CN105037448A - 一种快速大量提取分离薏苡仁低聚糖单体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速大量提取分离薏苡仁低聚糖单体的方法，属于植物活性成分的提取分离技术领域，其是以新鲜薏苡仁为原料，经选料烘干、粉碎过筛、加水复配、水洗淀粉、超声波-微波协同提取、真空抽滤、醇析、离心浓缩、冷冻干燥、MPLC分离、MPLC二次分离的步骤，制得具有不同聚合度的薏苡仁低聚糖单体粉末。本发明以UMAE提取、MPLC分离为基础，利用微波、超声波协同提取具有振动匀化的优点，及MPLC制备量大，操作时间较短，分离柱填料能够自主填充、可增加分离选择性的特点，使低聚糖的提取时间、提取效率及分离效率都得到极大提高，且该工艺过程稳定、操作简便，可用于大量分离高纯度的薏苡仁低聚糖单体。

Description

一种快速大量提取分离薏苡仁低聚糖单体的方法

技术领域

本发明属于植物活性成分提取分离技术领域，具体涉及一种快速大量提取分离薏苡仁低聚糖单体的方法。

背景技术

随着科学和公共卫生事业的发展，各种传染病已基本得到有效控制，但各种慢性疾病依然占据人类疾病谱和死亡谱的前列。疾病模式的变化以及科学技术的发展引发人们对食品功能的理性认识，促使人类开始重新审视饮食与现代疾病的关系。因此，功能性食品日益受到人们的青睐。功能性低聚糖广泛存在于生命体内，如在牛奶、蜂蜜、大麦、韭菜、洋葱、大蒜、菊芋、香蕉和雪莲果等天然动植物中均发现存在有功能性低聚糖，其能参与细胞间信息传递、细胞转化等各种生理过程，具有重要的生物活性。同时，低聚糖常被作为功能性食品添加剂添加于饮料（果汁、咖啡、可可、茶、苏打水和酒精性饮料）、牛奶制品（发酵乳、速溶奶粉和冰淇淋）、益生菌酸奶和益生元-益生菌的共生产品（膳食补充低聚糖选择性地促进益生菌生长，与外源益生菌结合促进宿主生长和新陈代谢），因而低聚糖产品的市场潜力巨大。在日本，低聚果糖已被认为是一种食品，已有500多种食品中含有低聚果糖成分。食用低聚果糖不仅能改善肠内益生菌群的状况，减轻腹泻、便秘的症状，改善糖尿病患者和高血脂患者的脂质水平，还能抑制肠内腐败菌群的生长。由于其具有明确的化学结构以及促进人体肠道内有益菌增殖、防龋齿、降血脂等独特的生理功效，功能性低聚糖备受国内外研究者的关注。

目前从天然产物中提取低聚糖的常用方法有：热水恒温回流提取、碱提酸沉法、醇析法、微波或超声波辅助提取等。纯物理的恒温回流提取虽然具有较低的生产成本，但是由于操作时间长、提取率低等弊端，限制了其推广运用；碱提酸沉不仅同样存在提取时间较长、提取率不高等问题，而且其操作过程需要使用大量的化学试剂，容易造成环境污染。微波辅助提取时间短、产率高，但是由于微波具有边角热效应，容易造成受热不均，影响提取率；且用于热不稳定性物质、非极性物质和高粘度物质提取时，也会影响提取效率，因此在利用微波辅助提取时需十分注意控制提取时间及功率。超声-微波协同提取（UMAE）技术集微波、超声波提取特点于一体，既可弥补超声波和微波独立提取的不足，又集中保留了两种提取方法的优点，突出体现在振动匀化，可使样品介质内各点作用一致，且可降低目标物与样品基体的结合力，加速目标物从固相进入溶剂相的过程。将UMAE技术运用于低聚糖的快速提取中，可实现大量低聚糖的提取。

低聚糖的定性和定量分析对其在生物医学和功能性食品方面的表现有着重要的影响。如今，硅胶、活性炭、阴离子交换和凝胶层析技术等一系列的分离方法已被单独或者组合运用于功能性食品领域，用于制备益生元。低聚糖的聚合度对益生菌利用率也具有重要的影响，其吸收能力一般随分子量的减小而增大，同时对抗致病菌能力也有一定的影响，聚合度越低的低聚糖抗菌活性越强。不同聚合度低聚糖的分离已经在上述分离方法中逐步实现。而与传统柱层析法存在操作复杂、填料昂贵等问题相比，液相色谱法具有分辨率高、速度快、重复性高、色谱柱可反复使用、可自动化操作、分析精确度高等特点，能较为准确地鉴定产物和分离情况。闪式制备色谱技术，根据所施加的压力可以分为快速色谱（0.1-5/10bars）或中压制备色谱（MPLC，5/10-50bars）。将闪式制备色谱结合蒸发光散射与亲水色谱技术（MPLC-ELSD）运用于在线监测低聚糖单体的分离，具有高自动化、高分辨率、高产量与安全性等优点。

薏苡仁又称薏米或薏仁，为禾本科植物薏苡的干燥成熟种仁，原产于南亚，我国33°N以南的大部分地区都有种植，以福建、河北、辽宁、江苏等地资源较丰富。薏苡仁为药食两用食品，除含有丰富的蛋白质、碳水化合物、脂肪、维生素以及矿物质外，还含有活性多糖、低聚糖、薏苡仁内酯、甾类化合物、薏苡醇等多种生物活性物质。本发明以薏苡仁为材料，运用UMAE技术结合MPLC，建立了一种快速提取分离薏苡仁低聚糖单体的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速大量提取分离薏苡仁低聚糖单体的方法，该方法运用超声波-微波协同作用实现薏苡仁低聚糖的快速提取，并运用MPLC分离技术实现低聚糖单体的快速分离，其具有提取时间短、纯化效率高的特点，可填补国内薏苡仁低聚糖高效提取分离技术的空白，有助于拓展薏米深加工的途径，为薏苡仁低聚糖的开发利用提供基础，提升薏苡仁产业价值，同时也可为其他天然低聚糖的高效提取分离技术提供新的方向。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种快速大量提取分离薏苡仁低聚糖单体的方法，其是以新鲜薏苡仁为原料，经选料烘干、粉碎过筛、加水复配、水洗淀粉、超声波-微波协同提取、真空抽滤、醇析、离心浓缩、冷冻干燥、MPLC分离、MPLC二次分离的步骤，制得具有不同聚合度的薏苡仁低聚糖单体粉末。

该方法具体包括以下步骤：

1）选料烘干：选取颗粒饱满、无病虫害的新鲜薏苡仁，筛选去芯后放入鼓风干燥箱中，于50℃烘至水分含量为8~10%；

2）粉碎过筛：将干燥后的薏苡仁粉碎，过40目筛；

3）加水复配：取步骤2）所得薏苡仁粉末，按料液比1:3加入去离子水混匀进行复配；

4）水洗淀粉：将步骤3）所得复配料液过100目筛，再用薏苡仁粉末重量2~4倍的去离子水冲洗滤渣，然后合并滤液，于4℃条件下静置沉淀8h，离心去除淀粉沉淀，所得上清液与冲洗后的薏苡仁滤渣合并；

5）超声波-微波协同提取：在步骤4）所得上清液与滤渣中加入无水乙醇，至溶液中乙醇的体积含量为30~40%，然后将溶液与滤渣移至150mL异型玻璃三角瓶中，再放入超声波-微波组合催化合成仪中进行提取；

6）真空抽滤：提取结束后将提取液真空抽滤，弃去滤渣；

7）醇析：将步骤6）所得滤液于60~65℃下浓缩至原体积的1/5~1/4后加入浓缩液3倍体积、质量浓度为95%的乙醇，混匀后于4℃下静置12h；

8）离心浓缩：将步骤7）所得溶液离心后去除沉淀，上清液于55~65℃下真空旋转蒸发浓缩至原体积的1/3~2/5；

9）冷冻干燥：将浓缩液冷冻干燥，得薏苡仁低聚糖粗糖粉末；

10）MPLC分离：将步骤9）所得薏苡仁低聚糖粗糖粉末溶于去离子水中，配制成浓度为0.4~0.6g/mL的溶液，然后将溶液经0.22μm的微孔滤膜过滤后注入MPLC进行分离，根据保留时间针对性地收集各目标化合物，收集液分别于65℃下真空旋转蒸发回收溶剂后，经冷冻干燥得含特定化合物的冻干粉末；

11）MPLC二次分离：取步骤10）所得含特定化合物的冻干粉末，分别按步骤10）的操作和色谱条件进行二次进样，收集保留时间相同的各目标峰，经溶剂回收、冷冻干燥即得不同聚合度的薏苡仁低聚糖单体粉末。

超声波-微波协同提取的反应系统包括高精度接触式温度传感器、微波发生器和超声波发生器；其中，超声波发生器的探头直径为φ18mm，探头插入溶液的深度为1.2cm，超声波频率为25KHz；微波频率为2450MHz。

所述超声波-微波协同提取具体分三个阶段进行：第一阶段为超声波间歇提取，超声波功率为100~120W，超声波总处理时间为2.5~3.2min，其中，处理10~12s后停止15~20s，如此循环；第二、三阶段为微波-超声波共同提取，其中，第二阶段的微波功率为50~100W、超声功率为480~500W，提取时间为220~250s，第三阶段的微波功率为280~300W、超声功率为1000~1100W，并于67~70℃下控温辅助提取80~110s。

MPLC的分离系统包括中压特制玻璃柱（36×460mm）、色谱泵、DAD紫外全波长扫描器（检测波长范围为190-840nm）和FLASHELSD蒸发光散射检测器、自动馏分收集器和手动样品加载模块；

所述中压特制玻璃柱为ClaricepFlashHILIC亲水柱，其填料粒径为20-35μm，孔径100A，比表面320m²/g，碳含量5.0%；

所述FLASHELSD蒸发光散射检测器的检测条件为：吹扫氮气压力为2.5~3.5bar，漂移管温度85~95℃。

MPLC分离中上样体积为1mL，流动相为乙腈与水的二元混合体系，其流速为30~40mL/min，柱温25℃；

流动相比例变化的具体程序为：乙腈比例为98~100%保持15min，随后将乙腈比例降至88~90%保持10min，再降至72~75%保持10min，然后降至57~60%保持20min，再降至35~40%保持10min，最后降至12~15%保持6min，随后在12min内将乙腈比例提高至100%，保持40~55min至分离完成。

本发明方法与现有技术相比，具有以下优点：

（1）相比于单一的微波或超声波辅助提取的方法，本发明采用超声波-微波协同提取技术，可将超声波的震动传质与开放式的微波能量传递相结合，充分利用超声波的空穴效应、次级效应和微波的高能量传递，突破普通超声波或微波辅助提取技术的局限性，使其提取速度快、能耗小，有利于极性物质和热不稳定物质的提取，并可保持目标物质分子的完整性，且该方法提取工艺简单，操作时间短，提取效率得到极大地提高。

（2）本发明采用制备型中压液相色谱系统对薏苡仁低聚糖单体进行分离纯化，使薏苡仁低聚糖从提取液中转移至乙腈与水的混合溶液中，不仅可短时间内提高了目标物的浓度，同时由于乙腈溶液易于蒸发浓缩，减少了传统水提技术的能量消耗，并且通过DAD和FLASHELSD的实时在线监测，可使提取液中的杂质与目标物成分明确，所得不同聚合度的各薏苡仁低聚糖单体的纯度可达98%以上。

（3）传统糖分离的方法需要经过脱脂、脱蛋白、大孔吸附树脂吸附色素等前处理工艺，并需结合离子交换层析、凝胶过滤或排阻层析对各步骤收集的样品进行多次分离或纯化，其操作步骤繁琐，且终产品制备量很低。采用本发明工艺最多只需上样7次，所分离制备出的薏苡仁低聚糖单体即可基本满足结构分析的需求。对进一步研究薏苡仁低聚糖的构效关系，开发应用薏苡仁低聚糖产品具有重要意义。

（4）现有技术中通常将氨基键合相用于液相色谱中小分子碳水化合物的分析。但氨基键合硅胶需要较长的平衡时间，同时氨基柱中硅胶固定相性质较为活泼，使用时易造成不可逆吸附现象，导致谱图峰型恶化。本发明选用酰胺基团为主基团的亲水色谱，与氨基相比其活性较低，碱性较弱，且物质在酰胺基键合相上的保留受pH的影响较小，不易产生配体流失，具有较高的回收率；同时采用丙基酰胺的键合硅胶作为填料，此填料制造时使用正硅酸酯处理硅胶表面，减少了表面孤立硅羟基的数量，降低了硅胶表面硅羟基的活性，可有效避免极性化合物吸附过强的问题。在反相体系中此色谱柱材料与C₁₈材料具有相反的保留特性，而在正相体系中其较氨基的保留力较弱，从而可以洗脱或保留在正相条件下难以洗脱或者在反相条件下保留很弱的物质。且其在含水流动相中具有良好的稳定性，弥补了传统氨基糖柱在此方面的缺点。所采用的色谱柱填料成本较低，操作压力较小。

（5）针对薏苡仁中存在的各种成分的理化性质，本发明通过水洗淀粉、超声波-微波协同提取、醇析、MPLC分离、MPLC二次分离的顺序搭配，以及采用合适的工艺参数，可在有效去除淀粉、多酚、蛋白质、色素等杂质，大量制备薏苡仁低聚糖粗糖的基础上，为MPLC大批量分离单体成分打下良好的基础。与此同时，采用UMAE与MPLC技术结合使用，可提高提取、分离和纯化的效果，缩短产品生产周期，节约生产成本。

（6）与传统热水浸提法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法对低聚糖的提取效率相比，采用本发明方法提取分离低聚糖，其得率分别提高了86.24%、27.21%和37.27%，时间分别缩短了22.24倍、10.53倍和2.36倍。

附图说明

图1为本发明实施例1中第一次MPLC分离的色谱图。

图2为本发明实施例1所得薏苡仁低聚糖单体P-CSO1的红外吸收光谱图。

图3为本发明实施例1所得薏苡仁低聚糖单体P-CSO2的红外吸收光谱图。

图4为本发明实施例1所得薏苡仁低聚糖单体P-CSO3的红外吸收光谱图。

图5为本发明实施实例1所得薏苡仁低聚糖单体P-CSO1的质谱分析图谱。

图6为本发明实施实例1所得薏苡仁低聚糖单体P-CSO2的质谱分析图谱。

图7为本发明实施实例1所得薏苡仁低聚糖单体P-CSO3的质谱分析图谱。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例中所用超声波-微波协同提取的反应系统包括高精度接触式温度传感器、微波发生器和超声波发生器；其中，超声波发生器的探头直径为φ18mm，探头插入溶液的深度为1.2cm，超声波频率为25KHz；微波频率为2450MHz。

实施例中所用MPLC的分离系统包括中压特制玻璃柱（36×460mm）、色谱泵、DAD紫外全波长扫描器（检测波长范围为190-840nm）和FLASHELSD蒸发光散射检测器、自动馏分收集器和手动样品加载模块；所用中压特制玻璃柱为ClaricepFlashHILIC亲水柱，其填料粒径为20-35μm，孔径100A，比表面320m²/g，碳含量5.0%。

实施例1

一种快速大量提取分离薏苡仁低聚糖单体的方法，其具体包括以下步骤：

1）选料烘干：选取颗粒饱满、无病虫害的新鲜薏苡仁，筛选去芯后放入鼓风干燥箱中，于50℃烘至水分含量为8%；

2）粉碎过筛：将干燥后的薏苡仁粉碎，过40目筛；

3）加水复配：取步骤2）所得薏苡仁粉末，按料液比1:3加入去离子水混匀进行复配；

4）水洗淀粉：将步骤3）所得复配料液过100目筛，再用薏苡仁粉末重量2倍的去离子水冲洗滤渣，然后合并滤液，于4℃条件下静置沉淀8h，离心去除淀粉沉淀，所得上清液与冲洗后的薏苡仁滤渣合并；

5）超声波-微波协同提取：在步骤4）所得上清液与滤渣中加入无水乙醇，至溶液中乙醇的体积含量为30%，然后将溶液与滤渣移至150mL异型玻璃三角瓶中，再放入超声波-微波组合催化合成仪中进行提取；

6）真空抽滤：提取结束后将提取液真空抽滤，弃去滤渣；

7）醇析：将步骤6）所得滤液于60℃下浓缩至原体积的1/5后加入浓缩液3倍体积、质量浓度为95%的乙醇，混匀后于4℃下静置12h；

8）离心浓缩：将步骤7）所得溶液离心后去除沉淀，上清液于55℃下真空旋转蒸发浓缩至原体积的1/3；

9）冷冻干燥：将浓缩液冷冻干燥，得薏苡仁低聚糖粗糖粉末；

10）MPLC分离：将步骤9）所得薏苡仁低聚糖粗糖粉末溶于去离子水中，配制成浓度为0.4g/mL的溶液，然后将溶液经0.22μm的微孔滤膜过滤后注入MPLC，利用ClaricepFlashHILIC亲水柱进行分离纯化，在线进行紫外和蒸发光散射（检测条件为：吹扫氮气压力为2.5bar，漂移管温度85℃）检测，并根据保留时间针对性地收集各目标化合物，收集液分别于65℃下真空旋转蒸发回收溶剂后，经冷冻干燥得含特定化合物的冻干粉末；

11）MPLC二次分离：取步骤10）所得含特定化合物的冻干粉末，分别按步骤10）的操作和色谱条件进行二次进样，收集保留时间相同的各目标峰，经溶剂回收、冷冻干燥即得不同聚合度的薏苡仁低聚糖单体粉末。

所述超声波-微波协同提取具体分三个阶段进行：第一阶段为超声波间歇提取，超声波功率为100W，超声波总处理时间为2.5min，其中，处理10s后间隔15s，如此循环；第二、三阶段为微波-超声波共同提取，其中，第二阶段的微波功率为50W、超声功率为480W，提取时间为220s，第三阶段的微波功率为280W、超声功率为1000W，并于67℃下控温辅助提取80s。

MPLC分离中上样体积为1mL，流动相为乙腈与水的二元混合体系，其流速为30mL/min，柱温25℃；流动相比例变化的具体程序为：乙腈比例为98%保持15min，随后将乙腈比例降至88%保持10min，再降至72%保持10min，然后降至57%保持20min，再降至35%保持10min，最后降至12%保持6min，随后在12min内将乙腈比例提高至100%，保持40min至分离完成。

实施例2

一种快速大量提取分离薏苡仁低聚糖单体的方法，其具体包括以下步骤：

1）选料烘干：选取颗粒饱满、无病虫害的新鲜薏苡仁，筛选去芯后放入鼓风干燥箱中，于50℃烘至水分含量为9%；

2）粉碎过筛：将干燥后的薏苡仁粉碎，过40目筛；

3）加水复配：取步骤2）所得薏苡仁粉末，按料液比1:3加入去离子水混匀进行复配；

4）水洗淀粉：将步骤3）所得复配料液过100目筛，再用薏苡仁粉末重量3倍的去离子水冲洗滤渣，然后合并滤液，于4℃条件下静置沉淀8h，离心去除淀粉沉淀，所得上清液与冲洗后的薏苡仁滤渣合并；

5）超声波-微波协同提取：在步骤4）所得上清液与滤渣中加入无水乙醇，至溶液中乙醇的体积含量为35%，然后将溶液与滤渣移至150mL异型玻璃三角瓶中，再放入超声波-微波组合催化合成仪中进行提取；

6）真空抽滤：提取结束后将提取液真空抽滤，弃去滤渣；

7）醇析：将步骤6）所得滤液于63℃下浓缩至原体积的2/9后加入浓缩液3倍体积、质量浓度为95%的乙醇，混匀后于4℃下静置12h；

8）离心浓缩：将步骤7）所得溶液离心后去除沉淀，上清液于60℃下真空旋转蒸发浓缩至原体积的0.36倍；

9）冷冻干燥：将浓缩液冷冻干燥，得薏苡仁低聚糖粗糖粉末；

10）MPLC分离：将步骤9）所得薏苡仁低聚糖粗糖粉末溶于去离子水中，配制成浓度为0.5g/mL的溶液，然后将溶液经0.22μm的微孔滤膜过滤后注入MPLC，利用ClaricepFlashHILIC亲水柱进行分离纯化，在线进行紫外和蒸发光散射（检测条件为：吹扫氮气压力为3.0bar，漂移管温度90℃）检测，并根据保留时间针对性地收集各目标化合物，收集液分别于65℃下真空旋转蒸发回收溶剂后，经冷冻干燥得含特定化合物的冻干粉末；

11）MPLC二次分离：取步骤10）所得含特定化合物的冻干粉末，分别按步骤10）的操作和色谱条件进行二次进样，收集保留时间相同的各目标峰，经溶剂回收、冷冻干燥即得不同聚合度的薏苡仁低聚糖单体粉末。

所述超声波-微波协同提取具体分三个阶段进行：第一阶段为超声波间歇提取，超声波功率为110W，超声波总处理时间为2.85min，其中，处理11s后间隔18s，如此循环；第二、三阶段为微波-超声波共同提取，其中，第二阶段的微波功率为75W、超声功率为490W，提取时间为235s，第三阶段的微波功率为290W、超声功率为1050W，并于68℃下控温辅助提取95s。

MPLC分离中上样体积为1mL，流动相为乙腈与水的二元混合体系，其流速为35mL/min，柱温25℃；流动相比例变化的具体程序为：乙腈比例为99%保持15min，随后将乙腈比例降至89%保持10min，再降至73%保持10min，然后降至58%保持20min，再降至38%保持10min，最后降至14%保持6min，随后在12min内将乙腈比例提高至100%，保持48min至分离完成。

实施例3

一种快速大量提取分离薏苡仁低聚糖单体的方法，其具体包括以下步骤：

1）选料烘干：选取颗粒饱满、无病虫害的新鲜薏苡仁，筛选去芯后放入鼓风干燥箱中，于50℃烘至水分含量为10%；

2）粉碎过筛：将干燥后的薏苡仁粉碎，过40目筛；

3）加水复配：取步骤2）所得薏苡仁粉末，按料液比1:3加入去离子水混匀进行复配；

4）水洗淀粉：将步骤3）所得复配料液过100目筛，再用薏苡仁粉末重量4倍的去离子水冲洗滤渣，然后合并滤液，于4℃条件下静置沉淀8h，离心去除淀粉沉淀，所得上清液与冲洗后的薏苡仁滤渣合并；

5）超声波-微波协同提取：在步骤4）所得上清液与滤渣中加入无水乙醇，至溶液中乙醇的体积含量为40%，然后将溶液与滤渣移至150mL异型玻璃三角瓶中，再放入超声波-微波组合催化合成仪中进行提取；

6）真空抽滤：提取结束后将提取液真空抽滤，弃去滤渣；

7）醇析：将步骤6）所得滤液于65℃下浓缩至原体积的1/4后加入浓缩液3倍体积、质量浓度为95%的乙醇，混匀后于4℃下静置12h；

8）离心浓缩：将步骤7）所得溶液离心后去除沉淀，上清液于65℃下真空旋转蒸发浓缩至原体积的2/5；

9）冷冻干燥：将浓缩液冷冻干燥，得薏苡仁低聚糖粗糖粉末；

10）MPLC分离：将步骤9）所得薏苡仁低聚糖粗糖粉末溶于去离子水中，配制成浓度为0.6g/mL的溶液，然后将溶液经0.22μm的微孔滤膜过滤后注入MPLC，利用ClaricepFlashHILIC亲水柱进行分离纯化，在线进行紫外和蒸发光散射（检测条件为：吹扫氮气压力为3.5bar，漂移管温度95℃）检测，并根据保留时间针对性地收集各目标化合物，收集液分别于65℃下真空旋转蒸发回收溶剂后，经冷冻干燥得含特定化合物的冻干粉末；

11）MPLC二次分离：取步骤10）所得含特定化合物的冻干粉末，分别按步骤10）的操作和色谱条件进行二次进样，收集保留时间相同的各目标峰，经溶剂回收、冷冻干燥即得不同聚合度的薏苡仁低聚糖单体粉末。

所述超声波-微波协同提取具体分三个阶段进行：第一阶段为超声波间歇提取，超声波功率为120W，超声波总处理时间为3.2min，其中，处理12s后间隔20s，如此循环；第二、三阶段为微波-超声波共同提取，其中，第二阶段的微波功率为100W、超声功率为500W，提取时间为250s，第三阶段的微波功率为300W、超声功率为1100W，并于70℃下控温辅助提取110s。

MPLC分离中上样体积为1mL，流动相为乙腈与水的二元混合体系，其流速为40mL/min，柱温25℃；流动相比例变化的具体程序为：乙腈比例为100%保持15min，随后将乙腈比例降至90%保持10min，再降至75%保持10min，然后降至60%保持20min，再降至40%保持10min，最后降至15%保持6min，随后在12min内将乙腈比例提高至100%，保持55min至分离完成。

实施例4

图1为实施例1中第一次MPLC分离的色谱图，将所分离出的峰1、峰2和峰3作为目标产物收集后进行二次MPLC分离，再将相同保留时间的峰1、峰2和峰3分别再次收集后进行回收溶剂、冷冻干燥得到三种低聚糖单体粉末，分别标为P-CSO1、P-CSO2和P-CSO3。

同时，对于HILIC色谱，流动相中水的比例在0→100%增大的过程中，由于存在混合机制，溶质的保留将呈现“U”型曲线。有机溶剂与水混合作为流动相时，溶剂分子间存在包括氢键作用、偶极作用在内的复杂作用力。当流动相中水的比例由0增大到50%(v/v)时，色谱柱体现出HILIC保留的典型特征，水为强洗脱剂；当水的比例继续增大至50%后，溶质保留反而呈现增大的趋势，水变为弱洗脱剂，溶质保留转变为反相色谱保留机理，不利于糖化合物的保留。因此，确定流动相中水的变化比例为15-100%作为分离过程中的溶剂比例变化范围。

实施例5

称取所分离的P-CSO1、P-CSO2和P-CSO3低聚糖单体粉末各lmg，与200mgKBr粉末混合并在玛瑙研钵中研磨均匀，经压片机压成薄片后上机测定，红外光谱扫描范围设定为4000-400cm^-1，所得红外吸收光谱图分别见图2、图3、图4。

如图2可见，P-CSO1在3600-3200cm^-1处的3419cm^-1吸收峰为低聚糖中O-H的伸缩振动吸收峰。3000-2800cm^-1处的2927cm^-1吸收峰为低聚糖中饱和C-H的伸缩振动吸收峰。在1870-1540cm^-1处的1630cm^-1吸收峰为低聚糖中C=O的伸缩振动吸收峰。1420-1200cm^-1之间的1419cm^-1、1357cm^-1吸收峰为C-H的变角振动吸收峰。在1200-1000cm^-1之间有吸收峰，其中1146cm^-1吸收峰为低聚糖中C-O的伸缩振动吸收峰。1042cm^-1是C-O-C的伸缩振动吸收峰。1000-700cm^-1之间的771cm^-1吸收峰可能为吡喃糖伸缩振动峰。

如图3可见，P-CSO2在3600-3200cm^-1处的3441cm^-1吸收峰为低聚糖中O-H的伸缩振动吸收峰。3000-2800cm^-1处的2928cm^-1吸收峰为低聚糖中饱和C-H的伸缩振动吸收峰。在1870-1540cm^-1处的1637cm^-1吸收峰、1420-1300cm^-1处的1410cm^-1、1374cm^-1吸收峰为C-H的变角振动吸收峰。在1200-1000cm^-1之间有吸收峰，其中1153cm^-1、1080cm^-1、1027cm^-1吸收峰为吡喃糖环的醚键(C-O-C)伸缩振动和羟基(-C-O-H)的吸收峰。1000-700cm^-1之间的931cm^-1吸收峰为糖环非对称环伸缩振动吸收峰，851cm^-1的吸收峰为α-端基差向异构的C-H变角振动吸收峰，764cm^-1的吸收峰为糖环对称环伸缩振动吸收峰。

如图4可见，P-CSO3在3600-3200cm^-1范围内的3432cm^-1吸收峰为低聚糖中O-H的伸缩振动吸收峰。3000-2800cm^-1处的2929cm^-1吸收峰为低聚糖中饱和C-H的伸缩振动吸收峰。在1870-1540cm^-1处的1628cm^-1吸收峰为低聚糖中C=O的伸缩振动吸收峰。1420-1200cm^-1之间的1408cm^-1、1385cm^-1吸收峰为低聚糖糖环中甲基或亚甲基中C-H的变角振动和CH₂变角振动。在1200-1000cm^-1之间有吸收峰，其1052cm^-1吸收峰为低聚糖中O-H伸缩振动吸收峰。1000-700cm^-1之间的784cm^-1可能为吡喃糖伸缩振动峰。

可见，P-CSO3、P-CSO2和P-CSO1均具有糖类物质的红外光谱吸收特征，且光谱表明三种单体均纯度较高。

实施例6

取适量干燥的P-CSO1、P-CSO2和P-CSO3低聚糖单体粉末，分别配制成一定浓度的溶液，取该溶液1mL，经0.22μm微孔滤膜过滤，注入LC/Q-TOF-MS系统分析。色谱条件为：进样量20μL；流动相：蒸馏水。质谱采用ESI电喷雾离子源，正离子电离模式；质量扫描范围：m/z50～1000Da；干燥气：氮气；气体温度：350℃；干燥气流速：10L/min；喷雾气压：40psi；毛细管电压：3.5kV；裂解电压：175V；锥孔电压：65V。其质谱分析图谱分别见图5、图6、图7。

如图5可见，P-CSO1在正离子模式下主要形成离子峰m/z365.1053和m/z381.0803，即离子峰形成加合离子[M+Na]⁺和[M+Ka]⁺，因此P-CSO1的相对分子量为342.1160。如图6可见，P-CSO2在正离子模式下主要形成离子峰m/z527.1610和m/z543.1593，即离子峰也形成加合离子[M+Na]⁺和[M+Ka]⁺，P-CSO3的分子量为504.1674。如图7可见，P-CSO3在正离子模式下主要形成离子峰m/z689.2115和m/z705.1851，即离子峰依然有加合离子[M+Na]⁺和[M+Ka]⁺，P-CSO3的分子量为666.2228。

由于薏苡仁低聚糖为中性低聚糖，不含其他基团，因此，组分P-CSO1、P-CSO2、P-CSO3的聚合度分别为2、3、4，二糖为薏苡仁低聚糖的主要成分。

本发明经适当转变可用于各种天然功能性低聚糖成分的快速提取分离制备。本发明对于拓展薏苡仁深加工途径，具有巨大的市场潜力。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，其皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (6)

1.一种快速大量提取分离薏苡仁低聚糖单体的方法，其特征在于：以新鲜薏苡仁为原料，经选料烘干、粉碎过筛、加水复配、水洗淀粉、超声波-微波协同提取、真空抽滤、醇析、离心浓缩、冷冻干燥、MPLC分离、MPLC二次分离的步骤，制得具有不同聚合度的薏苡仁低聚糖单体粉末。

2.根据权利要求1所述快速大量提取分离薏苡仁低聚糖单体的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

1）选料烘干：选取颗粒饱满、无病虫害的新鲜薏苡仁，筛选去芯后于50℃下烘至水分含量为8~10%；

2）粉碎过筛：将干燥后的薏苡仁粉碎，过40目筛；

3）加水复配：取步骤2）所得薏苡仁粉末，按料液比1:3加入去离子水混匀进行复配；

4）水洗淀粉：将步骤3）所得复配料液过100目筛，再用薏苡仁粉末重量2~4倍的去离子水冲洗滤渣，然后合并滤液，于4℃条件下静置沉淀8h，离心去除淀粉沉淀，所得上清液与冲洗后的薏苡仁滤渣合并；

5）超声波-微波协同提取：在步骤4）所得上清液与滤渣中加入无水乙醇，至溶液中乙醇的体积含量为30~40%，然后进行超声波-微波协同提取；

6）真空抽滤：提取结束后将提取液真空抽滤，弃去滤渣；

7）醇析：将步骤6）所得滤液于60~65℃下浓缩至原体积的1/5~1/4后，加入浓缩液3倍体积、质量浓度为95%的乙醇，混匀后于4℃下静置12h；

8）离心浓缩：将步骤7）所得溶液离心后去除沉淀，上清液于55~65℃下浓缩至原体积的1/3~2/5；

9）冷冻干燥：将浓缩液冷冻干燥，得薏苡仁低聚糖粗糖粉末；

10）MPLC分离：将步骤9）所得薏苡仁低聚糖粗糖粉末溶于去离子水中，配制成浓度为0.4~0.6g/mL的溶液，然后将溶液经0.22μm的微孔滤膜过滤后注入MPLC进行分离，根据保留时间针对性地收集各目标化合物，收集液分别于65℃下回收溶剂后，经冷冻干燥得含特定化合物的冻干粉末；

11）MPLC二次分离：取步骤10）所得含特定化合物的冻干粉末，分别按步骤10）的操作和色谱条件进行二次进样，收集保留时间相同的各目标峰，经溶剂回收、冷冻干燥即得不同聚合度的薏苡仁低聚糖单体粉末。

3.根据权利要求2所述快速大量提取分离薏苡仁低聚糖单体的方法，其特征在于：超声波-微波协同提取的反应系统包括高精度接触式温度传感器、微波发生器和超声波发生器；

其中，超声波发生器的探头直径为φ18mm，探头插入溶液的深度为1.2cm，超声波频率为25KHz；微波频率为2450MHz。

4.根据权利要求2所述快速大量提取分离薏苡仁低聚糖单体的方法，其特征在于：所述超声波-微波协同提取具体分三个阶段进行：第一阶段为超声波间歇提取，超声波功率为100~120W，超声波总处理时间为2.5~3.2min，其中，处理10~12s后停止15~20s，如此循环；第二、三阶段为微波-超声波共同提取，其中，第二阶段的微波功率为50~100W、超声功率为480~500W，提取时间为220~250s，第三阶段的微波功率为280~300W、超声功率为1000~1100W，并于67~70℃下控温辅助提取80~110s。

5.根据权利要求2所述快速大量提取分离薏苡仁低聚糖单体的方法，其特征在于：MPLC的分离系统包括中压特制玻璃柱、色谱泵、DAD紫外全波长扫描器和FLASHELSD蒸发光散射检测器、自动馏分收集器和手动样品加载模块；

所述中压特制玻璃柱为ClaricepFlashHILIC亲水柱，其填料粒径为20-35μm，孔径100A，比表面320m²/g，碳含量5.0%；

所述FLASHELSD蒸发光散射检测器的检测条件为：吹扫氮气压力为2.5~3.5bar，漂移管温度85~95℃。

6.根据权利要求2所述快速大量提取分离薏苡仁低聚糖单体的方法，其特征在于：MPLC分离中上样体积为1mL，流动相为乙腈与水的二元混合体系，其流速为30~40mL/min，柱温25℃；

流动相比例变化的具体程序为：乙腈比例为98~100%保持15min，随后将乙腈比例降至88~90%保持10min，再降至72~75%保持10min，然后降至57~60%保持20min，再降至35~40%保持10min，最后降至12~15%保持6min，随后在12min内将乙腈比例提高至100%，保持40~55min至分离完成。