阶段，如利用山核桃制备膳食纤维、分离活性蛋白、多糖，开发高营养的饲料等。

Laura等（2010）研究山核桃中酚酸含量极为丰富，主要含有鞣花酸、没食子酸、绿原酸、对羟基苯甲酸，其中鞣花酸为其主要成分。Margit等（2006）系统研究了10种常见坚果中的生育酚种类和含量，研究表明美国山核桃生育酚以γ-生育酚为主，其含量可达生育酚总量的90%以上。

然而，迄今为止人们多山核桃中的许多构成成分和功能还了解较少。为了更有效地开发和利用山核桃资源，本领域迫切需要发现和开发山核桃中具有有益功能的各种成分。

植物甾醇是3位为羟基的甾体化合物，以环戊烷全氢菲为主体骨架，天然植物甾醇种类繁多，主要包括β-谷甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇和菜油甾醇四种无甲基甾醇。一般认为，植物油及其加工产品是植物甾醇最丰富的天然来源，其次是谷物副产品和坚果。玉米油、菜籽油、米糠油、小麦胚芽油、黑麦、小麦、大麦和燕麦都含有丰富的甾醇。关于植物甾醇的应用，迄今已发表了大量的著作，领域涉及医药、化妆品、食品、饲料、光学产品、油漆、颜料、树脂、造纸、纺织、杀虫剂及除草剂等。以植物甾醇为原料，可合成几乎所有的甾体药物，其在世界范围内是一个有着40亿美元的产业。因此，植物甾醇的分离和纯化得到了人们的高度重视。

植物油精炼副产物，制糖副产物以及造纸废液中都具有丰富的甾醇。其中，植物油精炼副产物是甾醇的主要来源。从原料中提取甾醇通常分两步进行。先从原料中提取粗甾醇，然后再进一步精制。常用方法包括溶剂结晶法、分子蒸馏法、酶法、干式皂化法和络合法。但这些工艺均还不够理想，或是耗费大量易燃有机溶剂，或是产品纯度不高，或是高温易使甾醇分解。

目前现有的山核桃提取物，其总甾醇仅包含β-谷甾醇和豆甾醇。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种从山核桃中提取的植物甾醇类提取物--山核桃甾醇提取物及其制备方法和用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种山核桃甾醇提取物，该提取物中总甾醇重量含量为10～50%，并且所述的总甾醇包括β-谷甾醇、岩皂甾醇、菜油甾醇和豆甾醇（基本由上述4种甾醇组成）。

作为本发明的山核桃甾醇提取物的改进：总甾醇中的β-谷甾醇含量为70-95%，并且β-谷甾醇、岩皂甾醇、菜油甾醇、豆甾醇之间的重量比为70～95:1～10:2～12:1～15。

作为本发明的山核桃甾醇提取物的进一步改进：该提取物中总甾醇重量含量为20-40％，并且总甾醇中的β-谷甾醇含量为75-90％。

作为本发明的山核桃甾醇提取物的进一步改进：β-谷甾醇、岩皂甾醇、菜油甾醇、豆甾醇之间的重量比为75～90:2～10:2～10:2～11。

作为本发明的山核桃甾醇提取物的进一步改进：β-谷甾醇、岩皂甾醇、菜油甾醇、豆甾醇之间的重量比例为76.5:9.6:2.9:11。

本发明还提供了上述山核桃甾醇提取物的制备方法，包括以下步骤：

1）、将山核桃粉碎（20-40目）后作为原料，在分离釜中，于下述条件对原料进行超临界流体萃取：萃取剂为CO₂，萃取压力为15～35MPa，萃取温度为40～70℃，分离温度为30～50℃，分离压力为4～8MPa，循环动态萃取1～5h；

2）、从分离釜中取出萃取物，经干燥（于50～60℃干燥40～60分钟），从而获得山核桃甾醇提取物。

作为本发明的山核桃甾醇提取物的制备方法的改进：步骤1）中的萃取压力为20～30MP，萃取温度为45～65℃，使用夹带剂，所述夹带剂的用量为山核桃重量的5～15%；所述夹带剂为C1～C4的醇类有机溶剂（即，C1～C4的醇类有机溶剂中的任意一种）或C1～C4的酮类有机溶剂（即，C1～C4的酮类有机溶剂中的任意一种）。

本发明还同时提供了利用上述山核桃甾醇提取物制备而得的组合物，由0.01-99.9wt％的山核桃甾醇提取物和作为余量的可接受载体组成。

作为本发明的组合物的改进：组合物为药物组合物、保健品组合物、食品组合物或化妆品组合物。

本发明还同时提供了上述山核桃甾醇提取物的用途：用于制备降血脂的药物、日用化妆品、或保健品。

本发明人经过多年深入研究，对山核桃的各种成分进行了提取分离，获得了一种可有效消炎、防治心脑血管疾病、降血脂的提取物，对该提取物的研究表明，该提取物主要含β-谷甾醇、岩皂甾醇、菜油甾醇和豆甾醇等成分，在此基础上完成了本发明。

如本文所用，山核桃指山核桃树的果实。可用于本发明山核桃可以是山核桃仁，也可以是山核桃皮，也可以是山核桃加工过程中产生的废弃物，如山核桃壳和废果等。优选原料是山核桃壳和山核桃仁。

本发明采用的原料可以进行预处理，也可以不经过预处理。一种优选原料是粉末形式的山核桃仁。例如，收集山核桃仁、山核桃皮、山核桃壳，打成浆压榨或直接晾晒到一定程度，再干燥到含水量约5～10%，将其粉碎到约20～40目的粉末。

可用于本发明的山核桃品种没有特别限制，可以是不同种的山核桃，优选临安山核桃和美国山核桃。

如本文所用，“本发明的活性物质”指山核桃甾醇提取物。

如本文所用，“本发明的活性物质制剂”或“本发明的活性组合物”指含有山核桃甾醇提取物的组合物，包括药物组合物和保健品组合物。

本发明的山核桃甾醇提取物宜用超临界流体萃取技术提取，虽然也可其他方法提取。

一种优选的方法是采用超临界流体萃取技术从山核桃及其加工废弃物（山核桃壳）中提取甾醇类化合物。在一优选方式中，萃取剂为CO₂，萃取压力为15～35MPa，萃取温度为40～70℃，分离温度为30～50℃，分离压力为4～8MPa，并可以在萃取过程中加入醇或酮作为夹带剂，起到增效作用。

在更优选的方式中，将约20-40目山核桃粉末放入超临界萃取釜中，萃取剂选CO₂，CO₂经压缩机升压同时对萃取釜加温，当萃取压力达到15～35MPa，萃取温度达到40～70℃时，开始循环；在循环过程中，CO₂和萃取物在分离器中经减压，将萃取物在分离器中析出，CO₂循环使用，分离釜1设定分离压力为6～8MPa、温度为35～45℃，分离釜2设定分离压力为4～7MPa、温度为30～35℃；在萃取过程中使用或不使用夹带剂的状态下，循环动态萃取1～5h，使用的夹带剂可以是C1～C4的醇或酮类有机溶剂(如甲醇、乙醇、丙酮等)，用量一般为原料重量的5～15%。萃取完成后，从分离釜中取出萃取物，经低温干燥后，就得到山核桃甾醇提取物，并从分离釜中回收夹带剂（在使用夹带剂的状态下），停机从萃取釜中取出萃余物。

本发明的山核桃甾醇提取物是一种以β-谷甾醇、岩皂甾醇、菜油甾醇、豆甾醇为主的混合物。用Liebermann Burchard分光光度法检测，以β-谷甾醇为标准品，测得提取物中总甾醇的含量为10～50%（较佳地为20～40％）；用UPLC技术分析，其中β-谷甾醇含量（相对于总甾醇而言）为70～95%（较佳为75～90%），β-谷甾醇、岩皂甾醇、菜油甾醇、豆甾醇之间比例为70～95:1～10:2～12:1～15。更佳地为75～90:2～10:2～10:2～11。

本发明的山核桃甾醇提取物具有消炎、降血脂等有益作用，因此可用于制备防治心脑血管疾病（降血脂）的药物、日用化妆品、保健品。因此，本发明还提供了一种含有本发明的山核桃甾醇提取物作为有效成份的组合物（包括药物组合物、保健品组合物、食品组合物和化妆品组合物等）。此外，本发明的山核桃甾醇提取物还可用于制备降血脂、降胆固醇等防治心脑血管疾病的药物、保健品和食品。

在获得山核桃甾醇提取物后，可用常规方法将其与药学上、食品学上或保健品或化妆品上可接受的载体、赋形剂或稀释剂相混合，形成本发明的药物组合物、食品组合物、保健品组合物或化妆品组合物。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。

以药物组合物或保健品组合物为例，它们可以为固态（如颗粒剂、片剂、冻干粉、栓剂、胶囊、舌下含片）或液态（如口服液）或其他合适的形状。本发明的活性成分（山核桃甾醇提取物)）的含量通常为组合物重量的0.01-99.9％，较佳地为1-99%，更较佳地为2-95%，进一步更佳地为5-90%，最佳地10-80%。

药物组合物可以为单剂或多剂形式。按施用剂量计，通常含有10-2000mg/剂，较佳地约20-1000mg/剂，更佳地50-500mg/剂。

本发明的药物组合物可以通过常规途径进行给药，优选方式是口服。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明药物的施用量，按山核桃甾醇提取物计算，通常为每天约0.1-500mg/kg体重，较佳地约0.5-50mg/kg体重。

本发明的主要优点是：

(a)提供了一种来源广阔、组成明晰、品质优良、质量可控、用途广泛并具有多种生理和药理活性的山核桃甾醇提取物。

(b)通过超临界CO₂流体萃取技术实现了山核桃及其加工废弃物中植物甾醇的高效提取，并且工艺操作简便，得到的山核桃甾醇提取物质量好，品质稳定。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为山核桃甾醇提取物的超高效液相色谱图；

图2山核桃甾醇提取物中植物甾醇的结构图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

通用方法

1）山核桃甾醇提取物中植物甾醇含量测定——Liebermann Burchard比色法

将样品用三氯甲烷萃取溶解后取下层三氯甲烷层。准确移取1ml三氯甲烷样品溶液，加入醋酐2ml和浓硫酸1滴，振荡摇匀后用1cm的比色杯在625nm波长处测定吸光值。每一个样品平行测定2次，以β-谷甾醇为标准品，根据标准曲线换算成相应的总甾醇含量，取平均值得到样品中植物总甾醇的含量。

2）山核桃甾醇提取物的有效成分分析——超高效液相色谱（UPLC）

通过使用超高效液相色谱分析萃取物中存在的甾醇成分和含量。UPLC条件：Waters公司的超高效液相色谱，ACQUITY BEH C18色谱柱（2.1mm i.d.*150mm,1.7μm,Waters），流动相为乙腈：水=9:1，流速为0.6mL/min,柱温为40℃，检测波长为210nm。检测扫面范围为210nm至400nm。

以下实施例中所选用的超临界萃取仪为常规的一萃二分CO₂循环式，包括萃取釜、分离釜、CO₂储罐、夹带剂泵等。

实施例1、一种山核桃甾醇提取物的制备方法：

将临安山核桃剥壳后，将山核桃仁打成浆，初步晒干后，再用微波干燥到水分含量为5%（重量%），粉碎成20目的山核桃粉末5kg作为原料，并将其放入超临界萃取釜中，升温到50℃，开动柱塞泵泵入CO₂，通过预热器进入萃取釜中，当压力达到25MPa,开始循环；开启夹带剂泵，使10%原料重量的乙醇通过预热器后同时进入萃取釜；在循环过程中，CO₂和萃取物在分离器中经减压，将萃取物在分离器中析出，CO₂循环使用，分离釜1设定分离压力为8MPa、温度为40℃，分离釜2设定分离压力为5MPa、温度为30℃；萃取4h后，从分离釜1、2中取出萃取物60g，得率为1.2%，经低温干燥（即，于50-60℃干燥50分钟）后，得到45g的山核桃甾醇提取物，并从分离釜1、2中回收夹带剂；停机从萃取釜中取出萃余物。

对提取物进行成分分析，结果如图1-2所示。

图1表明山核桃甾醇提取物成分包括：9min左右为岩皂甾醇，11min左右为菜油甾醇，12min左右为豆甾醇，16min左右为β-谷甾醇。

图2证实了提取物中含有岩皂甾醇（fucosterol）、菜油甾醇（campesterol）、豆甾醇（stigmasterol）、β-谷甾醇（β-sitosterol）。

UPLC法分析山核桃甾醇提取物的成分含量，其总甾醇含量为25.6%，β-谷甾醇为19.6%（即，总甾醇中β-谷甾醇的含量为76.56%），β-谷甾醇、岩皂甾醇、菜油甾醇、豆甾醇之间的重量比例为76.5:9.6:2.9:11。

实施例2、一种山核桃甾醇提取物的制备方法：

将美国山核桃壳壳初步晒干后用热风（70～90℃）干燥到水分含量为5%，粉碎成20目的山核桃壳粉末5kg作为原料，并将其放入超临界萃取釜中，升温到60℃，开动柱塞泵泵入CO₂，通过预热器进入萃取釜中，当压力达到30MPa,开始循环；开启夹带剂泵，使10%的丙酮通过预热器后同时进入萃取釜；在循环过程中，CO₂和萃取物在分离器中经减压，将萃取物在分离器中析出，CO₂循环使用，分离釜1设定分离压力为8MPa、温度为45℃，分离釜2设定分离压力为5MPa、温度为30℃；萃取2.5h后，从分离釜1、2中取出萃取物35g，得率为0.7%，经低温干燥后，得到31g的山核桃取物，并从分离釜1、2中回收夹带剂；停机从萃取釜中取出萃余物。

对提取物进行成分分析，结果同实施例1。UPLC法分析提取物的成分含量，其总甾醇含量为31.7%，β-谷甾醇含量为25.4%（即，总甾醇中β-谷甾醇的含量为80.12%），β-谷甾醇、岩皂甾醇、菜油甾醇、豆甾醇比例为80.2:3.5:6.4:9.9。

实施例3、一种山核桃甾醇提取物的制备方法：

将云南山核桃仁粉碎后打成浆，经压榨除水初步晒干后，用微波干燥到水分含量为5%，粉碎成20目的山核桃仁粉末6kg，并将其放入超临界萃取釜中，升温到45℃，开动柱塞泵入CO₂，通过预热器进入萃取釜中，当压力达到20MPa,开始循环；在循环过程中，CO₂和萃取物在分离器中经减压，将萃取物在分离器中析出，CO₂循环使用，分离釜1设定分离压力为6MPa、温度为35℃，分离釜2设定分离压力为5MPa、温度为30℃；萃取1h后，从分离釜1、2中取出萃取物60g，得率为1.0%，经低温干燥后，得到49g的山核桃甾醇提取物；停机并从萃取釜中取出萃余物。

对提取物进行成分分析，结果同实施例1。UPLC法分析提取物的成分含量，其总甾醇含量为37.1%，β-谷甾醇含量为32.8%（即，总甾醇中β-谷甾醇的含量为88.4%），β-谷甾醇、岩皂甾醇、菜油甾醇、豆甾醇之间比例为88.5:2:7.5:2。

实施例4、一种山核桃甾醇提取物的制备方法：

将湖南山核桃仁和壳磨碎后打成浆，经压榨除水后初步晒干后，用微波干燥到水分含量为5%，粉碎成20目的粉末6kg，并将其放入超临界萃取釜中，升温到50℃，开动柱塞泵泵入CO₂，通过预热器进入萃取釜中，当压力达到到15MPa,开始循环；开启夹带剂泵，使10%的乙醇通过预热器后同时进入萃取釜；在循环过程中，CO₂和萃取物在分离器中经减压，将萃取物在分离器中析出，CO₂循环使用，分离釜1设定分离压力为7MPa、温度为40℃，分离釜2设定分离压力为5MPa、温度为30℃；萃取2.5h后，从分离釜1、2中取出萃取物90g，得率为1.8%，经低温干燥后，得到78g的山核桃甾醇提取物，从分离釜1、2中回收夹带剂，停机从萃取釜中取出萃余物。

对提取物进行成分分析，结果同实施例1。UPLC法分析提取物的成分含量，其总甾醇含量为27.3%，β-谷甾醇含量为22.4%（即，总甾醇中β-谷甾醇的含量为82.05%），β-谷甾醇、岩皂甾醇、菜油甾醇、豆甾醇之间比例为81.9:6.5:3.8:7.8。

实施例5、一种山核桃甾醇提取物的制备方法：

将贵州山核桃皮切碎后初步晒干后，用微波干燥到水分含量为5%，粉碎成20目的粉末5kg，并将其放入超临界萃取釜中，升温到50℃，开动柱塞泵泵入CO₂，通过预热器进入萃取釜中，当压力达到到25MPa,开始循环；在循环过程中，CO₂和萃取物在分离器中经减压，将萃取物在分离器中析出，CO₂循环使用，分离釜1设定分离压力为8MPa、温度为45℃，分离釜2设定分离压力为5MPa、温度为30℃；萃取4h后，从分离釜1、2中取出萃取物45g，得率为0.9%，经低温干燥后，得到37g的山核桃甾醇提取物，停机并从萃取釜中取出萃余物。

对提取物进行成分分析，结果同实施例1。UPLC法分析提取物的成分含量，其总甾醇含量为22.9%，β-谷甾醇含量为19.8%（即，总甾醇中β-谷甾醇的含量为86.46%），β-谷甾醇、岩皂甾醇、菜油甾醇、豆甾醇之间比例为86.6:2:8.7:3.6。

活性测试1、将实施例1所得的山核桃甾醇提取物进行如下性能检测

山核桃甾醇提取物的降血脂作用：

清洁级实验大鼠饲养室，温度23±2℃，日温差±1℃，湿度50～70%，噪音＜50dB，光照150～200Lx，12h:12h明暗交替。饮水及方式：去离子水，自由饮水。喂养方式：上午8:00～8:30之间喂食，除正常对照组喂普通饲料外，其余各组喂高脂饲料(自由采食)。90只体重在150～170g的SD雄性大鼠，用基础饲料作3d适应性饲养后，随机分为正常对照组(10只)和高脂造模组(80只)。造模组参照徐叔云的《药理实验方法学》喂饲高脂饲料，饲养期间，隔日记录进食量，每周称重，4周后测定空腹血清TC，当TC值>3.00mmol/L即确定为高脂血症动物模型，选出60只，随机分为山核桃甾醇提取物低中高三个剂量组、β-谷甾醇组、洛伐他汀试验组和模型对照组，每组10只。三个剂量的山核桃甾醇提取物组、β-谷甾醇组、洛伐他汀组、正常对照、模型对照组分别按表灌饲给药，持续60d，饲养期间，正常对照组喂饲普通饲料，其余组仍喂饲高脂饲料，记录进食量，每周称重，并收集粪便，烘干称重。分别于实验第20、40、60d禁食12h，大鼠眼眶静脉丛取血，制备血清，在日立7060全自动生化分析仪上测定血清中TC、TG、门冬氨酸氨基转移酶（AST）丙氨酸氨基转移酶（ALT）和碱性磷酸酶（ALP）含量。断颈处死，取肝脏，称重，计算肝脏指数；另取肝大叶，用于测定肝中TC和TG含量。采用SPSSV10.0和SAS8.0软件包进行统计。计量资料先经正态分布和方差齐性检验，方差不齐性采用非参数检验。同组样本前后比较采用配对t检验。所有数据以(x±SD)表示。

表1、山核桃甾醇提取物（PBS25）大鼠降脂试验的组别设计

表2、实验性高脂血症SD大鼠血清TC及TG含量的变化(n＝10)

注，Δ为p<0.01，与正常组相比；**为p<0.01，*为p<0.05，与模型组相比。

表3、实验大鼠体重、肝重、肝指数及肝脏TC、TG和血清ALT、AST、ALP含量的变化(n＝10)

**为p<0.01，*为p<0.05，与模型组相比。

PBS₂₅三个剂量组、β-谷甾醇组、洛伐他汀对照组、模型对照组、正常对照组大鼠分别按表灌饲给药六周。结果表明，在平均日摄食量上，正常对照组大鼠显著高于其他各组（p<0.01），而其他各组大鼠间的平均日摄食量无显著差异（p>0.05）；在平均排便量上，正常对照组大鼠也显著高于其他各组（p<0.01），而其他各组大鼠间的摄食量同样无显著差异（p>0.05）；在体重变化上，正常对照组大鼠则显著低于其他各组（p<0.01），而其他各组大鼠间无显著差异（p>0.05）。这说明：（1）大鼠对油腻的高脂饲料不太适应，导致造模大鼠的摄食量有所减少，从而影响其排便量；（2）试验设计以TC>3mmol/L作为大鼠高脂血症模型造模成功的依据，此外体重的显著差异也从另一方面说明造模的成功。（3）除高脂饲料外，PBS₂₅、β-谷甾醇和洛伐他汀对大鼠平均日摄食、排便量及体重变化均无影响。SD大鼠血清TC及TG含量六周的变化情况见表。由表所示，造模后，造模大鼠血清TC、TG浓度显著高于正常组（p<0.05）。给药2周后，与模型组相比，低、中、高剂量的PBS₂₅、β-谷甾醇、洛伐他汀均开始显现出降血清TC的作用（p<0.05），并逐渐增强；在给药六周后，各试验组均能极显著地降低TC（p<0.01），抑制效果的强弱顺序为：洛伐他汀组>β-谷甾醇组>PBS₂₅高剂量组>PBS₂₅中剂量₅组>PBS₂₅低剂量组。与此同时，给药两周后，各试验组均没有显示出降低TG的作用；给药4周后，PBS₂₅高剂量组能极显著地降低大鼠血清TG（p<0.01），PBS₂₅低、中剂量组也表现出显著的抑制作用（p<0.05）；给药到第六周时，唯有PBS₂₅的低剂量和中剂量表现出显著的降TG作用（p<0.05），其余各给药组均没有表现出显著的TG抑制作用。各剂量组对高脂血症SD大鼠体重、肝重、肝指数及肝脏TC和TG（10%匀浆浓度）、血清ALT、AST、ALP含量的影响见表。与模型组相比，PBS₂₅高剂量和中剂量、β-谷甾醇以及洛伐他汀试验组的大鼠肝脏TC和TG浓度均显著下降（p<0.05或p<0.01），而PBS₂₅低剂量组只降低了大鼠肝脏TC浓度（p<0.05），对TG影响不大（p>0.05）；与模型组相比，洛伐他汀能显著降低大鼠血清ALT和ALP浓度（p<0.05），其他各给药组的血清AST、ALT和ALP变化不大（p>0.05）；与模型组相比，PBS₂₅高、低剂量组和β-谷甾醇的大鼠肝重显著下降（p<0.05），其他各试验组无论对体重还是肝重均无显著影响（p>0.05）；PBS₂₅高剂量组能极显著降低肝指数（p<0.01），而其他各组与模型组相比，均无差异性（p>0.05）。

甾醇类化合物是一种公认的降胆固醇功能因子，山核桃甾醇提取物（PBS₂₅）是一种采用超临界CO₂流体萃取技术从山核桃中得到的植物甾醇混合物，除了25%以上的甾醇含量外，还含有丰富的不饱和脂肪酸。山核桃甾醇提取物能显著降低高脂血症大鼠血清总胆固醇、甘油三酯，具有优良的降脂和调脂功能；能有效降度大鼠肝脏TC、TG浓度，减轻脂肝重和肝指数的作用，对肝脏的色泽、质地、体积有显著改善，具有护肝作用。

本发明采用超临界CO₂流体萃取技术从山核桃及其加工废弃物中提取植物甾醇类提取物。不仅工艺操作简便，而且得到的山核桃甾醇提取物质量好，品质稳定。而且该提取物具有良好的消炎、降血脂和血胆固醇等功效，在化妆品、食品、保健品、药品中有广泛的应用前景。

活性测试2、将上述实施例所得的山核桃甾醇提取物等同于上述活性测试1的方法进行检测，所得结果如下：

表4山核桃甾醇提取物大鼠降脂试验的组别设计

表5实验性高脂血症SD大鼠血清TC及TG含量的变化(n＝10)

注，Δ为p<0.01，与正常组相比；**为p<0.01，*为p<0.05，与模型组相比。

表6、实验大鼠体重、肝重、肝指数及肝脏TC、TG和血清ALT、AST、ALP含量的变化(n＝10)

**为p<0.01，*为p<0.05，与模型组相比。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (4)

1.山核桃甾醇提取物，其特征在于：该提取物中总甾醇重量含量为20～40％，并且所述的总甾醇包括β-谷甾醇、岩皂甾醇、菜油甾醇和豆甾醇；

总甾醇中的β-谷甾醇重量含量为75～90％，并且β-谷甾醇、岩皂甾醇、菜油甾醇、豆甾醇之间的重量比为75～90:2～10:2～10:2～11；

山核桃甾醇提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)、将山核桃粉碎后作为原料，在分离釜中，于下述条件对原料进行超临界流体萃取：萃取剂为CO₂，萃取压力为15～35MPa，萃取温度为40～70℃，分离温度为30～50℃，分离压力为4～8MPa，循环动态萃取1～5h；

2)、从分离釜中取出萃取物，经干燥，从而获得山核桃甾醇提取物。

2.根据权利要求1所述的山核桃甾醇提取物，其特征在于：

步骤1)中的萃取压力为20～30MP，萃取温度为45～65℃，使用夹带剂，所述夹带剂的用量为山核桃重量的5～15％；所述夹带剂为C1～C4的醇类有机溶剂或C1～C4的酮类有机溶剂。

3.根据权利要求1或2所述的山核桃甾醇提取物，其特征在于：总甾醇含量为25.6％，β-谷甾醇为19.6％，β-谷甾醇、岩皂甾醇、菜油甾醇、豆甾醇之间的重量比例为76.5:9.6:2.9:11；

其制备方法为：

将临安山核桃剥壳后，将山核桃仁打成浆，初步晒干后，再用微波干燥到水分含量为5％(重量％)，粉碎成20目的山核桃粉末5kg作为原料，并将其放入超临界萃取釜中，升温到50℃，开动柱塞泵泵入CO₂，通过预热器进入萃取釜中，当压力达到25MPa,开始循环；开启夹带剂泵，使10％原料重量的乙醇通过预热器后同时进入萃取釜；在循环过程中，CO₂和萃取物在分离器中经减压，将萃取物在分离器中析出，CO₂循环使用，分离釜1设定分离压力为8MPa、温度为40℃，分离釜2设定分离压力为5MPa、温度为30℃；萃取4h后，从分离釜1、2中取出萃取物60g，得率为1.2％，经50～60℃干燥50分钟的低温干燥后，得到45g的山核桃甾醇提取物，并从分离釜1、2中回收夹带剂；停机从萃取釜中取出萃余物。

4.如权利要求1～3任意一种山核桃甾醇提取物的用途，其特征在于：用于制备降血脂的药物、日用化妆品、或保健品。