CN104523792A - 一种富含强心苷的马利筋乳汁提取物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种富含强心苷的马利筋乳汁提取物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于天然药物化学领域，公开了一种富含强心苷的马利筋乳汁提取物及其制备方法与应用。所述提取物的制备方法为：(1)将马利筋的乳汁用水稀释，得到稀释液；向稀释液中加入有机溶剂进行萃取，收集萃取后的有机层；再向剩下的水层中加入有机溶剂进行萃取，再次收集有机层，如此循环萃取2～4次，弃去水层，将有机层合并，得到马利筋乳汁的强心苷提取液；(2)将马利筋乳汁的强心苷提取液进行减压浓缩至恒重，得到富含强心苷的马利筋乳汁提取物。本发明的富含强心苷的马利筋乳汁提取物具有良好的抗肿瘤活性，对正常细胞的毒性低；该提取物中强心苷的种类多，含量丰富。本发明的制备方法简单、成本低、提取率高且抗肿瘤的选择性高。

Description

一种富含强心苷的马利筋乳汁提取物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于天然药物化学领域，特别涉及一种富含强心苷的马利筋乳汁提取物及其制备方法以及在抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
据世界卫生组织2013年2月1日发表的调查报告显示，2008年全球死于癌症的人数达760万，每年约有1300万新增癌症患者，其中近60％为肺癌、胃癌、乳腺癌、前列性癌、结肠直肠癌、口腔癌、肝癌、宫颈癌及食管癌，是仅次于心血管疾病的第二大死因。目前，癌症的治疗有手术、放化疗、介入等多种手段，但死亡率依然居高不下。世界各国的专家学者都在积极研究寻找治疗各种癌症的方法和药物。中药和天然药物对于治疗癌症等疑难病症有着悠久的历史，近年来，药用植物中的活性成分及其衍生物，如长春新碱、羟基喜树碱、紫杉醇、多西紫杉醇等已经作为一线抗癌药物被广泛使用，因此从药用植物中寻找高效的抗癌药物已经成为了国内外抗癌药物研究的重点。
马利筋(Asclepias curassavica L.)为萝藦科(Asclepiadaceae)马利筋属一年或多年生草本植物。原产于热带美洲地区，喜欢温暖多湿的环境。清代《植物名实图考》(1848年)就已有记载，传入我国至少已有160多年的历史，如今在我国热带、亚热带地区已广泛栽种。据《中华本草》傣药篇中记载，味甘，性凉，有小毒，主要功效为调经止血，清火退热，消肿止痛等。
近年来，国内外学者对马利筋的化学成分进行了深入系统的研究，已从其中分离鉴定数十种强心苷类成分，并进行了体外抗肿瘤细胞增殖实验，证明该类化合物对肺癌细胞A549、乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231、肝癌细胞HepG2以及前列腺癌细胞DU145都有很强的抗肿瘤活性(Chemical&Pharmaceutical Bulletin，1991,39,2709；Journal of natural products，2005,68,1494；Medicinal Chemistry Letters，2009,19,1956；Organic&biomolecular  chemistry，2014，DOI:10.1039/C4OB01545B.)，但这些研究均是分离马利筋全草中的单体化合物，之后再进行活性筛选。马利筋全草中的强心甾较多，单一化合物的含量较低(分离收率均低于1％，Organic&biomolecular chemistry，2014，DOI:10.1039/C4OB01545B.)，因此，从马利筋全草中分离单体化合物再开发成抗肿瘤药物较为费时费力。并且，这些单体化合物无选择性，对多种肿瘤细胞的抑制活性相似。
马利筋也有其它方面的用途。中国发明专利(公开号101603209)公开了“一种纺纱用马利筋纤维棉条及其加工方法和设备”涉及纺纱用马利筋纤维棉条及其加工方法和设备；另一发明专利申请(公开号104082347A)公开了“一种具有杀虫作用的植物提取物”涉及一种效果显著、环境友好的新型植物源杀虫剂，该杀虫剂系以马利筋干燥全草为原料，用乙醇加热回流提取制得。这些文献均是以马利筋为研究对象，但是未涉及马利筋提取物在抗肿瘤药物中的应用。
发明内容
为了克服现有技术中的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种富含强心苷的马利筋乳汁提取物的制备方法。该制备方法以马利筋的乳汁为原料。通过对马利筋各组织部位化学成分的研究发现，乳汁中所含的强心苷不仅种类特别丰富，含量也非常大，几乎是叶中强心苷含量的一百倍。并且，乳汁中的总的强心苷对肿瘤细胞的毒性高，而对正常细胞的毒性低。从马利筋乳汁中可以获得高效低毒的抗肿瘤活性物质。
本发明的另一目的在于提供由上述制备方法得到的富含强心苷的马利筋乳汁提取物。
本发明的再一目的在于提供上述富含强心苷的马利筋乳汁提取物在抗肿瘤药物中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种富含强心苷的马利筋乳汁提取物的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将马利筋的乳汁用水稀释，得到稀释液；向稀释液中加入有机溶剂进行萃取，收集萃取后的有机层；再向剩下的水层中加入有机溶剂进行萃取，再次收集有机层，如此循环萃取2～4次，弃去水层，将有机层合并，得到马利筋 乳汁的强心苷提取液；
(2)将马利筋乳汁的强心苷提取液进行减压浓缩至恒重，得到白色浆状物，即为富含强心苷的马利筋乳汁提取物。
步骤(1)中所述有机溶剂为乙酸乙酯或正丁醇；所述马利筋的乳汁用水稀释中水的用量为乳汁体积的5～10倍。
步骤(1)中所述有机溶剂每次加入量为乳汁体积的3～5倍
步骤(2)中所述减压浓缩的温度为30～50℃。
所述富含强心苷的马利筋乳汁提取物中含有化合物1(calotropin)，化合物2(voruscharin)以及化合物3(uscharin)；所述化合物1在所述提取物中的质量百分含量为31～33％，所述化合物2在所述提取物中的质量百分含量为29～31％，所述化合物3在所述提取物中的质量百分含量为9～10％。
化合物1的结构式如下所示：
化合物2的结构式如下所示：
化合物3的结构式如下所示：
一种富含强心苷的马利筋乳汁提取物通过上述制备方法得到。
所述富含强心苷的马利筋乳汁在抗肿瘤药物中的应用，所述提取物具有很强的抑制肿瘤细胞增殖的活性。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：
(1)马利筋(Asclepias curassavica L.)是一种生活在热带美洲地区，温暖多湿环境灌木，在我国热带、亚热带地区已广泛栽种，易于得到；
(2)本发明获得的富含强心苷的马利筋乳汁提取物具有良好的抗肿瘤活性，且对正常细胞的毒性低；
(3)本发明获得的富含强心苷的马利筋乳汁提取物中强心苷的种类多，含量丰富；与强心苷单体相比，该提取物的制备方法操作简单方便、成本低。
(4)本发明与现有提取单体化合物相比，抗癌活性物质提取方便，操作简单，提取率高，成本低，并且抗肿瘤的选择性高。
附图说明
图1为实施例1制备的富含强心苷的马利筋乳汁提取物的HPLC色谱图，化合物1，2，3为指标成分化合物，化合物1为calotropin，化合物2为voruscharin，化合物3为uscharin；
图2为实施例1制备的富含强心苷的马利筋乳汁提取物中化合物1的ESI-MS质谱图；
图3为实施例1制备的富含强心苷的马利筋乳汁提取物中化合物2的ESI-MS质谱图；
图4为实施例1制备的富含强心苷的马利筋乳汁提取物中化合物3的ESI-MS质谱图；
图5是实施例1制备的富含强心苷的马利筋乳汁提取物抑制五种肿瘤细胞 增殖的活性图，其中：
图5A～图5F依次分别为不同浓度的马利筋乳汁提取物对前列腺癌细胞PC3、前列腺癌细胞DU145、人体乳腺癌细胞MDA-MB-231、乳腺癌细胞MCF-7、慢性粒细胞白血病细胞系K562以及正常细胞Vero增殖活性的影响。
具体实施方式
下面结合实施例以及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)一种富含强心苷的马利筋乳汁提取物的制备
A、取马利筋的乳汁1mL(干燥后的固形物为100mg)，用5mL蒸馏水稀释，得到稀释液，向稀释液中加入3mL正丁醇进行萃取，收集萃取后正丁醇层；再向剩下的水层中加入3mL正丁醇继续进行萃取，如此循环3次，弃去水层，将正丁醇层合并，得到正丁醇提取液9mL；
B、将正丁醇提取液用N-1100V-W型旋转蒸发仪于30℃进行减压浓缩至恒重，得到白色浆状物，为富含强心苷的马利筋乳汁提物(AC-1，20.5mg，提取率为20.5％)；
(2)对步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋乳汁提物进行分析
将步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋乳汁提物溶于甲醇，配成10mg/ml的溶液，用HPLC进行反相制备，具体制备条件是：C18反相半制备柱(5μm,9.4×250mm)，紫外检测波长为220nm，流速为3ml/min，梯度系统为：A:水，B:乙腈；0～60min,10％(v/v％)→40％(v/v％)的乙腈溶液；60～80min,40％(v/v％)→60％(v/v％)的乙腈；80～105min,60％(v/v％)→100％(v/v％)的乙腈溶液；分别于64.1min，78.3min，80.5min分钟处收集色谱峰(见图1)。用旋转蒸发仪对收集液进行减压浓缩(N-1100V-W型)，分别得到化合物1[calotropin]，化合物2[voruscharin]及化合物3[uscharin]。根据峰面积，可知化合物1～3在总强心苷提取物(即马利筋乳汁提取物)中的质量分数分别为33％、30％、10％。化合物1～3为富含强心苷的马利筋乳汁提取物(即马利筋乳汁提取物)中的主要成分，虽然该提取物中尚含有其他成分，但此三成分的总含量已达到73％。 化合物1～3可根据波谱数据进行鉴定。
化合物1为白色柱状晶体，紫外最大吸收波长为217nm,分子式为C29H40O9,质谱HRESIMS m/z 533.2758[M+H]+；1H NMR(pyridine-d5,300MHz)δH 9.97(1H,s,H-19),6.08(1H,d,J＝1.5Hz,H-22),5.21(1H,dd,J＝17.6,1.5Hz,H-21a),5.03(1H,dd,J＝17.6,1.5Hz,H-21b),4.97(1H,s,H-1’),4.41(1H,dt,J＝10.6,4.3Hz,H-3),4.29(1H,dt,J＝10.6,4.3Hz,H-2),4.11(1H,dd,J＝11.9,5.2Hz,H-3’),3.71(1H,m,H-5’),2.71(1H,m,H-17),1.35(1H,d,J＝6.1Hz,H-6’),0.87(1H,s,H-18).C NMR(pyridine-d5,300MHz)δC 208.5(C-19),176.1(C-23),175.1(C-20),118.1(C-21),97.7(C-1’),92.5(C-2’),84.6(C-14),74.3(C-3’),74.2(C-22),72.9(C-2),69.8(C-3),69.0(C-5’),51.6(C-17),49.2(C-13),43.8(C-9),43.0(C-5),40.4(C-12),39.6(C-4’),36.9(C-1),34.4(C-4),33.0(C-6),28.4(C-7),28.4(C-16),27.7(C-15),27.7(C-11),22.7(C-6’),22.1(C-16’),16.4(C-18)。经鉴定，化合物1为calotropin。
化合物2为白色粉末，紫外最大吸收波长为226nm，分子式为C31H43NO8S，质谱HRESIMS m/z 590.2832[M+H]+；1H NMR(pyridine-d5,300MHz)δH 9.97(1H,s,H-19),6.1(1H,s,H-N),6.08(1H,d,J＝1.5Hz,H-22),5.21(1H,dd,J＝17.6,1.5Hz,H-21a),5.03(1H,dd,J＝17.6,1.5Hz,H-21b),4.97(1H,s,H-1’),4.41(1H,dt,J＝10.6,4.3Hz,H-3),4.29(1H,dt,J＝10.6,4.3Hz,H-2),3.71(1H,m,H-5’),3.51(2H,m,H-2”),3.35(2H,m,H-1”),2.71(1H,m,H-17),1.35(1H,d,J＝6.1Hz,H-6’),0.87(1H,s,H-18).C NMR(pyridine-d5,300MHz)δC 208.5(C-19),176.1(C-23),175.1(C-20),118.1(C-21),97.7(C-1’),93.0(C-3’),92.5(C-2’),84.6(C-14),74.2(C-22),72.9(C-2),69.8(C-3),69.0(C-5’),52.3(C-1”),51.6(C-17),49.2(C-13),46.1(C-2”),43.8(C-9),43.0(C-5),40.4(C-12),39.6(C-4’),36.9(C-1),34.4(C-4),33.0(C-6),28.4(C-7),28.4(C-16),27.7(C-15),27.7(C-11),22.7(C-6’),22.1(C-16’),16.4(C-18)。经鉴定，化合物2为voruscharin。
化合物3为白色粉末，紫外最大吸收波长为220nm，分子式为C31H41NO8S，质谱HRESIMS m/z 588.2653[M+H]+。1H NMR(pyridine-d5,300MHz)δH 9.97(1H,s,H-19),7.53(1H,s,H-1”),6.08(1H,d,J＝1.5Hz,H-22),5.21(1H,dd,J＝17.6,1.5 Hz,H-21a),5.03(1H,dd,J＝17.6,1.5Hz,H-21b),4.97(1H,s,H-1’),4.41(1H,dt,J＝10.6,4.3Hz,H-3),4.29(1H,dt,J＝10.6,4.3Hz,H-2),3.88(3H,brs,H-2”),3.71(1H,m,H-5’),2.71(1H,m,H-17),1.35(1H,d,J＝6.1Hz,H-6’),0.87(1H,s,H-18).C NMR(pyridine-d5,300MHz)δC 208.5(C-19),176.1(C-23),175.1(C-20),163.68(C-2”),118.1(C-21),99.7(C-1’),96.8(C-2’),93.0(C-3’),84.6(C-14),74.2(C-22),72.9(C-2),69.8(C-3),69.0(C-5’),51.6(C-17),49.2(C-13),47.1(C-1”)43.8(C-9),43.0(C-5),40.4(C-12),39.6(C-4’),36.9(C-1),34.4(C-4),33.0(C-6),28.4(C-7),28.4(C-16),27.7(C-15),27.7(C-11),22.7(C-6’),22.1(C-16’),16.4(C-18)。经鉴定，化合物3为uscharin。化合物1～3的质谱图如图2～4所示。
(3)对步骤(1)得到富含强心苷的马利筋乳汁提取物的活性进行检测
A、采用MTT法检测步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋乳汁提取物(AC-1)对前列腺癌细胞PC3(购自美国模式培养物保藏所)增殖的抑制作用。取单层培养的PC3细胞(RPMI 1640，含有10％小牛血清)，用胰蛋白酶消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μL，细胞数为3000个)。接种24小时后，加入待测样品，使其终浓度为0.039、0.078、0.156、0.3125、0.625和1.25μg/mL，并以相同体积比DMSO作为对照。培养48小时后，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μL/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，同时作图并求得半数抑制浓度(IC50＝0.156ug/mL)。
结果如图5A所示，随着富含强心苷的马利筋乳汁提取物浓度的升高，对前列腺癌细胞PC3的抑制率明显提高。其中当药物浓度为1.25μg/mL时，PC3细胞生长抑制率最高，达到(74.4±5.9)％。
B、采用MTT法检测步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋乳汁提取物(AC-1)对前列腺癌细胞DU145(购自美国模式培养物保藏所)增殖的抑制作用。取单层培养的DU145细胞(DMEM培养液，含10％小牛血清)，用胰蛋白酶消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μL，细胞数为5000个)。接种24小时后，加入待测样品，使其终浓度为0.039、0.078、0.156、0.3125、0.625和1.25μg/mL，并以相同体积比DMSO作为对照。培养48小时后，每孔加入 20μl MTT溶液(5mg/mL)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μL/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，同时作图并求得半数抑制浓度(IC50＝0.285ug/mL)。
结果如图5B所示，随着富含强心苷的马利筋乳汁提取物浓度的升高，对前列腺癌细胞DU145的抑制率明显提高。其中当药物浓度为1.25μg/mL时，DU145细胞生长抑制率最高，达到(80.0±5.8)％。
C、采用MTT法检测步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋乳汁提取物(AC-1)对乳腺癌细胞MDA-MB-231(购自美国模式培养物保藏所)增殖的抑制作用。取单层培养的MDA-MB-231细胞(RPMI 1640，含有10％小牛血清)，用胰蛋白酶消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μL，细胞数为3000个)。接种24小时后，加入待测样品，使其终浓度为0.039、0.078、0.156、0.3125、0.625和1.25μg/mL，并以相同体积比DMSO作为对照。培养48小时后，每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μL/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，同时作图并求得半数抑制浓度(IC50＝0.149ug/mL)。
结果如图5C所示，随着富含强心苷的马利筋乳汁提取物浓度的升高，对乳腺癌细胞MDA-MB-231的抑制率明显提高。其中当药物浓度为1.25μg/mL时，MDA-MB-231细胞生长抑制率最高，达到(72.9±4.3)％。
D、采用MTT法检测步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋乳汁提取物(AC-1)对乳腺癌细胞MCF-7(购自美国模式培养物保藏所)增殖的抑制作用。取单层培养的MCF-7细胞(RPMI 1640，含有10％小牛血清)，用胰蛋白酶消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μL，细胞数为3000个)。接种24小时后，加入待测样品，使其终浓度为0.039、0.078、0.156、0.3125、0.625和1.25μg/mL，并以相同体积比DMSO作为对照。培养48小时后，每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μL/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，同时作图并求得半数抑制浓度(IC50＝0.153ug/mL)。
结果如图5D所示，随着富含强心苷的马利筋乳汁提取物浓度的升高，对乳 腺癌细胞MCF-7的抑制率明显提高。其中当药物浓度为1.25μg/mL时，MCF-7细胞生长抑制率最高，达到(88.9±7.2)％。
E、采用MTT法检测步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋乳汁提取物(AC-1)对慢性粒细胞白血病细胞系K562(购自美国模式培养物保藏所)增殖的抑制作用。取单层培养的K562细胞(RPMI 1640，含有10％小牛血清)，用胰蛋白酶消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μl，细胞数为3000个)。接种24小时后，加入待测样品，使其终浓度为0.039、0.078、0.156、0.3125、0.625和1.25μg/mL，并以相同体积比DMSO作为对照。培养48小时后，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μL/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，同时作图并求得半数抑制浓度(IC50＝0.073ug/mL)。
结果如图5E所示，随着富含强心苷的马利筋乳汁提取物浓度的升高，对慢性粒细胞白血病细胞系K562的抑制率明显提高。其中当药物浓度为1.25μg/mL时，K562细胞生长抑制率最高，达到(89.1±5.2)％。
F、采用MTT法检测步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋乳汁提取物(AC-1)对正常细胞VERO(购自美国模式培养物保藏所)增殖的抑制作用。取单层培养的VERO细胞(RPMI 1640，含有10％小牛血清)，用胰蛋白酶消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μl，细胞数为5000个)。接种24小时后，加入待测样品，使其终浓度为0.039、0.078、0.156、0.3125、0.625和1.25μg/mL，并以相同体积比DMSO作为对照。培养48小时后，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μL/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，同时作图并求得半数抑制浓度(IC50>1.250ug/mL)。
结果如图5F所示，随着含强心苷提取物浓度的升高，对正常细胞的抑制率略微升高，但在最高浓度1.25ug/mL时，对VERO细胞的抑制率仅为(22.9±2.8)％。
实施例2
(1)一种富含强心苷的马利筋乳汁提取物的制备
A、取马利筋的乳汁1mL(干燥后的固形物为100mg)用7mL蒸馏水稀释，得到稀释液；向稀释液中加入5mL正丁醇进行萃取，收集萃取后正丁醇层；再向剩下的水层中加入5mL正丁醇继续进行萃取，如此循环3次，弃去水层，将正丁醇层合并，得到正丁醇提取液15mL；
B、将正丁醇提取液用N-1100V-W型旋转蒸发仪于50℃进行减压浓缩至恒重，得到白色浆状物，为富含强心苷的马利筋乳汁提取物(AC-1，20.0mg，该提取物的提取率为20.0％)；
(2)对步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋乳汁提取物进行分析
将步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋乳汁提取物溶于甲醇，配成10mg/ml的溶液，用HPLC进行反相制备，具体制备条件是：C18反相半制备柱(5μm,9.4×250mm)，紫外检测波长为220nm，流速为3ml/min，梯度系统为：A:水，B:乙腈；0～60min,10％(v/v％)→40％(v/v％)的乙腈溶液；60～80min,40％(v/v％)→60％(v/v％)的乙腈；80～105min,60％(v/v％)→100％(v/v％)的乙腈溶液；分别于64.1min，78.3min，80.5min分钟处收集色谱峰。用旋转蒸发仪对收集液进行减压浓缩(N-1100V-W型)，分别得到化合物1[calotropin]，化合物2[voruscharin]，及化合物3[uscharin]。根据峰面积，可知化合物1～3在提取物中的质量份数分别为32％、30％、9％。化合物1～3为总强心苷提取物中的主要成分，虽然该提取物中尚含有其他成分，但此三成分的总含量已达到71％。化合物1～3可根据波谱数据进行鉴定(同实例1)。
(3)对步骤(1)得到富含强心苷的马利筋乳汁提取物的活性进行检测
A、采用MTT法检测步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋乳汁提取物(AC-1)对前列腺癌细胞PC3(购自美国模式培养物保藏所)增殖的抑制作用。取单层培养的PC3细胞(RPMI 1640，含有10％小牛血清)，用胰蛋白酶消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μL，细胞数为3000个)。接种24小时后，加入待测样品，使其终浓度为0.039、0.078、0.156、0.3125、0.625和1.25μg/mL，并以相同体积比DMSO作为对照。培养48小时后，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μL/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，测试结果如 表1-1所示，同时作图并求得半数抑制浓度(IC50＝0.162ug/mL)。
表1-1：提取物对前列腺癌细胞PC3增殖的抑制作用
浓度(μg/mL) 0.039 0.078 0.156 0.3125 0.625 1.25
抑制率(％) 38.7±1.9 44.6±2.6 49.2±3.2 63.5±4.7 67.1±5.0 72.6±4.8
从表1-1中可知，随着富含强心苷的马利筋乳汁提取物浓度的升高，对前列腺癌细胞PC3的抑制率明显提高。
B、采用MTT法检测步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋乳汁提取物对前列腺癌细胞DU145(购自美国模式培养物保藏所)增殖的抑制作用。取单层培养的DU145细胞(DMEM培养液，含10％小牛血清)，用胰蛋白酶消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μL，细胞数为5000个)。接种24小时后，加入待测样品，使其终浓度为0.039、0.078、0.156、0.3125、0.625和1.25μg/mL，并以相同体积比DMSO作为对照。培养48小时后，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/mL)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μL/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，测试结果如表1-2所示，同时作图并求得半数抑制浓度(IC50＝0.296ug/mL)。
表1-2：提取物对前列腺癌细胞DU145增殖的抑制作用
浓度(μg/mL) 0.039 0.078 0.156 0.3125 0.625 1.25
抑制率(％) 25.3±1.8 32.2±2.3 44.5±2.6 56.4±4.2 68.0±4.9 78.8±5.1
从表1-2中可知，随着富含强心苷的马利筋乳汁提取物浓度的升高，对前列腺癌细胞DU145的抑制率明显提高。
C、采用MTT法检测步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋乳汁提取物AC-1对乳腺癌细胞MDA-MB-231(购自美国模式培养物保藏所)增殖的抑制作用。取单层培养的MDA-MB-231细胞(RPMI 1640，含有10％小牛血清)，用胰蛋白酶消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μL，细胞数为3000个)。接种24小时后，加入待测样品，使其终浓度为0.039、0.078、0.156、0.3125、0.625和1.25μg/mL，并以相同体积比DMSO作为对照。培养48小时后，每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μL/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存 活率，测试结果如表1-3所示，同时作图并求得半数抑制浓度(IC50＝0.159ug/mL)。
表1-3：提取物对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的抑制作用
浓度(μg/mL) 0.039 0.078 0.156 0.3125 0.625 1.25
抑制率(％) 20.5±1.4 39.6±1.7 49.7±3.2 67.4±3.9 70.4±4.0 74.3±4.5
从表1-3中可知，随着富含强心苷的马利筋乳汁提取物浓度的升高，对乳腺癌细胞MDA-MB-231的抑制率明显提高。
D、采用MTT法检测步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋乳汁提取物AC-1对乳腺癌细胞MCF-7(购自美国模式培养物保藏所)增殖的抑制作用。取单层培养的MCF-7细胞(RPMI 1640，含有10％小牛血清)，用胰蛋白酶消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μL，细胞数为3000个)。接种24小时后，加入待测样品，使其终浓度为0.039、0.078、0.156、0.3125、0.625和1.25μg/mL，并以相同体积比DMSO作为对照。培养48小时后，每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μL/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，测试结果如表1-4同时作图并求得半数抑制浓度(IC50＝0.144ug/mL)。
表1-4提取物对乳腺癌细胞MCF-7增殖的抑制作用
浓度(μg/mL) 0.039 0.078 0.156 0.3125 0.625 1.25
抑制率(％) 13.9±1.1 30.6±2.5 54.8±4.9 62.7±5.7 76.4±6.0 89.8±5.6
从表1-4可知，随着富含强心苷的马利筋乳汁提取物浓度的升高，对乳腺癌细胞MCF-7的抑制率明显提高。
E、采用MTT法检测步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋乳汁提取物AC-1对慢性粒细胞白血病细胞系K562(购自美国模式培养物保藏所)增殖的抑制作用。取单层培养的K562细胞(RPMI 1640，含有10％小牛血清)，用胰蛋白酶消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μl，细胞数为3000个)。接种24小时后，加入待测样品，使其终浓度为0.039、0.078、0.156、0.3125、0.625和1.25μg/mL，并以相同体积比DMSO作为对照。培养48小时后，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μL/ 孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，测试结果如表1-5所示，同时作图并求得半数抑制浓度(IC50＝0.078ug/mL)。
表1-5提取物对慢性粒细胞白血病细胞系K562增殖的抑制作用
浓度(μg/mL) 0.039 0.078 0.156 0.3125 0.625 1.25
抑制率(％) 22.0±1.7 50.7±4.7 68.7±5.2 75.9±5.6 84.6±5.7 88.9±4.9
从表1-5可知，随着富含强心苷的马利筋乳汁提取物浓度的升高，对慢性粒细胞白血病细胞系K562的抑制率明显提高。
F、采用MTT法检测步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋乳汁提取物AC-1对正常细胞VERO(购自美国模式培养物保藏所)增殖的抑制作用。取单层培养的VERO细胞(RPMI 1640，含有10％小牛血清)，用胰蛋白酶消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μl，细胞数为5000个)。接种24小时后，加入待测样品，使其终浓度为0.039、0.078、0.156、0.3125、0.625和1.25μg/mL，并以相同体积比DMSO作为对照。培养48小时后，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μL/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，测试结果如表1-6所示，同时作图并求得半数抑制浓度(IC50>1.250ug/mL)。
表1-6提取物对正常细胞VERO增殖的抑制作用
浓度(μg/mL) 0.039 0.078 0.156 0.3125 0.625 1.25
抑制率(％) 13.2±0.9 15.7±1.3 17.1±1.5 19.3±1.8 20.8±2.0 23.7±1.8
从表1-6可知，随着富含强心苷的马利筋乳汁提取物浓度的升高，对正常细胞的抑制率略微升高，但在最高浓度1.25ug/mL时，对VERO细胞的抑制率仅为(23.7±1.8)％。
实施例3
(1)一种富含强心苷的马利筋乳汁提取物的制备
A、取马利筋的乳汁1mL(干燥后的固形物为100mg),用8mL蒸馏水进行稀释，得到稀释液；向稀释液中加入3mL的乙酸乙酯进行萃取，收集萃取后乙酸乙酯层；再向剩下的水层中加入3mL乙酸乙酯继续进行萃取，如此循环4次， 弃去水层，将乙酸乙酯层合并，得到乙酸乙酯提取液12mL；
B、将乙酸乙酯提取液用N-1100V-W型旋转蒸发仪于30℃进行减压浓缩至恒重，得到白色浆状物，为富含强心苷的马利筋乳汁提物(AC-1，20.2mg，该提取率为20.2％)；
(2)对步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋乳汁提物进行分析
将步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋乳汁提物溶于甲醇，配成10mg/ml的溶液，用HPLC进行反相制备，具体制备条件是：C18反相半制备柱(5μm,9.4×250mm)，紫外检测波长为220nm，流速为3ml/min，梯度系统为：A:水，B:乙腈；0～60min,10％(v/v％)→40％(v/v％)的乙腈溶液；60～80min,40％(v/v％)→60％(v/v％)的乙腈；80～105min,60％(v/v％)→100％(v/v％)的乙腈溶液；分别于64.1min，78.3min，80.5min分钟处收集色谱峰。用旋转蒸发仪对收集液进行减压浓缩(N-1100V-W型)，分别得到化合物1[calotropin]，化合物2[voruscharin]，及化合物3[uscharin]。根据峰面积，可知化合物1～3在总强心苷提取物中的质量份数分别为32％、31％、9％。化合物1～3为富含强心苷的马利筋乳汁提取物中的主要成分，虽然该提取物中尚含有其他成分，但此三成分的总含量已达到72％。化合物1～3可根据波谱数据进行鉴定(同实例1)。
(3)对步骤(1)得到富含强心苷的马利筋乳汁提取物的活性进行检测
A、采用MTT法检测步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋乳汁提取物对前列腺癌细胞PC3(购自美国模式培养物保藏所)增殖的抑制作用。取单层培养的PC3细胞(RPMI 1640，含有10％小牛血清)，用胰蛋白酶消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μL，细胞数为3000个)。接种24小时后，加入待测样品，使其终浓度为0.039、0.078、0.156、0.3125、0.625和1.25μg/mL，并以相同体积比DMSO作为对照。培养48小时后，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μL/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，测试结果如表2-1所示，同时作图并求得半数抑制浓度(IC50＝0.166ug/mL)。
表2-1提取物对前列腺癌细胞PC3增殖的抑制作用
浓度(μg/mL) 0.039 0.078 0.156 0.3125 0.625 1.25
抑制率(％) 36.4±1.0 42.7±2.1 46.3±2.8 60.7±4.2 65.9±4.8 70.8±4.6
从表中可知，随着富含强心苷的马利筋乳汁提取物浓度的升高，对前列腺癌 细胞PC3的抑制率明显提高。
B、采用MTT法检测步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋提取物(AC-1)对前列腺癌细胞DU145(购自美国模式培养物保藏所)增殖的抑制作用。取单层培养的DU145细胞(DMEM培养液，含10％小牛血清)，用胰蛋白酶消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μL，细胞数为5000个)。接种24小时后，加入待测样品，使其终浓度为0.039、0.078、0.156、0.3125、0.625和1.25μg/mL，并以相同体积比DMSO作为对照。培养48小时后，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/mL)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μL/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，测试结果如表2-2所示，同时作图并求得半数抑制浓度(IC50＝0.277ug/mL)。
表2-2提取物对前列腺癌细胞DU145增殖的抑制作用
浓度(μg/mL) 0.039 0.078 0.156 0.3125 0.625 1.25
抑制率(％) 28.4±1.7 35.1±2.4 47.2±2.7 59.8±4.0 72.0±4.6 79.9±4.1
从表2-2可知，随着富含强心苷的马利筋乳汁提取物浓度的升高，对前列腺癌细胞DU145的抑制率明显提高。
C、采用MTT法检测步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋乳汁提取物(AC-1)对乳腺癌细胞MDA-MB-231(购自美国模式培养物保藏所)增殖的抑制作用。取单层培养的MDA-MB-231细胞(RPMI 1640，含有10％小牛血清)，用胰蛋白酶消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μL，细胞数为3000个)。接种24小时后，加入待测样品，使其终浓度为0.039、0.078、0.156、0.3125、0.625和1.25μg/mL，并以相同体积比DMSO作为对照。培养48小时后，每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μL/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，测试结果如表2-3所示，同时作图并求得半数抑制浓度(IC50＝0.146ug/mL)。
表2-3提取物对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的抑制作用
浓度(μg/mL) 0.039 0.078 0.156 0.3125 0.625 1.25
抑制率(％) 24.9±1.2 40.8±1.4 50.6±2.9 68.2±3.1 72.3±4.3 76.6±4.2
从表2-3可知，随着富含强心苷的马利筋乳汁提取物浓度的升高，对乳腺癌细胞MDA-MB-231的抑制率明显提高。
D、采用MTT法检测步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋提取物(AC-1)对乳腺癌细胞MCF-7(购自美国模式培养物保藏所)增殖的抑制作用。取单层培养的MCF-7细胞(RPMI 1640，含有10％小牛血清)，用胰蛋白酶消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μL，细胞数为3000个)。接种24小时后，加入待测样品，使其终浓度为0.039、0.078、0.156、0.3125、0.625和1.25μg/mL，并以相同体积比DMSO作为对照。培养48小时后，每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μL/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，测试结果如表2-4所示，同时作图并求得半数抑制浓度(IC50＝0.163ug/mL)。
表2-4提取物对乳腺癌细胞MCF-7增殖的抑制作用
浓度(μg/mL) 0.039 0.078 0.156 0.3125 0.625 1.25
抑制率(％) 10.9±1.0 26.1±1.8 47.9±4.2 58.7±4.3 67.4±4.9 80.8±4.2
从表2-4中可知，随着富含强心苷的马利筋乳汁提取物浓度的升高，对乳腺癌细胞MCF-7的抑制率明显提高。
E、采用MTT法检测步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋提取物(AC-1)对慢性粒细胞白血病细胞系K562(购自美国模式培养物保藏所)增殖的抑制作用。取单层培养的K562细胞(RPMI 1640，含有10％小牛血清)，用胰蛋白酶消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μl，细胞数为3000个)。接种24小时后，加入待测样品，使其终浓度为0.039、0.078、0.156、0.3125、0.625和1.25μg/mL，并以相同体积比DMSO作为对照。培养48小时后，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μL/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，测试结果如表2-5所示，同时作图并求得半数抑制浓度(IC50＝0.069ug/mL)。
表2-5提取物对慢性粒细胞白血病细胞系K562增殖的抑制作用
浓度(μg/mL) 0.039 0.078 0.156 0.3125 0.625 1.25
抑制率(％) 24.3±1.5 52.4±3.9 70.2±4.9 76.8±5.4 85.4±5.0 90.2±5.2
从表2-5可知，随着富含强心苷的马利筋乳汁提取物浓度的升高，对慢性粒细胞白血病细胞系K562的抑制率明显提高。
F、采用MTT法检测步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋乳汁提取物(AC-1)对正常细胞VERO(购自美国模式培养物保藏所)增殖的抑制作用。取单层培养的VERO细胞(RPMI 1640，含有10％小牛血清)，用胰蛋白酶消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μl，细胞数为5000个)。接种24小时后，加入待测样品，使其终浓度为0.039、0.078、0.156、0.3125、0.625和1.25μg/mL，并以相同体积比DMSO作为对照。培养48小时后，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μL/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，测试结果如表2-6所示，同时作图并求得半数抑制浓度(IC50>1.250ug/mL)。
表2-6提取物对正常细胞VERO增殖的抑制作用
浓度(μg/mL) 0.039 0.078 0.156 0.3125 0.625 1.25
抑制率(％) 12.4±0.8 15.4±1.1 16.8±1.4 18.2±1.2 20.4±1.8 22.7±1.9
从表2-6可知，随着富含强心苷的马利筋乳汁提取物浓度的升高，对正常细胞的抑制率略微升高，但在最高浓度1.25ug/mL时，对VERO细胞的抑制率仅为(22.7±1.9)％。
实施例4
(1)一种富含强心苷的马利筋乳汁提取物的制备
A、取马利筋的乳汁1mL(干燥后的固形物为100mg)，用10mL蒸馏水进行稀释，得到稀释液；向稀释液中加入5mL的乙酸乙酯进行萃取，收集萃取后乙酸乙酯层；再向剩下的水层中加入5mL乙酸乙酯继续进行萃取，如此循环3次，弃去水层，将乙酸乙酯层合并，得到乙酸乙酯提取液15mL；
B、将乙酸乙酯提取液用N-1100V-W型旋转蒸发仪于50℃进行减压浓缩至恒重，得到白色浆状物，为富含强心苷的马利筋乳汁提取物(AC-1，19.0mg，该提取物的提取率为19.0％)；
(2)对步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋乳汁提取物进行分析
将步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋乳汁提取物溶于甲醇，配成10mg/ml的溶液，用HPLC进行反相制备，具体制备条件是：C18反相半制备柱(5μm,9.4×250mm)，紫外检测波长为220nm，流速为3ml/min，梯度系统为：A:水，B: 乙腈；0～60min,10％(v/v％)→40％(v/v％)的乙腈溶液；60～80min,40％(v/v％)→60％(v/v％)的乙腈；80～105min,60％(v/v％)→100％(v/v％)的乙腈溶液；分别于64.1min，78.3min，80.5min分钟处收集色谱峰。用旋转蒸发仪对收集液进行减压浓缩(N-1100V-W型)，分别得到化合物1[calotropin]，化合物2[voruscharin]，及化合物3[uscharin]。根据峰面积，可知化合物1～3在总强心苷提取物中的质量份数分别为31％、29％、9％。化合物1～3为总强心苷提取物中的主要成分，虽然该提取物中尚含有其他成分，但此三成分的总含量已达到69％。化合物1～3可根据波谱数据进行鉴定(同实例1)。
(3)对步骤(1)得到富含强心苷的马利筋乳汁提取物的活性进行检测
A、采用MTT法检测步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋乳汁提取物(AC-1)对前列腺癌细胞PC3(购自美国模式培养物保藏所)增殖的抑制作用。取单层培养的PC3细胞(RPMI 1640，含有10％小牛血清)，用胰蛋白酶消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μL，细胞数为3000个)。接种24小时后，加入待测样品，使其终浓度为0.039、0.078、0.156、0.3125、0.625和1.25μg/mL，并以相同体积比DMSO作为对照。培养48小时后，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μL/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，测试结果如表3-1所示，同时作图并求得半数抑制浓度(IC50＝0.160ug/mL)。
表3-1提取物对前列腺癌细胞PC3增殖的抑制作用
浓度(μg/mL) 0.039 0.078 0.156 0.3125 0.625 1.25
抑制率(％) 37.9±1.2 45.1±2.3 49.5±3.1 64.8±5.1 69.7±4.9 74.6±4.3
从表3-1可知，随着含强心苷提取物浓度的升高，对前列腺癌细胞PC3的抑制率明显提高。
B、采用MTT法检测步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋乳汁提取物AC-1对前列腺癌细胞DU145(购自美国模式培养物保藏所)增殖的抑制作用。取单层培养的DU145细胞(DMEM培养液，含10％小牛血清)，用胰蛋白酶消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μL，细胞数为5000个)。接种24小时后，加入待测样品，使其终浓度为0.039、0.078、0.156、0.3125、0.625和1.25μg/mL，并以相同体积比DMSO作为对照。培养48小时后，每孔加入 20μl MTT溶液(5mg/mL)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μL/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，测试结果如表3-2所示，同时作图并求得半数抑制浓度(IC50＝0.293ug/mL)。
表3-2提取物对前列腺癌细胞DU145增殖的抑制作用
浓度(μg/mL) 0.039 0.078 0.156 0.3125 0.625 1.25
抑制率(％) 26.0±1.4 34.3±2.1 45.4±2.0 56.9±3.8 69.2±4.3 78.1±4.7
从表3-2可知，随着富含强心苷的马利筋乳汁提取物浓度的升高，对前列腺癌细胞DU145的抑制率明显提高。
C、采用MTT法检测步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋乳汁提取物AC-1对乳腺癌细胞MDA-MB-231(购自美国模式培养物保藏所)增殖的抑制作用。取单层培养的MDA-MB-231细胞(RPMI 1640，含有10％小牛血清)，用胰蛋白酶消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μL，细胞数为3000个)。接种24小时后，加入待测样品，使其终浓度为0.039、0.078、0.156、0.3125、0.625和1.25μg/mL，并以相同体积比DMSO作为对照。培养48小时后，每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μL/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，测试结果如表3-3所示，同时作图并求得半数抑制浓度(IC50＝0.142ug/mL)。
表3-3提取物对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的抑制作用
浓度(μg/mL) 0.039 0.078 0.156 0.3125 0.625 1.25
抑制率(％) 25.4±1.0 41.0±1.8 51.3±3.0 69.4±3.2 73.4±4.6 77.2±4.4
从表3-3可知，随着富含强心苷的马利筋乳汁提取物浓度的升高，对乳腺癌细胞MDA-MB-231的抑制率明显提高。
D、采用MTT法检测步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋乳汁提取物(AC-1)对乳腺癌细胞MCF-7(购自美国模式培养物保藏所)增殖的抑制作用。取单层培养的MCF-7细胞(RPMI 1640，含有10％小牛血清)，用胰蛋白酶消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μL，细胞数为3000个)。接种24小时后，加入待测样品，使其终浓度为0.039、0.078、0.156、0.3125、0.625和1.25μg/mL，并以相同体积比DMSO作为对照。培养48小时后，每孔加入20μLMTT 溶液(5mg/mL)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μL/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，测试结果如表3-4所示，同时作图并求得半数抑制浓度(IC50＝0.158ug/mL)。
表3-4提取物对乳腺癌细胞MCF-7增殖的抑制作用
浓度(μg/mL) 0.039 0.078 0.156 0.3125 0.625 1.25
抑制率(％) 11.7±1.4 38.3±2.0 50.8±4.0 60.1±3.7 72.3±4.5 84.8±4.3
从表3-4可知，随着富含强心苷的马利筋乳汁提取物浓度的升高，对乳腺癌细胞MCF-7的抑制率明显提高。
E、采用MTT法检测步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋乳汁提取物(AC-1)对慢性粒细胞白血病细胞系K562(购自美国模式培养物保藏所)增殖的抑制作用。取单层培养的K562细胞(RPMI 1640，含有10％小牛血清)，用胰蛋白酶消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μl，细胞数为3000个)。接种24小时后，加入待测样品，使其终浓度为0.039、0.078、0.156、0.3125、0.625和1.25μg/mL，并以相同体积比DMSO作为对照。培养48小时后，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μL/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，测试结果如表3-5所示，同时作图并求得半数抑制浓度(IC50＝0.076ug/mL)。
表3-5提取物对慢性粒细胞白血病细胞系K562增殖的抑制作用
浓度(μg/mL) 0.039 0.078 0.156 0.3125 0.625 1.25
抑制率(％) 22.8±1.2 51.0±4.0 69.4±4.2 76.3±5.0 84.3±4.9 89.1±4.7
从表3-5可知，随着富含强心苷的马利筋乳汁提取物浓度的升高，对慢性粒细胞白血病细胞系K562的抑制率明显提高。
F、采用MTT法检测步骤(1)得到的富含强心苷的马利筋乳汁提取物(AC-1)对正常细胞VERO(购自美国模式培养物保藏所)增殖的抑制作用。取单层培养的VERO细胞(RPMI 1640，含有10％小牛血清)，用胰蛋白酶消化，并接种于96孔板上(每孔加入细胞悬浮液100μl，细胞数为5000个)。接种24小时后，加入待测样品，使其终浓度为0.039、0.078、0.156、0.3125、0.625和1.25μg/mL，并以相同体积比DMSO作为对照。培养48小时后，每孔加入20μL MTT溶液 (5mg/mL)，4小时后离心弃上清液，加入DMSO(100μL/孔)，振荡15min左右，置酶标仪测定OD值，波长为570nm，并计算细胞存活率，测试结果如表3-6所示，同时作图并求得半数抑制浓度(IC50>1.250ug/mL)。
表3-6提取物对正常细胞VERO增殖的抑制作用
浓度(μg/mL) 0.039 0.078 0.156 0.3125 0.625 1.25
抑制率(％) 14.1±1.0 16.5±1.5 18.4±1.2 19.9±1.6 21.9±2.0 24.7±1.7
从表3-6可知，随着富含强心苷的马利筋乳汁提取物浓度的升高，对正常细胞的抑制率略微升高，但在最高浓度1.25ug/mL时，对VERO细胞的抑制率仅为(24.7±1.7)％。
上述实施例1为本发明最佳的实施方式(有机溶剂用量小、萃取次数少，产率高)，实例2和实例3次之，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种富含强心苷的马利筋乳汁提取物的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
(1)将马利筋的乳汁用水稀释，得到稀释液；向稀释液中加入有机溶剂进行萃取，收集萃取后的有机层；再向剩下的水层中加入有机溶剂进行萃取，再次收集有机层，如此循环萃取2～4次，弃去水层，将有机层合并，得到马利筋乳汁的强心苷提取液；
(2)将马利筋乳汁的强心苷提取液进行减压浓缩至恒重，得到白色浆状物，即为富含强心苷的马利筋乳汁提取物。
2.根据权利要求1所述富含强心苷的马利筋乳汁提取物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述有机溶剂为乙酸乙酯或正丁醇。
3.根据权利要求1所述富含强心苷的马利筋乳汁提取物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述马利筋的乳汁用水稀释中水的用量为乳汁体积的5～10倍。
4.根据权利要求1所述富含强心苷的马利筋乳汁提取物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述有机溶剂每次加入量为乳汁体积的3～5倍。
5.根据权利要求1所述富含强心苷的马利筋乳汁提取物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述减压浓缩的温度为30～50℃。
6.根据权利要求1所述富含强心苷的马利筋乳汁提取物的制备方法，其特征在于：所述富含强心苷的马利筋乳汁提取物中含有化合物1，化合物2以及化合物3；
所述化合物1的结构式为：
化合物2的结构式为：
化合物3的结构式为：
7.根据权利要求6所述富含强心苷的马利筋乳汁提取物的制备方法，其特征在于：所述化合物1在所述提取物中的质量百分含量为31～33％，所述化合物2在所述提取物中的质量百分含量为29～31％，所述化合物3在所述提取物中的质量百分含量为9～10％。
8.一种富含强心苷的马利筋乳汁提取物通过权利要求1所述的制备方法制备得到。
9.根据权利要求8所述富含强心苷的马利筋乳汁提取物的应用，其特征在于：所述富含强心苷的马利筋乳汁提取物在抗肿瘤药物中的应用。
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