CN104558222A - 具有抗肿瘤活性的厚壳贻贝多糖类化合物的制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，本发明提供了一种新的从我国东海厚壳贻贝中分离纯化多糖类化合物的方法。本发明还提供了该多糖类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

Description

具有抗肿瘤活性的厚壳贻贝多糖类化合物的制备工艺

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地说，本发明涉及一种新的厚壳贻贝中所含的多糖类化合物的制备方法，同时，还涉及该糖苷类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

贻贝是海产双壳贝类，俗称青口、海红，其干制品统称淡菜，除含有丰富的氨基酸、糖类、蛋白质及维生素外，还含有丰富的微量元素－硒。贝类提取物具有抗肿瘤，增加机体免疫功能，降血脂，抗衰老及抗病毒和抗菌功能；新近报道贻贝具有较高的修复DNA损伤的作用，故有望研制出抗肿瘤药物新成分；贻贝足腺细胞分泌的粘液蛋白含有的贻贝粘着蛋白（属糖蛋白类）为超强度粘液的研发等。贻贝不仅有很高的营养价值，还具有很好的药用和食疗功效，又是补肾良药，药效明显。我国沿海所产的食用贻贝主要有紫贻贝、厚壳贻贝和翡翠贻贝等。目前国内外研究对贻贝蛋白质如过氧化物歧化酶、凝集素等的分离提纯及功能进行了一定研究，但对于贻贝多糖的研究不多。

从东海厚壳贻贝中分离纯化而来的贻贝多糖具有有明显的增强机体免疫力作用及体内抗肿瘤等作用。对肿瘤细胞HO-8910、MCF-7、K562及SMMC-7721均有显著抑制增殖作用。徐红丽等采用热水提取我国东海厚壳贻贝粗多糖，DEAE-Sepharose、Sepharose CL-6B柱层析进一步分离纯化得到贻贝多糖纯品MP-I。用MTT法进行体外抗肿瘤活性的研究。结果表明贻贝多糖纯品MP-I主要由葡萄糖组成，对体外多种肿瘤细胞均有不同程度抑制作用（参见文献：徐红丽，郭婷婷，郭一峰，张建鹏，冯伟华，焦炳华。贻贝水溶性多糖MP-I的分离纯化及体外抗肿瘤活性研究[J].第二军医大学学报，2006,27（9）：998-1001.）。

发明内容

本发明的目的在于针对现有多糖提取方法脂类干扰以及最终多糖得率不高的缺点，提供一种新的我国东海厚壳贻贝所含的多糖类化合物的制备方法；本发明的第二目的是提供依据上述方法制备得到的厚壳贻贝多糖类化合物；本发明的第三目的是提供该多糖类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

本发明的第一方面，本发明提供了厚壳贻贝多糖类化合物的制备方法，该方法包括以下步骤：

A.粗制品制备

新鲜贻贝软体组织匀浆，1%甲醇间歇搅拌浸泡24h去脂，离心取沉淀。加水煮沸5h，抽滤，残渣重复加水煮沸3h，抽滤，合并滤液。旋转蒸发50℃减压浓缩滤液。0.5%活性炭脱色，离心去沉淀。加乙醇至终浓度75%，4℃静置醇沉过夜。离心收集沉淀，分别用无水乙醇和丙酮洗涤2次，干燥得多糖水提物。多糖水提物溶于水，Sevage法除蛋白，混合液磁力搅拌，分液漏斗静置分层，弃下层有机溶剂相。反复8次，至界面无白色沉淀。旋转蒸发50℃减压浓缩上层水相，加三倍体积无水乙醇沉淀过夜，弃上清，冷冻干燥得粗多糖。

B.精制品制备

将粗多糖溶于蒸馏水，离心收集上清，不溶物再次热水浴中溶于蒸馏水，离心弃沉淀，合并两次上清液，终浓度约0.2g/ml。上DEAE-Sepharose F.F XK-50离子交换制备柱，蒸馏水洗脱，自动部分接收器收集洗脱液。苯酚-硫酸法（1:5）跟踪检测收集多糖组分，至无糖洗出为止（480nm处测定OD值，绘制洗脱曲线）。真空冷冻干燥浓缩多糖洗脱液，得到多糖提取物半纯品。多糖提取物复溶于蒸馏水，离心弃沉淀，浓度约0.2g/ml，上Sepharose CL-6B凝胶制备柱，蒸馏水洗脱，自动部分接收器收集洗脱液，苯酚-硫酸法跟踪检测收集多糖组分，至无糖洗出为止。重复上Sepharose CL-6B凝胶制备柱，至HPLC检测呈单一对称峰。真空冷冻干燥得到多糖精制品。

除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。

本发明的第二方面，是提供了依据上述方法制备得到的厚壳贻贝多糖类化合物。

本发明的第三方面，是提供了上述的多糖类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述的抗肿瘤药物，其抗肿瘤作用是通过抑制肿瘤细胞NF-κB p65基因表达而起作用的。

本发明对所述的贻贝多糖进行了体内外抗肿瘤活性的检测，证明本发明化合物具有良好的抗肿瘤活性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中的生物材料和主要试剂购自国药集团上海分公司。

实施例1：从厚壳贻贝中分离纯化多糖类化合物

厚壳贻贝由浙江省嵊泗县翔远水产有限公司提供，采自浙江省嵊泗县贻贝养殖水域。

取新鲜贻贝软体组织700g，组织捣碎机匀浆，加1L1%甲醇间歇搅拌浸泡24h去脂，5000rpm×10min离心取沉淀。加水5L，搅拌、煮沸5h，抽滤，残渣重复加水煮沸3h，抽滤，合并两次滤液。旋转蒸发50℃减压浓缩滤液。0.5%活性炭脱色，5000rpm×10min离心去沉淀。加乙醇至终浓度75%，4℃静置醇沉过夜。8000rpm×10min离心收集沉淀，分别用无水乙醇和丙酮洗涤2次，干燥得多糖水提物。多糖水提物溶于250ml水，Sevage法除蛋白（V样品:V氯仿:V正丁醇=20:4:1），混合液磁力搅拌0.5h，分液漏斗静置分层，弃下层有机溶剂相（含大量蛋白）。反复4次，至界面无白色沉淀。旋转蒸发50℃减压浓缩上层水相，加三倍体积无水乙醇沉淀过夜，弃上清，冷冻干燥得粗多糖。

将粗多糖溶于蒸馏水，8000rpm×10min离心收集上清，不溶物再次热水浴中溶于蒸馏水，离心弃沉淀，合并两次上清液，终浓度约0.2g/ml。上DEAE-Sepharose F.F XK-50离子交换制备柱，蒸馏水洗脱，自动部分接收器收集洗脱液。苯酚-硫酸法（1:5）跟踪检测收集多糖组分，至无糖洗出为止（480nm处测定OD值，绘制洗脱曲线）。真空冷冻干燥浓缩多糖洗脱液，得到多糖提取物半纯品。多糖提取物复溶于蒸馏水，8000rpm×10min离心弃沉淀，浓度约0.2g/ml，上Sepharose CL-6B凝胶制备柱，蒸馏水洗脱，自动部分接收器收集洗脱液，苯酚-硫酸法跟踪检测收集多糖组分，至无糖洗出为止。重复上Sepharose CL-6B凝胶制备柱，至HPLC检测呈单一对称峰。真空冷冻干燥得到多糖精制品。

实施例2：本发明化合物的抗肿瘤活性的研究

1.体外肿瘤细胞增殖抑制实验

首先对多种肿瘤细胞株进行筛选，获得对贻贝多糖敏感的肿瘤细胞。选取人卵巢癌HO-8910、人乳腺癌MCF-7、白血病细胞K562、白血病细胞HL-60、人肝癌SMMC-7721、HepG-2、人子宫颈癌Hela细胞、人胰腺癌细胞SW1990以及人胃癌细胞AGS、MKN-28、MKN-45等作为研究对象，0.25%胰酶消化对数生长期的肿瘤细胞，分别调整细胞浓度为2×10⁵/ml，接种于96孔板，每组6个重复孔，每孔90μl，37℃，5％CO₂条件下贴壁24h，加入不同浓度的多糖溶液10μl，使终浓度分别为500μg/ml、100μg/ml、20μg/ml，同时设阴性对照组(生理盐水)，阳性对照组(5-Fu)，使终浓度为5μg/ml。加样后培养72h，每孔加入10μl MTT(5mg/m1)，继续培养4h。小心吸弃上清(悬浮细胞离心后弃上清)，每孔加入100μl10％SDS，37℃放置过夜，待结晶完全溶解后，用酶标免疫测定仪590nm处测定各孔吸光度。根据下面的公式计算出抑制率。

抑制率=(OD对照组-OD实验组)／OD对照组×100％

贻贝多糖的体外抑制肿瘤细胞生长作用的结果显示，三个浓度组分别对MKN-45、MCF-7、HO-8910、K562、SMMC-7721四种肿瘤细胞的生长抑制作用较强(p<0.01)。其中，贻贝多糖对MKN-45、MCF-7的生长抑制作用最为明显，且抑制程度与多糖的剂量呈正相关，可以作为后续体外抗肿瘤活性研究的敏感细胞。

2.贻贝多糖对MKN-45细胞NF-κB p65基因表达的影响

p65是一种重要转录因子，可以通过调控一系列基因的表达参与细胞增殖、凋亡和肿瘤转化，它的过度表达推进细胞周期演进并抑制凋亡，在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用。0.25%胰酶消化对数生长期的MKN-45肿瘤细胞，调整细胞浓度为5×10⁵/ml，接种于6孔板，37℃，5％CO₂条件下贴壁生长24h，加入不同浓度的贻贝多糖溶液50μl，使终浓度分别为500μg/ml、100μg/ml、20μg/ml，同时设阴性对照组(生理盐水,50μl)，分别继续培养24h、48h。收集细胞，westernblot法检测p65蛋白表达水平。实验结果表明，贻贝多糖能够显著降低p65蛋白表达水平。因此，贻贝多糖通过降低肿瘤因子p65来抑制肿瘤细胞的生长可能是其抑制肿瘤生长的机理之一。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (4)

1.一种厚壳贻贝中所含的多糖化合物的制备方法，该方法包括以下步骤：

A.粗制品制备

新鲜贻贝软体组织匀浆，1%甲醇间歇搅拌浸泡24h去脂，离心取沉淀；加水煮沸5h，抽滤，残渣重复加水煮沸3h，抽滤，合并滤液；旋转蒸发50℃减压浓缩滤液。0.5%活性炭脱色，离心去沉淀；加乙醇至终浓度75%，4℃静置醇沉过夜。离心收集沉淀，分别用无水乙醇和丙酮洗涤2次，干燥得多糖水提物；多糖水提物溶于水，Sevage法除蛋白，混合液磁力搅拌，分液漏斗静置分层，弃下层有机溶剂相；反复8次，至界面无白色沉淀；旋转蒸发50℃减压浓缩上层水相，加三倍体积无水乙醇沉淀过夜，弃上清，冷冻干燥得粗多糖；

B.精制品制备

将粗多糖溶于蒸馏水，离心收集上清，不溶物再次热水浴中溶于蒸馏水，离心弃沉淀，合并两次上清液，终浓度约0.2g/ml；上DEAE-Sepharose F.F XK-50离子交换制备柱，蒸馏水洗脱，自动部分接收器收集洗脱液。苯酚-硫酸法（1:5）跟踪检测收集多糖组分，至无糖洗出为止，480nm处测定OD值，绘制洗脱曲线；真空冷冻干燥浓缩多糖洗脱液，得到多糖提取物半纯品；多糖提取物复溶于蒸馏水，离心弃沉淀，浓度约0.2g/ml，上Sepharose CL-6B凝胶制备柱，蒸馏水洗脱，自动部分接收器收集洗脱液，苯酚-硫酸法跟踪检测收集多糖组分，至无糖洗出为止；重复上Sepharose CL-6B凝胶制备柱，至HPLC检测呈单一对称峰。真空冷冻干燥得到多糖精制品。

2.一种如权利要求1所述的制备方法制备得到的厚壳贻贝中所含的多糖化合物。

3.一种如权利要求2所述的厚壳贻贝中所含的多糖类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

4.根据如权利要求3所述的厚壳贻贝中所含的多糖类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物抑制NF-κB p65基因表达。