CN102552644A - 大蒜总多糖的抗癌用途、制备方法及组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种大蒜总多糖在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明还提供了一种大蒜总多糖的制备方法，该制备方法充分利用了大蒜提取蒜油之后的药渣，成本低廉，操作简单，产品提取率高，质量可控，能够产业化。本发明又提供了一种用该方法制备的大蒜总多糖及其药物组合物，具有良好的抗肿瘤活性和增强免疫的功能，安全无毒，能制成抗肿瘤药物。

Description

大蒜总多糖的抗癌用途、制备方法及组合物

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种多糖的应用，具体涉及大蒜总多糖及其药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用，还涉及该大蒜总多糖的制备方法。

背景技术

肿瘤是当今社会危害人类健康的重大疾病之一，已成为仅次于心脑血管疾病的世界第二大死因疾病。恶性肿瘤治疗方案一般采取手术方法，并配合放化疗治疗，但化疗药物有一定的毒副作用。相比之下，中药抗肿瘤药具有独特的优势，有祛邪、扶正或增效、减毒的作用，所以中药抗肿瘤药物一直是肿瘤药研究的热点。

大蒜的主要成分为含硫有机化合物、氨基酸类、酶类、糖类、脂类、皂苷类、维生素和微量元素等。现代药理研究表明，大蒜有抗菌、消炎、降血脂、降血压、抗血栓、抗肿瘤、抗衰老、抗氧化以及增强机体免疫力等多种功效。

大蒜防癌抗癌的历史悠久，其主要治疗作用集中在含硫化合物成分上，研究和应用较多的是大蒜的脂溶性成分大蒜油和大蒜油的主要有效成分二烯丙基三硫(合成品名为大蒜素)和二烯丙基二硫。目前已有大蒜油、大蒜素药品和保健品面市。大蒜多糖作为大蒜水溶性成分的重要组成部分，其化学结构和药理作用近几年有较多的研究报道，但大蒜多糖在预防和治疗肿瘤方面功效未能得到充分、有效地利用。

大蒜多糖近几年来已成为大蒜研究和应用的热点。对于大蒜多糖的结构和理化性质，不同的研究者依据不同的材料，获得的研究结果有很大差异。一般认为，大蒜多糖为果聚杂多糖，具有类菊糖作用，能够增强免疫力，对肝损伤有保护作用，对实验性小鼠病毒性心肌炎具治疗作用，能够抑制紫外线诱发的晶状体损伤，可作为乳酸菌发酵的碳源，具有抗氧化抗病毒等多种生物活性(王文玲等，大蒜多糖的研究综述.广州食品工业科，2004，20(4)：144-148)。现将大蒜多糖的主要生理活性列举如下：

1、抗凝血活性

大蒜多糖C具有明显的抗凝血活性，大蒜多糖B的抗凝血活性较弱(汪新亮等，大蒜多糖对凝血系统及血小板聚集的影响.江苏中医药，2008，40(6)：80-81)。

2、抗氧化、清除氧自由基能力

不同产地大蒜均具有一定的抗氧化性能(回瑞华等，不同产地大蒜抗氧化性能的研究.鞍山师范学院学报，2008，10(2)：15-18)；大蒜多糖能促进正常PC12细胞增殖，且对H₂O₂诱导PC12细胞损伤具有保护作用，其作用机制可能与提高PC12细胞的抗氧化能力有关(郑颖等，大蒜多糖抗氧化活性及其对PC12细胞增殖的影响.暨南大学学报(医学版)，2008，29(2)：110-112)；大蒜多糖具有清除超氧阴离子自由基和羟基自由基的能力，且在较高浓度下强于大蒜素(李朝阳等，大蒜多糖的酶法提取及其抗氧化性研究.食品科学，2008，29(1)：17)。

3、抗乙肝病毒及保肝作用

大蒜多糖A、B、C在培养2215细胞中可抑制乙肝病毒标志HBsAg的分泌，并随药物浓度的增加而增高抑制率(郑敏等，大蒜多糖体外抗乙型肝炎病毒作用研究.中药药理与临床，2005，21(3)：29-30)；大蒜多糖A、B、C均可显著阻抑肝损伤小鼠的肝ALT、AST的下降及血清ALT、AST的升高，三种大蒜多糖对肝损伤均有良好的保护作用，其中以大蒜多糖C作用最佳，且安全无毒(郑敏等，大蒜多糖对肝损伤小鼠血清和肝组织ALT、AST的影响及其急性毒性实验.成宁学院学报(医学版)，2003，17(2)：85-88)；大蒜多糖能够促进肝糖原的合成和储存，对小鼠免疫性肝损伤有良好的保护作用(张霞等，大蒜多糖对ConA致小鼠肝损伤保护作用组织学观察.中兽医医药杂志，2009，6：19-21)；大蒜多糖C能全面抑制免疫性肝损伤小鼠的免疫功能，并促使其机体建立新的免疫平衡，从而对免疫性肝损伤产生保护作用(赵骥等，大蒜多糖C对免疫性肝损伤小鼠外周血淋巴细胞亚群的影响.中药药理与临床，2007，23(5)：96-97)。

4、对病毒性心肌炎的治疗作用

大蒜多糖对实验性小鼠病毒性心肌炎具有治疗作(蔡飞等，大蒜多糖对病毒性心肌炎小鼠心肌酶的影响.成宁学院学报(医学版)，2003，17(1)：1-3)；大蒜多糖可能通过抑制脂质过氧化反应及一氧化氮的产生，起到治疗病毒性心肌炎的作用(李彩蓉等，大蒜多糖对小鼠病毒性心肌炎脂质过氧化及一氧化氮的影响.现代中西医结合杂志，2003，12(24)：2636-2638)；大蒜多糖能够拮抗阿霉素(ADR)引起的自由基脂质过氧化，从而保护心肌细胞(余薇等，大蒜多糖对阿霉素所致心肌细胞损伤的保护作用.中国药理学通报，2005，21(9)：1104)；大蒜多糖能拮抗阿霉素所致的小鼠中毒性心肌炎，其作用机制与增强心肌SOD活力和抗心肌脂质过氧化有关(余薇等，大蒜多糖对阿霉素所致小鼠心脏毒性的拮抗作用.中国药理学通报，2005，21(1)：96～99)；大蒜多糖还具有抗心肌细胞凋亡的作用(余薇等，大蒜多糖对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用.中国药理学通报，2010，26(5)：697～699)。

5、抗柯萨奇病毒B3(CVB3)作用

大蒜多糖B和C在体外通过抑制柯萨奇病毒B3(CVB3)生物合成而发挥抗CVB3的作用(郑敏等，大蒜多糖体外抗柯萨奇病毒B3作用.中国现代应用药学杂志，2005，22(1)：4-6)。

6、减少肿瘤药物的毒性

能减轻周期非特异性治疗肿瘤药物的毒性作用；ADR为蒽环类抗生素，临床上广泛应用于治疗多种恶性肿瘤，ADR在治疗肿瘤的同时，存在着剂量依赖性心脏毒性，因而限制了其临床应用；大蒜多糖能够拮抗ADR所致心肌细胞凋亡，起到减毒作用(余薇等，大蒜多糖对阿霉素所致小鼠心脏毒性的拮抗作用.中国药理学通报，2005，21(1)：96～99)。

此外，目前有多篇专利文献也涉及大蒜总多糖，例如，专利2007100171321公开了一种从大蒜深加工废水中提取大蒜多糖的方法，属于多糖的提取、分离领域，该方法采用超滤技术及喷雾干燥技术回收提取大蒜深加工废水中的大蒜多糖，其包括以下步骤：a、收集大蒜深加工废水，过滤除杂；b、滤液经截留均分子量60000～80000的超滤装置截留浓缩，得固体物含量为6％～10％的大蒜多糖浓缩液CW1；c、大蒜多糖浓缩液CW1经过喷雾干燥塔干燥，得到粉状大蒜多糖APS1。与现有技术相比，该方法具有成本低、流程简单、易于实现等特点，实施后能够最大限度地回收大蒜深加工废水中的大蒜多糖，降低企业生产成本及污染治理成本。

专利200610033685公开了一种用超临界CO₂从鲜蒜中同时提取大蒜油和大蒜多糖的方法，属大蒜有效成分的提取技术，包括下述步骤：(1)把新鲜大蒜去皮后放入萃取釜中，通入二氧化碳，通过高压泵把压力升高到10～35MPa，温度设定为32～50℃，静态萃取0～3h；(2)开动高压泵进行动态萃取1～4h，萃取压力：10～35MPa；萃取温度：32～50℃；一级分离釜压力：5～12MPa；一级分离釜温度30～50℃；二级分离釜压力：4～7MPa；二级分离温度：30～50℃；(3)萃取完毕后，从二级分离釜中放出大蒜油；(4)从萃取釜的放液口放出含有大蒜多糖的水液，经过干燥，即得到固体大蒜多糖。该方法具有工艺流程短、大蒜的综合利用率高的优点。

专利CN1239719涉及大蒜多糖的提取方法，尤其是从大蒜中提取大蒜多糖的方法。取大蒜去皮清洗干净，将其捣成大蒜泥；加水蒸煮，用蒸汽除臭；将大蒜泥在95-100℃条件下蒸煮后保温；所得蒸煮水，高速离心、薄膜浓缩超滤，氨水调至pH8，加CaCl₂溶液，搅拌，再次高速离心；所得清液，干燥得大蒜多糖(APS)白色粉末。该方法操作简单易行，且产品纯度较高。

专利200310117625.8属于天然产物的提取、分离和纯化领域，公开了一种以新鲜大蒜或脱水大蒜为原料联合制备蒜氨酸与大蒜多糖的方法。通过洗涤去杂、蒜氨酸酶的灭活、破碎取汁等步骤，得大蒜粗提液；精制后的大蒜粗提液经离子交换树脂处理，洗脱得大蒜多糖粗提液，再精制获得大蒜多糖产品；从再次洗脱液中制取蒜氨酸粗品，再精制获得蒜氨酸产品。该方法利用同一批原料生产蒜氨酸和大蒜多糖两种有价值的生物活性物质，更充分地利用了大蒜资源；降低了制造成本，减轻了生产单一产品时造成的环境污染，可使采用该技术的生产企业比单独生产蒜氨酸或大蒜多糖的效益翻番。

专利200310117624.3属于天然产物的提取、分离和纯化领域，公开了一种以鲜大蒜为原料联合制备大蒜精油与大蒜多糖的方法。通过浸泡、洗涤、打浆、酶解、装料、蒸馏、精油分离等步骤，取出油相为大蒜精油粗品，水相为大蒜多糖粗品，再精制得到大蒜精油产品和大蒜多糖产品。该方法利用同一批原料生产大蒜精油和大蒜多糖两种有价值的产品，充分地利用了大蒜资源；降低了生产成本，减轻了生产单一产品时造成的环境污染，尤其减少了生产大蒜精油造成的空气和水资源污染，可使生产企业比单独生产大蒜精油或大蒜多糖的效益翻番。

综上所述，专利报道的均为大蒜总多糖的制备方法，对大蒜多糖的应用没有涉及；事实上减少肿瘤药物的毒性和增强机体免疫力与抗肿瘤有着密切关系，但现有技术中仅报道了大蒜多糖能减轻周期非特异性治疗肿瘤药物ADR所致心肌细胞凋亡，起到减毒作用(余薇等，大蒜多糖对阿霉素所致小鼠心脏毒性的拮抗作用.中国药理学通报，2005，21(1)：96～99)，但并未阐述大蒜多糖是否具有对肿瘤细胞的抑制作用；此外，专利CN1239719认为大蒜多和牛膝膝多糖一样的具有增强免疫的作用，但并没有给出大蒜多糖增强正常鼠或荷瘤小鼠的免疫功能的实验数据。因此，目前现有技术中对大蒜多糖抗肿瘤、增强荷瘤动物免疫功能的开发应用还不够深入和全面，需要加强大蒜多糖在抗肿瘤防治领域和大蒜应用领域的研究。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的一个目的是提供一种大蒜总多糖在制备抗肿瘤药物中的应用，本发明的另一个目的是提供一种大蒜总多糖的制备方法，本发明的再一个目的是提供一种根据所述制备方法制得的大蒜总多糖及其药物组合物。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一方面，本发明提供了一种大蒜总多糖在制备用于预防和/或治疗癌症的药物、保健品和/或食品中的应用。

进一步，所述大蒜总多糖为杂多糖，其水解后的成分包括：果糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖和甘露糖。

进一步，所述肿瘤选自：胃癌、直/结肠癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、骨癌、食道癌、乳腺癌、宫颈癌、胰腺癌、脑瘤、皮肤癌、白血病、淋巴癌和黑色素瘤等癌症。

进一步，所述抗肿瘤药物选自以下剂型：注射剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、口服液、膜剂、散剂、外用膏剂、栓剂和丸剂等剂型。

另一方面，本发明提供了一种大蒜总多糖的制备方法，其包括以下步骤：

1)根据现有技术(专利ZL200510083951.0)提供的方法进行大蒜双提，即将大蒜粉碎，加水保温酶解，水蒸气蒸馏提取，得挥发油、药液和药渣；

2)保留药液；

3)水提药渣，得水提液；

4)将步骤3)所得水提液与步骤2)保留的药液合并，减压回收水，得浓缩液；

5)加醇醇沉所得浓缩液，过夜，离心，得沉淀；

6a)将步骤5)所得沉淀进行干燥，得浅黄色大蒜总多糖。

或者

6b)溶解步骤5)所得沉淀，离心，上清液过树脂柱，得流出液，减压浓缩，干燥，得乳白色大蒜总多糖。

需要说明的是通过步骤6a)得到的浅黄色大蒜总多糖的有效成分含量比通过步骤6b得到的乳白色大蒜总多糖的有效成分含量低。

进一步，步骤1)中，所述双提为1-2次，每次加3-9倍水，每次0.5-2h。

进一步，步骤3)中，所述水提为1-2次，每次加3-9倍水，每次0.5-2h。

进一步，步骤4)中，所述减压回收是在温度不高于80℃下进行的；所述浓缩液，以大蒜(g)∶药液(mL)为单位计，浓度为1∶0.8-1.2，使药液在60℃下的相对密度为0.9-1.10。

进一步，步骤5)中，所述醇为乙醇，其在浓缩液中的含量为70-80％(体积百分含量)。

进一步，步骤6a)和步骤6b)中，所述干燥为减压干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。

进一步，步骤6b)中，所述溶解沉淀的溶剂为热的去离子水；所述树脂为D316、HPD300L、D900、D318或D941型树脂；所述减压浓缩是在温度不高于80℃下进行的。

再一方面，本发明提供了一种根据所述的方法制备的大蒜总多糖。

进一步，所述的大蒜总多糖为杂多糖，其水解后的成分包括：果糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖和甘露糖。

又一方面，本发明还提供了一种包含所述大蒜总多糖的药物组合物。

本发明的有益效果如下：

本发明提供的大蒜总多糖能制成抗肿瘤药物，具有良好的抗肿瘤活性和增强免疫的功能，且急毒实验结果表明其无毒，能够满足防癌抗癌和治疗保健的需求，应用前景广阔。本发明提供的大蒜总多糖的制备方法充分利用了提取大蒜油之后的大蒜药渣，且具有操作简单、产品提取率高、质量可控以及可产业化的优点。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1为实施例3的葡萄糖标准曲线(标准曲线方程：y＝12.97x-0.078，相关系数：0.9990)；

图2为实施例4的标准溶液色谱图；

图3为实施例4的样品分离谱图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例1：大蒜总多糖的制备

大蒜200kg，粉碎至直径为0.5-1cm的颗粒，双提1次，水提2次，分别加5倍、4倍和4倍水，每次1h，药液减压回收水(温度＜80℃)，浓缩(60℃相对密度1.05)，水浓缩液加乙醇醇沉，使含醇量达到80％(体积比)，放置过夜，离心，得浅黄色大蒜总多糖，出膏率12.89％。

实施例2：大蒜总多糖的制备

大蒜5kg，粉碎至直径0.5cm左右，双提1次，水提1次，分别加7倍和5倍水，每次提取0.5h，药液减压回收水(温度＜80℃)，浓缩(60℃相对密度1.08)，水浓缩液加乙醇醇沉，使含醇量达到75％(体积比)，放置过夜，离心，得上清液，过D900树脂柱，得乳白色大蒜总多糖，出膏率3.95％。

实施例3：采用紫外-可见分光光度法测定大蒜总多糖的含量

一、仪器与试剂

1.仪器：

8453紫外-可见分光光度计(美国，安捷伦)；HW·SY11-K数显恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表公司)；CX-250超声波清洗机(天海双龙医疗设备有限公司)

2.试剂：5％(重量体积比)苯酚溶液(分析纯，天津市福晨化学试剂厂)；浓硫酸和95％(体积比)乙醇溶液(均为分析纯，北京化工厂)；D-无水葡萄糖对照品(供含量测定用，中国药品生物制品检定所，批号：110833-200503)。

二、样品测定

1.对照品溶液制备

精密称取无水葡萄糖对照品约12mg，置25mL量瓶中，加蒸馏水溶解并定容，即得。

2.标准曲线的制备

精密量取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL分别置于25mL量瓶中，蒸馏水定容。分别精密量取上述对照品溶液5份各1mL于10mL具塞试管中，分别加5％苯酚溶液1.0mL，摇匀后加入浓硫酸5.0mL，摇匀后沸水浴10min，取出置于冰水浴中冷却放置至室温。以试剂空白为参比在485nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度(mg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，如图1所示。

3.样品溶液的制备

精密称取大蒜总多糖样品(来自实施例1)约30mg，置于10mL离心管中，加入浓度为80％(体积比)的乙醇溶液8mL，超声振荡60min，以3000rpm的转速离心15min，弃去上清液，残渣用浓度为80％(体积比)的乙醇洗涤2～3次，加入8mL沸水于离心管中，超声振荡溶液样品60min，冷却后转移至10mL量瓶中，少量蒸馏水洗涤离心管，洗涤液合并至量瓶中，蒸馏水定容至10mL。摇匀过滤，取续滤液1mL，至25mL量瓶中，加水定容，即为供试样品溶液，按标准曲线制备项下操作，由标准曲线计算供试品中大蒜总多糖含量。

三、测定结果

样品中以葡萄糖计大蒜总多糖的含量为48.45％(n＝2)。

实施例4：采用离子色谱(ICS 3000)测定大蒜总多糖水解单糖的含 量及组成比例

取大蒜总多糖样品(来自实施例1)10mg，加入2mL浓度为2mol/L的三氟乙酸溶液，密闭后，80℃下水解4h，水解液温度降至室温后，静置1h，精密量取上清液1mL，置于50mL茄形瓶中，50℃下减压蒸干，残余物加50mL去离子水，超声振荡10min，溶解后过0.22μm滤膜及RP色谱柱，进样分析，上述溶液再稀释10倍，供测定含量。

表1离子色谱(ICS 3000)测定大蒜总多糖水解单糖结果

*其中葡萄糖和果糖含量为稀释10倍的结果

实施例5：大蒜总多糖对肿瘤细胞的生长抑制作用的研究

一、材料

1.受试药物与阳性药物

受试药物：大蒜不同部位提取物2#(大蒜总多糖样品来自实施例2)由中国中医科学院中医基础理论研究所制备并提供。上述样品以DMSO(二甲基亚砜)溶解，实验前配制。

阳性药：顺铂由齐鲁制药有限公司生产(批号905011CF)。

2.胃癌细胞株：MKN45细胞从北京协和细胞资源中心购买。

3.试剂：RPMI1640培养基(GIBCO公司lot8109038)；胎牛血清(GIBCO16000公司)；胰蛋白酶(Solarbio公司)；MTT(Sigma)；DMSO(Sigma)购自北京奥信拓普科技有限公司。

4.仪器：全自动酶标仪，Thermo MK-3；CO₂培养箱，Revco 300T；倒置显微镜，OLYMPUS-IMT-2；洁净工作台BCN-1360B型，北京东联哈尔仪器制造有限公司；微量移液器，德国Eppendorf；台式高速离心机TDL-40B型，上海安亭科学仪器厂；电子分析天平，CP64上海奥豪斯公司。

二、实验方法

1.细胞培养方法

MKN45细胞在含10％新生牛血清的1640完全培养基(2gNaHCO₃，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素)中培养，在37℃的5％CO₂培养箱中培养至细胞覆盖率80～90％以上时传代，选取生长状态良好的细胞用于实验研究。采用MTT法(张均田主编，现代药理实验方案，北京医科大学中国协和医科大学联合出版，1998年10月北京第一次印刷，P819)测定大蒜总多糖对MKN45细胞增殖的抑制，并测定药物半数抑制浓度(IC50)。

2.MTT法测定大蒜不同部位提取成分对胃癌MKN45细胞增殖的抑制并测定药物半数抑制浓度(IC50)

收集对数生长期的MKN45细胞，以3×10⁴/孔的密度加入96孔板，每孔100μL。将不同质量浓度的大蒜总多糖样品(来自实施例2)各100μL加入实验孔，使大蒜总多糖的终浓度分别为、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156、0.078、0.0395、0.0198、0.0099、0.0049、0.00248、0.00124、0.00064、mg/mL，并同时设立空白对照、阴性对照组和阳性对照组。其中，阴性对照孔接种等量细胞，并加入含0.1％终浓度的DMSO的完全培养液；空白孔不接种细胞，只加入等量完全培养液；顺铂作为阳性对照组，其剂量按临床用量换算，终质量浓度为25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.8、0.4、0.2μg/mL。每一浓度设3个复孔，培养48或72h。每孔加入5mg/mL的MTT溶液(四氮唑(3-(4，5-dimethylthbm)1-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide，以PBS稀释成5mg/mL)10μL，继续培养4h，去上清，每孔加入200μLDMSO，震荡溶解10min，室温下放置10min，在酶标仪570nm处测光密度(OD)值，计算细胞抑制率，绘制细胞增殖抑制曲线并测定药物半数抑制浓度(IC50)。

计算细胞抑制率的公式：细胞抑制率(％)＝(阴性对照组OD值-实验药物组OD值)/(阴性对照组OD值-空白组OD值)×100％；以药物浓度为横坐标、存活率为纵坐标绘制浓度效应曲线，求出回归方程，得出抑制50％细胞生长的浓度(IC50)，实验结果见表2。

表2大蒜总多糖样品对肿瘤细胞(人胃癌MKN45细胞)杀伤作用的半数致死量(IC50)

表3大蒜总多糖样品对肿瘤细胞(人胃癌MKN45细胞)增殖的抑制率

合成化合物或植物提取物纯品的IC50＜10μg/mL或植物粗提物的IC50＜20μg/mL时，则判断样品在体外对肿瘤细胞有杀伤作用(张均田主编，现代药理实验方案，北京医科大学中国协和医科大学联合出版，1998年10月北京第一次印刷)。从表2可以看出，大蒜总多糖在体外对肿瘤细胞没有杀伤作用；从表3可以看出它的抑瘤率浓度很高，说明大蒜多糖在体外没有细胞毒作用或细胞毒作用很小。但是大蒜多糖是否具有抗肿瘤活性，一定要根据体内抗肿瘤实验结果进行判断，例如，肿瘤药物中的生物调节剂就是这样一类药物，它进入体内后通过机体调节产生抗肿瘤作用。

实施例6：大蒜总多糖对大鼠T淋巴细胞增殖的实验研究

一、材料

1.受试药物：大蒜不同部位提取物2#(大蒜总多糖样品来自实施例2)、5#(大蒜总皂苷样品)、2#+5#(大蒜总皂苷和大蒜总多糖提取分离后按1∶1混合样品)，(2+5)#(大蒜总皂苷和大蒜总多糖未经过分离的样品)由中国中医科学院中医基础理论研究所中药质量分析室制备并提供，上述样品以DMSO溶解，实验前配制。

阳性药物：ConA(Concanavalin A，刀豆球蛋白A)，(Sigma公司)。

2.动物：SD大鼠，雄性，体重180±10g，清洁级动物，实验动物室提供。

3.试剂：淋巴细胞分离液(Sigma公司)、RPMI1640培养基(GIBCO公司)、胎牛血清(GIBCO公司)、DMSO(Sigma公司)等，购自北京奥信拓普科技有限公司；快速细胞增殖检测试剂盒(WST)(Bio-Vision公司)。

4.仪器：全自动酶标仪，Thermo MK-3；CO₂培养箱，Revco 300T；倒置显微镜，OLYMPUS-IMT-2；洁净工作台，BCN-1360B，北京东联哈尔仪器制造有限公司；微量移液器，德国Eppendorf；台式高速离心机TDL-40B型，上海安亭科学仪器厂；电子分析天平CP64，上海奥豪斯公司。

二、方法

麻醉SD大鼠，取出脾脏，将脾脏剪碎成单细胞(取上清液)缓慢加入预先已加入淋巴细胞分离液的离心管中，脾悬液与分离液的比例为1∶1。在4℃下以2000rpm转速离心20min，液相分为三层，用微量进样器抽取中层淋巴细胞放入无菌的离心管中，用PBS(Phosphate Buffered Saline，磷酸盐缓冲液)洗涤2次，每次均以2000rpm离心10min，弃上清液，用少量RPIM1640培养液(含10％血清)打散，用血细胞计数板统计调节细胞初始浓度至1×10⁶/mL，取100μL加入96孔培养板，在37℃的5％CO₂培养箱中培养24h。

将不同质量浓度的大蒜总多糖药物各100μL加入实验孔，使大蒜总多糖(来自实施例2)的终浓度分别为1.25、0.625、0.3125、0.156、0.078、0.039、0.0195、0.0098和0.005mg/mL，并同时设立空白对照组和阳性对照组。其中，空白对照组加入100μL无菌生理盐水，阳性药物对照组中加入100μLConA(终浓度为5μg/mL)，每一浓度设3个复孔，培养48或72h。每孔加入浓度为5mg/mL的WST溶液(按照快速细胞增殖检测试剂盒说明书配制，即把5毫升电子耦合试剂加入到WST-1粉末中，完全溶解)20μL，继续培养4h，在酶标仪于450nm波长读取各孔吸光度(A)，以A值反映淋巴细胞增殖率，结果见表4。

表4大蒜成分对大鼠脾淋巴细胞增殖(A)影响的WST检测

注：与对照组比^**：p＜0.001，^*：p＜0.01

与对照组比较，大蒜总多糖提取物的组合物(2+5)#、2#+5#对大鼠T淋巴细胞增殖具有明显的促进作用(p＜0.01)，其中(2+5)#促增殖作用更为明显(p＜0.001)，具有增强免疫作用。

实施例7：大蒜总多糖对小鼠移植瘤模型的抑瘤作用(小鼠肉瘤S180 模型)

一、材料

1.受试物：大蒜多糖样品2#(样品来自实施例1)由中国中医科学院中医基础理论研究所中药质量分析室制备并提供。

2.实验动物：ICR小鼠，70只，18～20g，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号SCXK(京)2007-0001。试验开始前给予常规基础饲料适应5天～7天。

二、方法

1.饲养环境：饲养于屏障环境，温度为21～25℃，相对湿度40～70％。

2.肿瘤接种、分组及给药：

每只动物右腋皮下接种S180肉瘤细胞2×10⁶，24h后，随机分为7组，分别为空白组(给与同量生理盐水)、模型组(给与同量的溶剂对照)、阳性药组(腹腔注射环磷酰胺25mg/kg，2天1次，生产厂家：天津金世制药有限公司，批号：20091101)、大蒜总多糖样品高、中、低剂量组口服给药，连续10天，观察抑瘤率及给药前后小鼠的体重变化，结果见表5。

表5大蒜总多糖对小鼠肉瘤S180模型的抑瘤作用

Groups	Dose(g/kg)	n	Tumor weight	Inhibition rate(％)
					Model		10	0.60±0.35
2#-	0.75	10	0.58±0.28	3.81％
						1.5	10	0.45±0.25	25.17％
	3.0	10	0.32±0.47	46.94％

根据表5中测定的动物体重和抑瘤率两项指标，能够初步确定大蒜样品具有体内抗肿瘤作用。

综上所述，研究结果表明大蒜多糖样品在体内有一定的抑瘤作用，有量效关系。

Claims (14)

1.大蒜总多糖在制备用于预防和/或治疗癌症的药物、保健品和/或食品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述大蒜总多糖为杂多糖，其水解后的成分包括：果糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖和甘露糖。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述肿瘤选自：胃癌、直/结肠癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、骨癌、食道癌、乳腺癌、宫颈癌、胰腺癌、脑瘤、皮肤癌、白血病、淋巴癌和黑色素瘤。

4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述药物选自以下剂型：注射剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、口服液、膜剂、散剂、外用膏剂、栓剂和丸剂。

5.一种用于制备大蒜总多糖的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)大蒜双提，得挥发油、药液和药渣，优选地，所述双提包括将大蒜粉碎，加水保温酶解并以水蒸气蒸馏提取；

2)保留药液；

3)水提药渣，得水提液；

4)将步骤3)所得水提液与步骤2)保留的药液合并，减压回收水，浓缩，得浓缩液；

5)加醇醇沉所得浓缩液，过夜，离心，得沉淀；

6a)将步骤5)所得沉淀进行干燥，得浅黄色大蒜总多糖。

或者

6b)溶解步骤5)所得沉淀，离心，上清液过树脂柱，得流出液，减压浓缩，干燥，得乳白色大蒜总多糖。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述双提为1-2次，每次加3-9倍水，每次0.5-2h。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述水提为1-2次，每次加3-9倍水，每次0.5-2h。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述减压回收是在温度不高于80℃下进行的；所述浓缩液，以大蒜(g)∶药液(mL)为单位计，浓度为1∶0.8-1.2，使药液在60℃下的相对密度为0.9-1.10。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤5)中，所述醇为乙醇，其在浓缩液中的含量为70-80％(体积百分含量)。

10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤6a)和步骤6b)中，所述干燥为减压干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。

11.根据权利要求5～10任一项所述的方法，其特征在于，步骤6b)中，所述溶解沉淀的溶剂为热的去离子水；所述树脂为D316、HPD300L、D900、D318或D941型树脂；所述减压浓缩是在温度不高于80℃下进行的。

12.根据权利要求5～11任一项所述的方法制备的大蒜总多糖。

13.根据权利要求12所述的大蒜总多糖，其特征在于，所述大蒜总多糖为杂多糖，其水解后的成分包括：果糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖和甘露糖。

14.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要12或13所述的大蒜总多糖。

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