CN109627271A

CN109627271A - 一种快速从芍药茎叶中提取纯化芍药苷的工艺

Info

Publication number: CN109627271A
Application number: CN201811513993.7A
Authority: CN
Inventors: 张利; 吴超; 吴一超; 姜媛媛; 李杨梅; 张绍奇; 王龙; 余燕; 周劲
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2018-12-11
Filing date: 2018-12-11
Publication date: 2019-04-16

Abstract

本发明涉及一种快速从芍药茎叶中提取纯化芍药苷的工艺，具体步骤如下：a、在芍药倒苗前收割茎叶，切短，直接粉碎；b、取芍药茎叶粉末乙醇微波辅助提取；c、将步骤b的提取液减压浓缩回收乙醇，浸膏硅胶分散，经脱色，萃取，减压蒸干回收乙醇，得芍药苷粗提物；d、将10mg/mL芍药苷粗提物上大孔树脂吸附柱，水洗除杂后，用20％乙醇洗脱，收集洗脱液、浓缩、干燥，既得芍药苷。该快速从芍药茎叶中提取纯化芍药苷的工艺使用提取原料为种植中丢弃的芍药茎叶，原料成本低、来源广泛，芍药苷含量高，可实现废弃物资源化，所使用微波提取技术方便快速，芍药苷提取率高，节能环保；通过大孔树脂纯化得到的芍药苷纯度高，纯化方便、成本低，适于工业化生产。

Description

一种快速从芍药茎叶中提取纯化芍药苷的工艺

技术领域

本发明涉及于芍药苷生产加工技术领域，具体为一种快速从芍药茎叶中提取纯化芍药苷的工艺。

背景技术

芍药(Paeonia lactiflora Pall.)为芍药科(Paeoniaceae)芍药属 (PaeoniaL.)多年生草本植物，以根入药，是大宗名贵中药材，其药用历史悠久，药用价值高，现代药理研究表明，芍药的主要活性成分为芍药苷，具有抗炎、抗溃疡、抗血栓及免疫调节等药理作用。其中，白芍在对病毒性肝炎、类风湿性关节炎和妇科类疾病的显著疗效，以白芍为主要原料的中成药(逍遥散、小青龙颗粒、白芍总苷胶囊、补肺活血胶囊等)的需求与日俱增，白芍的市场前景越来越广阔。

芍药除根作为白芍和赤芍来源药用外，芍药地上部分仍有较高的利用价值，但在传统种植中，芍药的茎叶都是作为废料丢弃，造成巨大资源浪费。目前芍药苷产品主要是用芍药根提取，芍药根成本高，且与药用白芍、赤芍饮片生产争抢原料。研究中发现在中江芍药干燥的茎叶中芍药苷含量高达 2.5％，可用芍药茎叶生产芍药苷，实现芍药茎叶的资源化，降低芍药苷的成本。

微波辅助提取(microwave assisted extraction，MAE)，微波是通过作用到极性或是具有偶极的分子上，而产生振动和热效应，从而达到提取的目的。由于微波提取具备设备简单、选择性强、提取效率高和节能环保等优点，近年来该技术受到广泛的认同和关注，被广泛应用于天然产物、食品和环境样品的分析与提取，在此工艺中提取溶剂70％乙醇，微波温度为61℃，液料比为22mL·g^-1，提取时间为9.5min，此条件下，平均提取率为2.81±0.12％，该工艺提取效率高、时间短。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种高效节能的芍药茎叶提取制备芍药苷的方法。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种快速从芍药茎叶中提取纯化芍药苷的工艺，步骤如下：

a、在芍药倒苗前收割茎叶，切短，直接粉碎用于提取或晒干后粉碎用于提取；

b、取芍药茎叶粉末，按液料比22(mL/g)加70％乙醇，投入微波反应器中，微波加热至61℃，提取9.5min，冷却，抽滤得提取液；

c、将步骤b的提取液减压浓缩回收乙醇，硅胶分散，经石油醚脱色，乙醇萃取，减压蒸干回收乙醇，得芍药苷粗提物；

d、将10mg/mL芍药苷粗提物上大孔树脂吸附柱，水洗除杂后，用20％乙醇洗脱，收集洗脱液、浓缩、干燥，既得芍药苷。

优选的，提取剂为70％乙醇，液料比为22mL/g，微波温度为61℃，提取时间为9.5min。

优选的，大孔树脂吸附柱为AB-8，上样量10mg/mL芍药苷粗提物10倍柱体积；洗脱液为20％乙醇，洗脱14倍柱体积。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：该从芍药茎叶中提取纯化芍药苷的工艺高效快速；通过运用微波辅助提取，而微波辅助提取微波是通过作用到极性或是具有偶极的分子上，而产生振动和热效应，从而达到提取的目的微波提取具备设备简单、选择性强、提取效率高和节能环保等优点，另外使用提取原料为种植中丢弃的芍药茎叶，原料成本低、来源广泛，芍药苷含量高，可实现废弃物资源化，所使用微波提取技术方便快速，芍药苷提取率高，节能环保；通过大孔树脂纯化得到的芍药苷纯度高，纯化方便、成本低，适于工业化生产，应用前景良好。

附图说明

图1为本发明一种快速从芍药茎叶中提取纯化芍药苷的工艺的微波辅助提取茎叶中芍药苷单因素试验设计示意图；

图2为本发明一种快速从芍药茎叶中提取纯化芍药苷的工艺的响应面优化设计因素及水平示意图；

图3为本发明一种快速从芍药茎叶中提取纯化芍药苷的工艺的微波辅助提取茎叶芍药苷单因素试验结果示意图；

图4为本发明一种快速从芍药茎叶中提取纯化芍药苷的工艺的微波辅助提取试验设计及试验结果示意图；

图5为本发明一种快速从芍药茎叶中提取纯化芍药苷的工艺的 Box-Behnken回归模型方差分析示意图；

图6为本发明一种快速从芍药茎叶中提取纯化芍药苷的工艺的芍药苷的动态吸附曲线示意图；

图7为本发明一种快速从芍药茎叶中提取纯化芍药苷的工艺的芍药苷的芍药苷的动态洗脱曲线示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-7，本发明提供一种技术方案：一种快速从芍药茎叶中提取纯化芍药苷的工艺，步骤如下：

b、取芍药茎叶粉末，按液料比22(mL/g)加70％乙醇，投入微波反应器中，微波加热至61℃，提取9.5min，冷却，抽滤得提取液；提取剂为70％乙醇，液料比为22mL/g，微波温度为61℃，提取时间为9.5min；

d、将10mg/mL芍药苷粗提物上大孔树脂吸附柱，水洗除杂后，用20％乙醇洗脱，收集洗脱液、浓缩、干燥，既得芍药苷；大孔树脂吸附柱为AB-8，上样量10mg/mL芍药苷粗提物10倍柱体积；洗脱液为20％乙醇，洗脱14倍柱体积。

进一步的，仪器试剂：Agilent Technologies 1260InfinityⅡ高效液相色谱仪(美国Agilent Technologies)，包括G7129A自动进样器，G7111B 四元泵，G7116A MCT高容量柱温箱，G7115A DAD检测器；BT 124S电子天平； MAS-Ⅰ型常压微波辅助合成/萃取反应仪；RE52CS-1旋转蒸发仪；岛津 InertSustain C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；芍药苷标准品购自成都曼思特生物科技有限公司，纯度＞98％，HPLC。无水乙醇、石油醚分析纯， AB-8型大孔吸附树脂；芍药茎叶干燥粉碎后过40目筛。

进一步的，芍药苷HPLC测定色谱方法，芍药苷含量测定HPLC色谱条件：岛津InertSustain C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，流动相：A：0.1％磷酸溶液，B：乙腈，洗脱梯度：0～5min，10％～15％B；5～20min，15～20％B； 20～25min，20％～90％B；25～30min，90％B，后运行5min。检测波长230nm，柱温40℃，进样量10μL，流速1.0mL/min。芍药苷标准曲线： Y＝13550X+45.417，R²＝0.9998。

进一步的，单因素优化准确称取适量芍药茎叶粉于圆底烧瓶中，在圆底烧瓶中加入70％乙醇，置于微波提取器中，在60℃下提取15min。提取完成后，冷却至室温，提取液经0.22μm微孔滤头过滤，取续滤液0.1mL稀释至2mL，进行HPLC分析；微波提取工艺的单因素优化：以芍药苷提取率为评价指标，通过单因素试验考察微波提取温度、液料比、提取时间对芍药茎叶中芍药苷提取率的影响。具体试验设计按照图1中的表格，所有试验重复3 次，结果取平均值。

进一步的，响应面优化试验在微波辅助提取工艺的单因素试验基础上，优化提取温度、液料比、提取时间，筛选最佳微波辅助提取芍药茎叶中芍药苷工艺参数，设计3因素3水平BBD试验，试验因素及水平见图2中表格。

进一步的，芍药苷的分离纯化取AB-8型大孔树脂加无水乙醇溶胀24h，用无水乙醇洗至乙醇加等体积超纯水不出现白色混浊为止，再用水以洗至无醇味备用。

进一步的，上柱样品液的制备称取100g芍药茎叶粉末，加2.2L 70％乙醇，61℃微波提取9.5min后进行抽滤，滤液浓缩蒸干。按照1∶2的比例加入硅胶，加入适量石油醚抽提4次，脱色至石油醚呈浅绿色，减压蒸干硅胶中的石油醚，再用无水乙醇回流抽提4次，合并乙醇提取液，减压蒸干，得芍药茎叶芍药苷粗提物。称取粗提物4.00g至500mL锥形瓶中，加入400mL超纯水超声溶解，0.45μm微孔滤膜过滤，得芍药苷粗提液(10 mg/mL)，其中芍药苷含量1.072mg/mL。

进一步的，动态吸附考察取处理好的AB-8型大孔吸附树脂20mL，湿法装入层析柱(15mm×50cm)，自上而下加入芍药苷粗提液(10mg/mL)于层析柱中，控制流速为3BV/h，流出液每20mL收集1流份，测定每流份中芍药苷的峰面积。以芍药苷峰面积为纵坐标，以流份编号为横坐标，绘制动态吸附曲线。

进一步的，洗脱曲线考察取处理好的AB-8型大孔吸附树脂20mL，湿法装入层析柱，取芍药苷粗提液(10mg/mL)以3BV/h流速上样10个柱体积，先用3BV超纯水洗脱除去水溶性杂质，再用20％乙醇洗脱，收集20％乙醇洗脱液，每20mL收集1流份，测定每流份中的芍芍药苷峰面积。以流份编号为横坐标，以芍药苷峰面积为纵坐标，绘制洗脱曲线。

进一步的，单因素试验结果；

1、提取温度的优化：温度对芍药苷提取率的影响见图3A，当提取温度为 60℃时，芍药苷提取率最大；微波温度＜60℃时，随着温度升高，分子热运动增大，溶剂与芍药苷的碰撞次数增多，增加芍药苷的溶出量，提高芍药苷提取率微波温度＞60℃时，温度增高致芍药苷分解，所以选择最佳微波提取温度为60℃。

2、液料比的优化：液料比对芍药苷提取效果的影响见图3B。当液料比从10～20mL/g过程中，随着提取溶剂体积不断增大，芍药茎叶粉末与溶剂的接触面亦不断增大，促进提取率增加。当液料比大于20mL·g-¹，芍药苷峰面积的增势变缓，提取趋于完全；综合考虑提取经济效益，故最优液料比为20mL ·g-¹。

3、提取时间的优化：提取时间对芍药苷提取效果的影响见图3C。9min 时芍药苷峰面积最大，但9min后，随着提取时间的延长，微波作用时间增加，使得芍药苷可能因微波作用时间过长而分解，芍药苷峰面积下降，提取效率降低，故最优微波时间为9min。

进一步的，响应面优化试验结果；采用Design Expert 8.0软件对试验进行设计，响应面法设计及结果见图4中表格，回归分析结果见图5中表格。芍药苷提取率对提取温度、液料比、提取时间的二次多项回归方程为：芍药苷提取率(％)＝2.81+0.054A+0.043B+0.019C+0.01AB+0.017AC+ 0.025BC-0.26²-0.16B²-0.073C²；由表4可知回归模型P值＜0.01，表明该预测模型拟合程度良好；失拟项的P值0.1549＞0.05，说明失拟项不显著；相关系数R²＝0.9806，证明该模型能较为准确地分析影响因素和响应值之间的关系；提取温度对芍药苷的提取率的影响极为显著(P＜0.01)，液料比对芍药苷的提取率的影响显著(P＜0.05)，提取时间对芍药苷的提取率的影响不显著(P＞0.05)，通过微波辅助提取芍药茎叶中芍药苷的等高线图和响应面3D图中可看出，响应面的曲线皆平缓、等高线皆接近圆形，表明提取温度、液料比、提取时间相互之间的交互作用都不显著。同时从图5中表格中也可以表明提取温度、液料比、提取时间相互之间的交互作用都不显著(AB、 AC、BC的P＞0.05)。

进一步的，药苷分离纯化；

1、动态吸附曲线动态吸附曲线结果见图6；从第11流份(每流份体积为 1BV)开始芍药苷的峰面积突然增大，表明此时大孔吸附树脂已达到最大吸附量并开始泄漏，故可确定芍药茎叶提取液的最大上样量为10BV，芍药苷上样浓度为1.072mg/mL，最后计算吸附量为214.4mg，比吸附量为10.72mg/g。

2、洗脱曲线；芍药苷洗脱曲线见图7，由图可知：14BV 20％乙醇洗脱后，洗脱液中芍药苷不再明显减少，故确定洗脱剂用量14BV。合并前14BV 20％乙醇洗脱液，测得将此洗脱液中芍药苷总含量为180.37mg，即动态洗脱率为 84.13％。回收乙醇并真空干燥至恒重，HPLC测得芍药苷的纯度为67.19％(干浸膏记)。

通过对芍药茎叶微波提取的芍药苷粗提物AB-8大孔树脂吸附和解析研究，获得最佳大孔树脂纯化工艺为：浓度为10mg/mL芍药苷提取物的最大上样量为10BV，通过AB-8大孔吸附树脂柱的流速为3BV/h，用3BV超纯水洗脱除去水溶性杂质，再用14BV 20％乙醇洗脱，收集20％乙醇洗脱液，测得芍药苷纯度为67.19％；后续通过硅胶柱层析分离，乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，收集芍药苷洗脱馏分，合并芍药苷馏分，50℃减压浓缩回收溶剂，可获得纯度≥95％的芍药苷。

尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种快速从芍药茎叶中提取纯化芍药苷的工艺，其特征在于：步骤如下：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：提取剂为70％乙醇，液料比为22mL/g，微波温度为61℃，提取时间为9.5min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：大孔树脂吸附柱为AB-8，上样量10mg/mL芍药苷粗提物10倍柱体积；洗脱液为20％乙醇，洗脱14倍柱体积。