CN102885861A - 一种常温提取灵芝子实体天然活性物质新工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种常温提取灵芝子实体天然活性物质新工艺,其包括如下步骤:灵芝子实体预处理、超微粉碎、超声波循环提取、真空浓缩、真空冷冻干燥后即得灵芝子实体天然活性物质。本发明通过将超微粉碎和超声波循环提取技术有效的结合,使灵芝子实体的天然活性物质溶解性好,能在常温下进行提取,对灵芝中的有效成分影响小,提取的有效成分含量高,提取效率高,能耗低。超声波循环提取设备在超声波循环提取中,超声场固定分布,物料循环,因而超声场均匀地作用于流动状态的物料,从而最大限度地提高了超声场作用的物料处理量。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物提取领域,特别涉及集成双超技术-超微粉碎技术和超声波循环提取技术,实现对总多糖和总三萜等两大天然活性物质的高效提取的一种在室温条件下进行灵芝子实体常温提取的新工艺。
背景技术
灵芝(Ganoderma lucidum)子实体作为中药制药和保健食品的生产原料,已知其中两大类天然活性物质是多糖和三萜类。在中药制药和保健食品生产领域,有关灵芝多糖,主要采用热水提取法对灵芝子实体中多糖等成分进行提取和浓缩,之后采用水提醇沉工艺获得多糖含量至少20~30%的粗制品,可供进一步分离和制备灵芝多糖中的某一组分或特定分子量的多糖成分。在天然产物化学研究领域,有关灵芝三萜类化合物,基本上都是采用多种有机溶剂进行复杂的多次萃取和层析分离,最终获得总三萜类(粗制品),可以进一步用于灵芝三萜单体的分离和制备,并作为检测分析和构建指纹图谱的标准品或对照品。
在中药制药和食品生产领域,通常采用多功能提取罐和夹层锅作为提取设备,在原料的前处理通常将子实体切块或切片、粉碎成棉絮状粗颗粒,以水作为提取介质,在加盖式或敞开式加热沸腾条件下进行,整个提取过程长达数十小时才能完成;提取完成后,进行料液的分离,收集提取液,进行浓缩和干燥脱水得到干膏状或喷雾干燥成粉末状的提取物(后者也称浸膏粉)。
如陈体强等(1994)报道采用热水提取、过滤并合并滤液,浓缩后进行喷雾干燥得到灵芝浸膏粉(陈体强,李开本,何修金,等.灵芝浸膏粉微量元素与氨基酸测试分析简报[J].中国中药杂志,1994,9(2):97-98)。
朱培根、陈体强等报道采用热水提取、真空浓缩和喷雾干燥工艺,考察生产原料对灵芝浸膏粉质量的影响(朱培根,陈体强,李开本,等.生产原料对灵芝浸膏粉质量的影响[J].福建省农业学报,1997,12(3):39-43.)。
发明专利《一种灵芝干浸膏的制备方法》(专利号CN200610053412.7)涉及采用水煎煮(热水提取法),并将水提液进行超滤膜浓缩,最后干燥得到干浸膏,得为1.37%。
胡斌杰等报道超声波法提取灵芝多糖,与传统热水法相比,提取时间缩短3/4,可以在较低的温度60℃下多糖提取率提高30%以上(胡斌杰,陈金锋,王宫南.超声波法与传统热水法提取灵芝多糖的比较研究[J].食品工业科技,2007,28(2):190-192.)。发明专利《一种灵芝多糖的高效制备方法》(专利号CN200810156039.7)涉及将子实体粉碎得到的灵芝粉,用28倍进行超声波提取(680W,17min),灵芝粗多糖得率为20.79±0.11mg/g。
发明专利《以灵芝子实体为原料提取灵芝三萜与灵芝多糖的方法》(专利号CN200910097776.9)涉及超声波辅助醇提步骤获得灵芝三萜后,再以复合酶辅助水提醇沉制备灵芝多糖,分别经喷雾干燥得到灵芝三萜提取物和灵芝多糖提取物。
发明专利《灵芝活性多糖的低温提取技术》(专利号CN200910310776.2)涉及一种灵芝活性多糖的低温三重提取:将灵芝在低温条件下进行水提取、有机溶剂提取后进行酶解、浓缩、超滤后低温活化处理后进行冷冻干燥。
发明专利《灵芝提取新工艺》(专利号CN98120550.X)涉及一种以氨溶液提取后再用水提取,可显著提高产品的有效成分提出率。
发明专利《灵芝子实体中的有效部位、提取方法及其用途和制剂》(公开号CN102370671A)对灵芝子实体的脱脂产物进行碱提、透析分离等步骤之后,再选用喷雾干燥、减压干燥、冷冻干燥或常压干燥中的一种方法进行干燥以获得有效FYGL,对蛋白酪氨酸磷酸酶活性有抑制作用,具用显著降血糖功效。
上述中各种提取技术方法,可以归纳为三类:一是成熟实用的传统热水提取工艺,但存在能耗较大,需要较大的设备和占地空间或车间;二是利用化学溶剂如氨、碱等进行提取,或加酶处理,其工艺过程产生一些化学或酶解反应,提取物中难免有残留成分或新生成的复杂成分;三是超声波辅助提取,以发散式的超声波进行静态的提取,仅适于较小规模的实验性制备或生产,效率较低。
超微粉碎(Superfine pulverization)技术:又称超细粉体工程技术,属于材料科学与精细化工领域的。物料经超细化后,随着其比表面的骤增,可引起许多特性的变化,如可以提高有效成分溶解释放速,从而大幅度地提高原材料的使用效果和利用率。
超声波循环提取(Ultrasonic circulating extraction)技术:超声波作用于提取介质时产生的高频振动可促进提取介质与被提取物的液-固界面之间发生分子的相互渗透,强化溶质扩散、传递及溶解,使化学成分在提取介质中快速达到浓度平衡;空化效应使化学成分得以释放、扩散进入溶剂并充分溶解;而从而极大地提高可溶性成分溶出效率并缩短提取时间。在超声波循环提取中,超声场固定分布,物料循环,超声场均匀地作用于流动状态的物料,从而最大限度地提高了超声场作用的物料处理量。
在国内外,这两项技术虽然已开始应用于中药与天然药物制药领域和保健食品研究与开发中,但基本上都是单项的独立应用。
董艳红等报道对响应曲面优化超声波提取灵芝多糖工艺进行研究,所用的超声波提取为发散式、静态提取,灵芝多糖得率为20.790.11mg/g(董艳红,李姝婧,郑惠华,等.响应曲面优化超声波提取灵芝多糖工艺研究.食品科学,2009,16(30):98-101.)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在常温条件以水为提取介质,将超微粉碎技术和超声波循环提取技术高效集成应用——称之为“双超”提取技术,实现灵芝子实体多糖和三萜酸等天然活性物质的高效提取的常温提取灵芝子实体天然活性物质新工艺。
本发明中所称的灵芝子实体天然活性物质,呈干膏状,称之为双超提取物。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种常温提取灵芝子实体天然活性物质新工艺,其包括如下步骤:
1)灵芝子实体预处理:将灵芝子实体切片后粉碎成20~40目的粉末;
2)超微粉碎:采用超微粉碎装置将20~40目的粉末粉碎至粉末粒度为200~300目,得灵芝子实体微粉末;
3)超声波循环提取:取灵芝子实体微粉末与水按质量比1:10~50混合,得灵芝子实体微粉末混合液,在提取温度36~48℃,超声功率540~720w,间歇比1/4.5~1/5.5s/s的条件下,用超声波循环提取设备对灵芝子实体微粉末混合液提取40~54min,提取后的灵芝子实体微粉末混合液经离心后,对料液进行分离,取上清液,得提取液;
4)真空浓缩:将提取液真空浓缩至20~30°Be',得膏状提取物;
5)真空冷冻干燥:将膏状提取物于-45~-60℃下预冻4~12h后,在真空度≤30Pa下干燥22~24h,即得双超提取物。
进一步,所述的双超提取物包括粗多糖、三萜酸。
进一步,所述的步骤3)中的提取条件设置为提取温度48℃,超声功率670w,间歇比1/5.5s/s,提取时间45min。
进一步,所述的步骤3)中得到的提取液中的粗多糖浓度不低于42mg/mL。
进一步,所述的双超提取物中的粗多糖含量不低于28%,含有三萜酸种类不低于30种。所述的粗多糖含量表示为双超提取物中粗多糖所占的比例。
本发明所述的步骤3)中的具体参数条件可根据体外抗氧化活性指标DPPH清除率(%)和粗多糖浓度(mg/mL)作为评价指标,进行单因素选择和优化;其中体外抗氧化活性指标DPPH清除率(%)越高,表明双超提取物中抗氧化活性成份越多,粗多糖浓度(mg/mL)越高,表明双超提取物中多糖含量越高;所述的优化采用本领域中常用的试验设计优化方法。
本发明采用的超声波循环提取设备是聚能式(20KHz,19~20.5KHz窄幅自动跟踪)。
本发明采用以上技术方案,通过将超微粉碎和超声波循环提取技术有效的结合,使灵芝子实体的天然活性物质溶解性好,能在常温下进行提取,对灵芝中的有效成分影响小,提取的有效成分含量高,提取效率高,能耗低。超声波循环提取设备在超声波循环提取中,超声场固定分布,物料循环,因而超声场均匀地作用于流动状态的物料,从而最大限度地提高了超声场作用的物料处理量。
附图说明
图1是本发明的双超提取物提取工艺流程(技术路线)示意图;
图2是本发明的灵芝子实体;
图3是灵芝子实体切片;
图4是灵芝子实体粉碎后20~40目的粉末;
图5是灵芝子实体微粉末的扫描电子显微镜相片;
图6是本发明的灵芝子实体微粉末的激光粒度分布图;
图7是本发明的双超提取物中三萜酸成分的液相色谱-质谱(LC-MS)图;
图8是本发明的双超提取物中三萜酸成分的高效液相色谱图(标准品对照);
图9是本发明的双超提取物中三萜酸成分的高效液相色谱图(标示出峰时间)。
具体实施方式
本发明的技术方案为:
在常温提取灵芝子实体天然活性物质新工艺,其包括如下步骤:
1)灵芝子实体预处理:将灵芝子实体切片后粉碎成20~40目的粉末;
2)超微粉碎:采用超微粉碎装置将20~40目的粉末粉碎至粉末粒度为200~300目,得灵芝子实体微粉末;
3)超声波循环提取:取灵芝子实体微粉末与水按质量比1:10~50混合,得灵芝子实体微粉末混合液,在提取温度36~48℃,超声功率540~720w,间歇比1/4.5~1/5.5s/s的条件下,用超声波循环提取设备对灵芝子实体微粉末混合液提取40~54min,提取后的灵芝子实体微粉末混合液经离心后,对料液进行分离,取上清液,得提取液;
超声波循环提取设备由北京弘祥隆生物技术有限公司制造,或采用上海矩源机械设备有限公司或南京先欧生物科技有限公司等其他厂家所产的同类设备,频率20KH(19~20.5KHz,窄幅自动跟踪),功率可调。
4)真空浓缩:将提取液真空浓缩至20~30°Be',得膏状提取物;
5)真空冷冻干燥:将膏状提取物于-45~-60℃下预冻4~12h后,在真空度≤30Pa下干燥22~24h,即得双超提取物。
进一步,所述的双超提取物主要包括粗多糖和三萜酸。
进一步,所述的步骤3)中的提取条件设置为提取温度48℃,超声功率670w,间歇比1/5.5s/s,提取时间45min。
进一步,所述的步骤3)中得到的提取液中的粗多糖浓度不低于42mg/mL。
进一步,所述的双超提取物中的粗多糖含量不低于28%,含有三萜酸种类不低于30种。
步骤3)所得的提取液可以测定多糖浓度和DPPH自由基清除率;
步骤5)所得的灵芝提取物可以测定粗多糖含量;同时,可采用经典的盐酸化氯仿萃取法,从步骤5)所得的灵芝提取中分离总三萜酸类成分,并进行高效液相色谱(HPLC)或液相色谱-质谱(LC-MS)联用分析。
上述所用的粗多糖浓度或含量测定方法为:本领域中通用的硫酸苯酚法或硫酸蒽酮法。
所述DPPH清除率是一种常用的体外抗氧化活性指标,具体测定方法如下:
样品组:取样品溶液加入新鲜配制的0.2mmol/L DPPH甲醇溶液,室温25℃避光反应30min,所述的样品溶液与DPPH甲醇溶液两种溶液的体积比为1:1;空白对照组:用重蒸水代替样品溶液,其余同样品组;以80%甲醇溶液为空白调零,在517nm波长处分别测定样品组和空白对照组的吸光值,按公式:清除率/%=[1-A1/A0]×100计算清除率(%),平行测定三次取平均值,式中A0为空白对照组的吸光值,A1为样品组的吸光值。可以在此基础上,建立样品溶液的浓度与DPPH清除率的回归方程或关系曲线,并计算半数有效浓度(EC50值)。
所述盐酸化氯仿萃取法,具体如下:称取约20g灵芝双超提取物。以70%乙醇50ml浸泡1h后超声提取30min,过滤,提取液减压旋转蒸发除去乙醇后加适量蒸馏水溶解,用6mol/L盐酸调节pH 2~3,移至分液漏斗中,以氯仿按1:1(v/v)萃取3次,合并氯仿液,挥去氯仿用甲醇溶解定容至5ml,滤膜过滤即得总三萜酸粗制品,称重计算平均得率(n=3)。
所述的HPLC分析,具体方法条件为:
分析仪器:Waters 2695型高效液相色谱仪,采用Xtimate-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm;美国Welch Material Inc.公司)。
色谱条件:流动相为1%醋酸水溶液(A)和乙腈(B),梯度洗脱程序:0~10min,70%~65%A;10~58min,65%~60%A,58~60min,60%~45%A,60~115min 45%~30%A。流速0.9ml·min-1,柱温25℃,进样量10μL。选取254nm检测波长。
所述的LC-MS分析,具体方法条件为:
分析仪器:Agilent 1100型高效液相色谱-离子阱串联质谱仪(LC-MSD Trap),配有二极管阵列(DAD)检测器,和电喷雾电离源(ESI)。
色谱柱及色谱条件与HPLC一致,经DAD检测选取特征波长254nm。
质谱条件:液相出口分流20%进入质谱检测器(0.2mL/min);电喷雾离子化,极性检出模式:正离子模式(MS+),毛细管电压4000V;雾化气压力20psi;干燥气(N2)流速8L/min,温度300℃;检测方式:一级全扫描,扫描范围m/z=100-1000。
实施例1
如图1所示,本发明常温提取灵芝子实体天然活性物质的操作步骤如下:
1)灵芝子实体预处理:取如图2中所示的灵芝子实体,采用手工切片或中药饮片机将其切制成1~2mm的薄片,切片后的效果如图3所示,然后采用锤式中药粉碎机或旋片式高速粉碎机将薄片粉碎成松散的20~40目的粉末,效果如图4所示;
2)超微粉碎:采用超细粉碎机或超低温磨粉机将20~40目的粉末粉碎至粉末粒度为200~300目,得灵芝子实体微粉末,如图5中所示为灵芝子实体微粉末的扫描电子显微镜相片,在扫描电镜下可见灵芝的超细粉呈纤维状,以分散的菌丝片段形态存在图5,长度范围为10~50μm,直径1.2~4.5μm不等。
如图6所示为灵芝子实体微粉末的激光粒度分布图,由图可看出灵芝子实体微粉末D50.0的粒径在10.92~11.75μm,D75.0的粒径在26.73~30.96μm。灵芝子实体300目超细粉的粒径超过《中国药典》中规定的极细粉(不少于95%的粉末能通过R40/3国标系列200目九号药筛——平均筛孔内径为75±4.1μm)的粒径范围。
3)超声波循环提取:取灵芝子实体微粉末与水按质量比1:12.5混合,得灵芝子实体微粉末混合液,在提取温度48℃,超声功率670w,间歇比1/5.5s/s的条件下,用超声波循环提取设备对灵芝子实体微粉末混合液提取45min,提取液经离心后,取上清液,即得提取液;
4)真空浓缩:分段进行真空浓缩,第一阶段浓缩,将上清液在真空度0.06~0.08MPa,温度60~70℃条件下浓缩至波美度15.7°Be';第二阶段浓缩,将第一阶段浓缩后的浓缩液在真空度0.085~0.09MPa或大于0.09MPa,温度45℃左右的条件下浓缩至波美度23.8°Be',得膏状提取物;
5)真空冷冻干燥:将膏状提取物于-50℃下预冻8h后,在真空度≤30Pa下干燥23h,即得双超提取物。
对上述步骤3)所得的提取液中进行检测,测定结果为:粗多糖浓度为47.87mg/mL,抗氧化活性DPPH清除率为53.62%,表明本发明所用方法提取率较高,提取物中活性物质的活性较高。
对本发明的双超提取物与采用热水提取法得到的灵芝提取物进行可溶性粗多糖含量的分析比较。结果表明:本发明的双超提取物中的可溶性粗多糖(40.0%)较热水提取法得到灵芝提取物中的可溶性粗多糖含量(29.45%)高出许多。
针对本发明的双超提取物,采用经典的盐酸化氯仿萃取法,从中提取分离获得总三萜酸类成分,平均得率为9.37%。LC-MS分析结果表明:本发明的双超提取物(干膏)中含有丰富的灵芝三萜酸成分,其总离子流色谱图和液相色谱图如图7所示。共检出56个分子离子峰,如表1所示解析得到至少31个母分子离子峰,其分子质荷比为m/z:418.3~678.5,与已知灵芝三萜类成分的分子量信息相匹配。其中,分子量较小如ganoderic acid Z(C30H48O3,m/z:456.3),分子量最大是一种三萜皂苷(C30H44O7-C6H12O5,m/z:678.5);大多数为C30结构的四环三萜酸(m/z:456~530)。
本发明通过将超微粉碎和超声波循环提取技术有效的结合,使灵芝子实体的天然活性物质能在常温下进行提取,对灵芝中的有效成分影响小,通过分析检测表明,本发明所的双超提取物活性高,提取的有效成分含量高,提取效率高,能耗低。
实施例2
在常温提取灵芝子实体天然活性物质新工艺,其包括如下步骤:
1)灵芝子实体预处理:取灵芝子实体,采用手工切片或中药饮片机将其切制成1~2mm的薄片,然后采用锤式中药粉碎机或旋片式高速粉碎机将薄片粉碎成松散的20~40目的粉末;
2)超微粉碎:采用超细粉碎机或超低温冷冻磨粉机将20~40目的粉末粉碎至粉末粒度为200~300目,得灵芝子实体微粉末;
3)超声波循环提取:取灵芝子实体微粉末与水按质量比1:10混合,得灵芝子实体微粉末混合液,在提取温度40℃,超声功率720w,间歇比1/4.5s/s的条件下,用聚能式超声波循环提取设备对灵芝子实体微粉末混合液提取54min,提取液经离心后,取上清液,即得提取液。
4)真空浓缩:分段进行真空浓缩,第一阶段浓缩,将上清液在真空度0.06~0.08MPa,温度60~70℃条件下浓缩至波美度17.8°Be';第二阶段浓缩,将第一阶段浓缩后的浓缩液在真空度0.085~0.09MPa或大于0.09MPa,温度45℃左右的条件下浓缩至波美度20°Be',得膏状提取物;
5)真空冷冻干燥:将膏状提取物于-45℃下预冻4h后,在真空度≤30Pa下干燥22h,即得双超提取物。
对上述步骤3)提取液中进行检测,测定结果表明:粗多糖浓度为44.97mg/mL,抗氧化活性DPPH清除率为51.47%;表明本发明所用方法提取率较高,提取物中活性物质的活性较高。
经福建省测试分析中心检测(报告编号:[2011]闽测_YJ-162),采用本发明提取工艺的双超提取物中粗多糖含量为28.4%,是热水提取的灵芝天然活性物质中粗多糖含量(17.8%)的1.6倍。
针对本发明的双超提取物,采用经典的盐酸化氯仿萃取法,从中提取分离获得总三萜酸类成分,平均得率为9.91%。如图8所示为灵芝总三萜酸成分的高效色谱指纹图谱及其与ganoderic acid A(灵芝酸A,C30H44O7)标准品的比对。分析结果表明双超提取物(干膏)中含有较丰富的三萜酸类成分。
实施例3
在常温提取灵芝子实体天然活性物质新工艺,其包括如下步骤:
1)灵芝子实体预处理:取灵芝子实体,采用手工切片或中药饮片机将其切制成1~2mm的薄片,然后采用锤式中药粉碎机或旋片式高速粉碎机将薄片粉碎成松散的20~40目的粉末;
2)超微粉碎:采用超细粉碎机或超低温冷冻磨粉机将20~40目的粉末粉碎至粉末粒度为200~300目,得灵芝子实体微粉末;
3)超声波循环提取:取灵芝子实体微粉末与水按质量比1:50混合,得灵芝子实体微粉末混合液,在提取温度36℃,超声功率540w,间歇比1/5s/s的条件下,用超声波循环提取设备对灵芝子实体微粉末混合液提取40min,提取液经离心后,取上清液,即得提取液。
对上述步骤3)所得的提取液进行检测,测定结果表明:粗多糖浓度为42.68mg/mL,抗氧化活性DPPH清除率为49.26%;表明本发明所用方法提取率较高,提取物中活性物质的活性较高。
4)真空浓缩:分段进行真空浓缩,第一阶段浓缩,将上清液在真空度0.06~0.08MPa,温度60~70℃条件下浓缩至波美度18.4°Be';第二阶段浓缩,将第一阶段浓缩后的浓缩液在真空度0.085~0.09MPa或大于0.09MPa,温度45℃左右的条件下浓缩至波美度30°Be',得膏状提取物;
5)真空冷冻干燥:将膏状提取物于-60℃下预冻12h后,在真空度≤30Pa下干燥24h,即得双超提取物。
对上述步骤5)所得的双超提取物,经福建省测试分析中心测定其中粗多糖含量为33.6%(报告编号:[2011]闽测YJ-128)。
针对本发明的双超提取物,采用经典的盐酸化氯仿萃取法,从中提取分离获得总三萜酸类成分,其粗制品平均得率为9.82%。如图9所示为本发明得到的双超提取物中三萜酸成分的高效液相色谱图(标示出峰时间),表明含有丰富的三萜酸种类。
同时,对所得双超提取物进行体外抗氧化活性检测,结果表明:双超提取物的——DPPH自由基清除能力的半数有效浓度(EC50值)分别为244.6μg/mL,高于普能灵芝提取物(335.96μg/mL);表明本发明得到的灵芝提取物具有更高的体外抗氧化活性。
Claims (5)
1.一种常温提取灵芝子实体天然活性物质新工艺,其特征在于:其包括如下步骤:
1)灵芝子实体预处理:将灵芝子实体切片后粉碎成20~40目的粉末;
2)超微粉碎:采用超微粉碎装置将20~40目的粉末粉碎至粉末粒度为200~300目,得灵芝子实体微粉末;
3)超声波循环提取:取灵芝子实体微粉末与水按质量比1:10~50混合,得灵芝子实体微粉末混合液,在提取温度36~48℃,超声功率540~720w,间歇比1/4.5~1/5.5s/s的条件下,用超声波循环提取设备对灵芝子实体微粉末混合液提取40~54min,提取后的灵芝子实体微粉末混合液经离心后,对料液进行分离,取上清液,得提取液;
4)真空浓缩:将提取液真空浓缩至20~30°Be',得膏状提取物;
5)真空冷冻干燥:将膏状提取物于-45~-60℃下预冻4~12h后,在真空度≤30Pa下干燥22~24h,即得灵芝子实体天然活性物质。
2.根据权利要求1所述的一种常温提取灵芝子实体天然活性物质新工艺,其特征在于:所述的灵芝子实体天然活性物质包括粗多糖、三萜酸。
3.根据权利要求1所述的一种常温提取灵芝子实体天然活性物质新工艺,其特征在于:所述的步骤3)中的提取条件设置为提取温度48℃,超声功率670w,间歇比1/5.5s/s,提取时间45min。
4.根据权利要求3所述的一种常温提取灵芝子实体天然活性物质新工艺,其特征在于:所述的步骤3)中得到的提取液中的粗多糖浓度不低于42mg/mL。
5.根据权利要求3所述的一种常温提取灵芝子实体天然活性物质新工艺,其特征在于:所述的灵芝子实体天然活性物质中的粗多糖含量不低于28%,含有三萜酸种类不低于30种。
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