CN104116024B - 肉苁蓉多糖在制备具有辅助抑制结肠癌功效的功能食品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了肉苁蓉多糖在制备具有辅助抑制结肠癌功效的功能食品中的应用，其中肉苁蓉多糖优选通过以下方法制备获得：以肉苁蓉为原料，经含沸水提取、去蛋白、透析和乙醇处理工序制备获得，所述的肉苁蓉多糖具有调节肿瘤微环境的作用，本发明中的肉苁蓉多糖可以通过抑制肿瘤新生血管生成、免疫抑制、抗氧化及抑制结肠癌成纤维细胞生长等多途径调节肿瘤微环境，表明其具有良好的辅助抑制结肠癌肿瘤作用。
Description
技术领域
本发明属于多糖技术领域，具体涉及一种肉苁蓉多糖在制备具有辅助抑制结肠癌功效的功能食品中的应用。
背景技术
免疫负调控研究为肿瘤治疗提供了新策略。肿瘤微环境中，存在着大量的负调控细胞，它们相互作用，相互影响，伴随着肿瘤细胞和微环境的共进化。由于肿瘤细胞的免疫原性改变和非正常生长，刺激成纤维细胞释放炎症因子，抗原提呈细胞传递肿瘤抗原信号，共同招募免疫细胞浸润到肿瘤局部，而且肿瘤细胞的异常增殖引起对邻近细胞的压迫，导致缺血坏死等组织损伤，产生大量的炎性因子，因此肿瘤局部处于非可控性炎症状态，导致微环境免疫负调控的形成，诱导肿瘤相关成纤维细胞（CAF）和髓样抑制性细胞（MDSC）的形成，IL10、TGF-β诱导巨噬细胞由杀伤性的M1型转变为免疫抑制性的M2型；调节性T细胞在肿瘤局部显著增加。其结果是抑制细胞毒性T细胞（CTL）、自然杀伤细胞（NK）的活性，维持肿瘤局部的免疫耐受状态。
近年来的研究发现，多糖就具有显著地抗肿瘤活性并且对人体的毒副作用相对较小，对多糖的生物活性研究在医学领域已经成为国内外专家学者研究的热点。近年发现一些多糖及其复合物对多种疾病，如免疫紊乱、癌症、糖尿病、高血压、肝炎、血栓、肺炎、病毒等都具有显著疗效，并且参与细胞各种生命现象的调节。
肉苁蓉属列当科濒危种，分布于内蒙古、宁夏、甘肃和新疆，素有“沙漠人参”之美誉，具有极高的药用价值，是我国传统的名贵中药材，也是历代补肾壮阳类处方中使用频度最高的补益药物之一。目前尚无以肉苁蓉为原料制备多糖，用于制备辅助抑制结肠癌的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供肉苁蓉多糖在制备具有辅助抑制结肠癌功效的功能食品中的应用。
其中所述的辅助抑制结肠癌功效是指通过抑制肿瘤新生血管生成、免疫抑制、抗氧化及抑制结肠癌成纤维细胞生长等作用调节肿瘤微环境，达到辅助抑制结肠癌肿瘤的功效。
作为本发明的一种实施方式，本发明中的肉苁蓉多糖优选通过以下方法制备获得：以肉苁蓉为原料，经含沸水提取、去蛋白、透析和乙醇处理工序制备获得，所述的肉苁蓉多糖具有调节肿瘤微环境的作用。
作为本发明的一种优选的实施方式，本发明所述的肉苁蓉多糖具体通过以下方法制备获得：以肉苁蓉为原料，用沸水多次提取后，合并提取液，将提取液浓缩得浓缩液，在浓缩液中加入三氯乙酸水溶液进行去蛋白处理，去蛋白后将反应液进行中和、扎袋透析处理，将透析袋内反应液进行浓缩、离心处理，取上清液加入乙醇进行醇沉、干燥处理，即得肉苁蓉多糖。
本发明在肉苁蓉多糖的制备过程中，各工序的具体参数优选如下：
沸水提取时，提取次数为1~5次，每次提取时沸水的用量为肉苁蓉总质量的5~20倍，每次提取时间为1.5~5h。
沸水提取时，沸水的用量优选为肉苁蓉总质量的5~20倍，提取次数较佳为3次，其中第一次提取时，沸水的用量优选为原料肉苁蓉总质量的10~20倍，提取2~5h；第二次提取时，沸水的用量优选为原料肉苁蓉总质量的10~20倍，提取1.5~5h；第三次提取时，沸水的用量优选为原料肉苁蓉总质量的10~20倍，提取1.5~5h。
将提取液优选浓缩至原提取液总体积的约1/10得浓缩液。
本发明所述的三氯乙酸水溶液的质量百分含量优选为35%，去蛋白处理时间优选为3~6h，三氯乙酸水溶液的体积优选与浓缩液的体积相同。
中和处理时可以采用质量百分含量为10%的氢氧化钠水溶液。
扎袋透析处理时优选采用截留分子量3500Da的透析袋进行透析处理。
乙醇进行醇沉处理时优选采用体积百分含量优选为70~95%的乙醇水溶液。
浓缩可以采用多种现有技术中的浓缩方式，其中以真空浓缩最佳。真空浓缩时温度优选为40℃。
本发明中的肉苁蓉多糖，可以直接口服，也可以制成药剂学上所说的多种剂型，如胶囊型、片剂、粉剂、颗粒剂或口服液等，食用后具有辅助抑制结肠癌肿瘤的功效。
因此，本发明所述功能食品的剂型优选为胶囊型、片剂、粉剂、颗粒剂或口服液等。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
（1）本发明中的肉苁蓉多糖，其纯度和活性高，可以通过抑制肿瘤新生血管生成、免疫抑制、抗氧化及抑制结肠癌成纤维细胞生长等多途径调节肿瘤微环境，其具有良好的辅助抑制结肠癌肿瘤作用；
（2）本发明中的肉苁蓉多糖的制备方法，工艺简单稳定高效，适合工业化生产，成本低；
（3）本发明中的肉苁蓉多糖，可以用于制备具有辅助抑制结肠癌肿瘤功效的功能食品。
附图说明
图1是本发明实施例4中肉苁蓉多糖可抑制BMP2诱导的带有BRE报告基因的荧光素酶的活性；
图2是本发明实施例5中肉苁蓉多糖可抑制TGFβ诱导的带有SMAD2/3/4报告基因活性；
图3是本发明实施例6中肉苁蓉多糖能激活带有NF-кB报告基因的荧光素酶的活性；
图4是本发明实施例7中肉苁蓉多糖可抑制Cocl2诱导的带有HRE报告基因的荧光素酶的活性；
图5是本发明实施例8中肉苁蓉多糖可抑制结肠癌成纤维细胞的生长。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但不以任何形式限制本发明。
以下实施例中采用的各原料，如无特殊说明，均为市售产品。
实施例1
本实施例中的肉苁蓉多糖，通过以下方法制备获得：取肉苁蓉原料，采用沸水提取，第一次提取时，水的用量为原料总质量的20倍，煮沸5h过滤；第二次提取时，水的用量为原料总质量的20倍，煮沸3h过滤；第三次提取时，水的用量为原料总质量的10倍，煮沸2h过滤，合并滤液，真空浓缩至原来体积的大约1/10，下同。将浓缩液进行三氯乙酸除蛋白处理，加入同体积（下同）的30%三氯乙酸(质量百分比)，处理时间为4h后，用10%NaOH（质量百分比）中和，下同，中和后将反应液置于透析袋中扎袋透析，透析时透析袋的截留分子量通常约为3500Da，下同，然后将透析袋内液浓缩，离心，取上清液加入3~4倍体积的85%乙醇水溶液（体积百分含量）进行醇沉淀处理，取沉淀物经含真空干燥（约40℃，下同）处理得肉苁蓉多糖组分。
实施例2
本实施例中的肉苁蓉多糖，通过以下方法制备获得：取肉苁蓉原料，采用沸水提取，第一次提取时，水的用量为肉苁蓉原料总质量的15倍，煮沸5h过滤；第二次提取时，水的用量为肉苁蓉原料总质量的15倍，煮沸3h过滤；第三次提取时，水的用量为肉苁蓉原料总质量的10倍，煮沸3h过滤，合并滤液，真空浓缩。将浓缩液进行三氯乙酸除蛋白处理，加入同体积的25%三氯乙酸(质量百分比)，处理时间为3h后，用10%NaOH（质量百分比）中和，中和后将反应液置于透析袋中扎袋透析，然后将透析袋内液浓缩，离心，取上清液加入3~4倍体积的70%乙醇水溶液（体积百分含量）进行醇沉淀处理，取沉淀物经含真空干燥处理得肉苁蓉多糖组分。
实施例3
本实施例中的肉苁蓉多糖，通过以下方法制备获得：取肉苁蓉原料，采用沸水提取，第一次提取时，水的用量为肉苁蓉原料总质量的10倍，煮沸3h过滤；第二次提取时，水的用量为肉苁蓉原料总质量的20倍，煮沸3过滤h；第三次提取时，水的用量为肉苁蓉原料总质量的10倍，煮沸5h过滤，合并滤液，真空浓缩，将浓缩液进行三氯乙酸除蛋白处理，加入同体积的15%三氯乙酸(质量百分比)，处理时间为5h后，用10%NaOH（质量百分比）中和，中和后将反应液置于透析袋中扎袋透析，然后将透析袋内液浓缩，离心，取上清液加入3~4倍体积的95%乙醇水溶液（体积百分含量）进行醇沉淀处理，取沉淀物经含真空干燥处理得肉苁蓉多糖组分。
实施例4肉苁蓉多糖可抑制BMP2诱导的带有BRE报告基因的荧光素酶的活性
C2C12细胞株购自中科院细胞库，C2C12-pGF1-BRE细胞株由中国科学院上海药物研究所丁侃实验室构建，保存于液氮中。C2C12-pGF1-BRE细胞用含10%Gibco胎牛血清DMEM培养基培养，置于37℃饱和湿度、含5%CO2的恒温箱中培养，以1×104细胞/孔的密度接种于96孔板内，每孔100μL。贴壁24h后吸去60μL培养基，加配置好相应浓度的样品(实施例1中的肉苁蓉多糖)50μL，终浓度分别为0.5mg/mL、0.1mg/mL、0.02mg/mL，10μLBMP2调整至终浓度200ng/mL。同时设空白组和BMP2组对照。给药16h后吸去培养基，加20μLReporterLysis1XBuffer，将溶解的细胞裂解液20μL转移至白板，加入40μLluciferase底物，于3分钟内读板，读取RLU值。采用SPSS统计软件进行统计学处理。数据均以均数±标准差(.x±s)表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。
实验结果如图1所示，肉苁蓉多糖在0.02mg/mL低浓度下具有抑制BMP2诱导的带有BRE报告基因的荧光素酶的活性，且该活性随多糖浓度增加而显著增加，表明该多糖在该活性方面具有剂量依赖性。已知肿瘤新生血管生成在肿瘤的发生发展过程中起着关键作用，而BMP2信号通路在肿瘤新生血管生成过程中起关键作用。该多糖可显著抑制BMP2信号通路，表明该多糖具有调节肿瘤微环境的功效。
实施例5肉苁蓉多糖可抑制TGFβ诱导的带有SMAD2/3/4报告基因活性
HEK293T细胞株购自中科院细胞库，HEK293T-pGF1-SMAD2/3/4细胞株由中国科学院上海药物研究所丁侃实验室构建，保存于液氮中。HEK293T-pGF1-SMAD2/3/4细胞用含10%Gibco胎牛血清DMEM培养基培养，置于37°C饱和湿度、含5%CO2的恒温箱中培养，以2×104细胞/孔的密度接种于96孔板内，每孔100μL。贴壁24h后吸去60μL培养基，加配置好相应浓度的样品50μL(实施例1中的肉苁蓉样品)，终浓度分别为0.5mg/mL、0.1mg/mL、0.02mg/mL，10μLTGFβ1调整至终浓度50ng/mL。同时设空白组和TGFβ1组对照。给药16hr后吸去培养基，加20μLReporterLysis1XBuffer，将溶解的细胞裂解液20μL转移至白板，加入40μLluciferase底物，于3分钟内读板，读取RLU值。采用SPSS统计软件进行统计学处理。数据均以均数±标准差(.x±s)表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。
实验结果如图2所示，肉苁蓉多糖在0.5mg/mL浓度下具有抑制TGFβ诱导的带有SMAD2/3/4信号通路。已知肿瘤新生血管生成在肿瘤的发生发展过程中起着关键作用，而TGFβ诱导的SMAD2/3/4信号通路在肿瘤新生血管生成过程中起关键作用。该多糖可显著抑制该信号通路，表明该多糖具有调节肿瘤微环境的功效。
实施例6肉苁蓉多糖能激活带有NF-кB报告基因的荧光素酶的活性
THP-1细胞株购自中科院细胞库，THP-1/pGF1-NF-кB细胞株由中国科学院上海药物研究所丁侃实验室构建，保存于液氮中。THP-1/pGF1-NF-кB细胞用含10%胎牛血清RPMI-1640培养基培养。置于37℃饱和湿度、含5%CO2的恒温箱中培养，以5×104细胞/孔的密度接种于96孔板内，每孔50μL容积。加入受试样品50μL(实施例1中的肉苁蓉样品)，终浓度分别为0.5mg/mL、0.1mg/mL、0.02mg/mL，同时设立空白组和LPS对照组。加入LPS溶液10μL，终浓度为1μg/mL，置于37℃饱和湿度、含5%CO2的恒温箱中培养过夜。培养过夜后，每空加入100μLBright-GloTMLuciferaseAssaySystem底物，于酶标仪读板，读取RLU值。
采用SPSS统计软件进行统计学处理。数据均以均数±标准差(.x±s)表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。
实验结果如图3所示，该多糖在0.1mg/mL以及0.5mg/mL低浓度下具有较好的激活NF-кB信号通路的活性。NF-кB激活后能增强机体的免疫力，间接发挥抗肿瘤作用。
实施例7肉苁蓉多糖能抑制Cocl2诱导的带有HRE报告基因的荧光素酶的活性
HEK293T细胞株购自中科院细胞库，HEK293T-pGF1-HRE细胞株由中科院上海药物所丁侃实验室构建，保存于液氮中，用含10%Gibco胎牛血清DMEM培养基培养。HEK293T-pGF1-HRE细胞以2×104细胞/孔的密度接种于96孔板内，每孔100μL。贴壁24h后吸去60μL培养基，加配置好相应浓度的样品50μL（实施例1中的肉苁蓉多糖），终浓度分别为0.5mg/mL、0.1mg/mL、0.02mg/mL，10μLCocl2调整至终浓度250μM。同时设空白组和Cocl2组对照。给药16h后吸去培养基，加20μLReporterLysis1XBuffer，于-80℃冰箱冻存至读板。从-80℃冰箱移出待检测板，将溶解的细胞裂解液20μL转移至白板，加入40μLluciferase底物，于3分钟内读板，读取RLU值。采用SPSS统计软件进行统计学处理。数据均以均数±标准差(.x±s)表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。
肉苁蓉多糖活性测定结果如图4所示，肉苁蓉多糖在0.5mg/mL的浓度下可能抑制Cocl2诱导的带有HRE报告基因的荧光素酶的活性，证明其具有潜质的抗氧化活性。
实施例8肉苁蓉多糖可抑制结肠癌CT26-CAF的生长
肿瘤相关成纤维细胞系CT26-CAF由中国科学院生物物理研究所构建。将细胞接种于96孔板，细胞密度为1×104/孔。将实施例1中的肉苁蓉多糖溶于DMEM+/+培养基中，使其浓度为1.0mg/mL。培养4天，采用CCK检测试剂盒（北京庄盟生物公司）测定细胞生长状态。每种多糖样本量为3。
统计学分析：计量数据多组间比较采用方差分析，首先对数据进行方差齐性检验，计算Levene统计值，若方差齐，则进行组间多重比较，方法为LSD和Dunnett，若方差不齐，则采用校正方法Dunnettt。统计软件为SPSS17.0，显著性水平为α=0.05。
实验结果如图5所示，该肉苁蓉多糖在0.5mg/mL的浓度下可显著抑制结肠癌CT26-CAF的生长。CT26-CAF在结肠癌起着重要调控作用，可促进结肠癌细胞的生长。该多糖可通过抑制结肠癌CT26-CAF的生长，起到调节结肠癌微环境的功效。目前CAF正成为肿瘤治疗的靶点。还有研究发现，依靠清除掉肿瘤微环境中的CAF，就具有导致某些肿瘤消退的功效，因此，该多糖通过调节肿瘤微环境，显示了潜在的辅助抗肿瘤价值。
综上实验证明本发明中的肉苁蓉多糖可通过抑制肿瘤新生血管生成、免疫抑制、抗氧化及抑制结肠癌成纤维细胞生长等多途径调节肿瘤微环境，并进一步发挥潜在的抗结肠癌肿瘤活性，从而可以将肉苁蓉多糖通过常规工艺，制成药剂学上所说的多种剂型，用于制备具有辅助抑制结肠癌功效的功能食品，功能食品的剂型可以为胶囊型、片剂、粉剂、颗粒剂或口服液等。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。
Claims (6)
1.肉苁蓉多糖在制备具有辅助抑制结肠癌功效的功能食品中的应用；
所述的肉苁蓉多糖具体通过以下方法制备获得：以肉苁蓉为原料，用沸水多次提取后，合并提取液，将提取液浓缩得浓缩液，在浓缩液中加入三氯乙酸水溶液进行去蛋白处理，去蛋白后将反应液进行中和、扎袋透析处理，将透析袋内反应液进行浓缩、离心处理，取上清液加入乙醇进行醇沉、干燥处理，即得肉苁蓉多糖；
透析时透析袋的截留分子量为3500Da。
2.根据权利要求1所述的肉苁蓉多糖在制备具有辅助抑制结肠癌功效的功能食品中的应用，其特征是：所述的辅助抑制结肠癌功效是指通过抑制结肠癌肿瘤新生血管生成、免疫抑制、抗氧化及抑制结肠癌成纤维细胞生长功效，调节结肠癌肿瘤微环境，从而起到辅助抑制结肠癌功效。
3.根据权利要求1所述的肉苁蓉多糖在制备具有辅助抑制结肠癌功效的功能食品中的应用，其特征是：沸水提取时，提取次数为1~5次，每次提取时沸水的用量为肉苁蓉总质量的5~20倍，每次提取时间为1.5~5h。
4.根据权利要求1所述的肉苁蓉多糖在制备具有辅助抑制结肠癌功效的功能食品中的应用，其特征是：去蛋白时采用三氯乙酸水溶液，所述三氯乙酸水溶液的质量百分含量为35%，处理时间为3~6h。
5.根据权利要求1所述的肉苁蓉多糖在制备具有辅助抑制结肠癌功效的功能食品中的应用，其特征是：乙醇处理时采用体积百分含量为70~95%的乙醇水溶液。
6.根据权利要求1所述的肉苁蓉多糖在制备具有辅助抑制结肠癌功效的功能食品中的应用，其特征是：所述功能食品的剂型为胶囊型、片剂、粉剂、颗粒剂或口服液。
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