CN101721405B - 二乙酰化黄芩素在制备治疗或预防肝脏疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种二乙酰化黄芩素在制备治疗或预防肝脏疾病药物中的应用，它为临床治疗肝脏疾病提供更多的用药选择。本发明使二乙酰化黄芩素在制备治疗肝脏疾病药物中的应用得以实现。其对多种急、慢性肝损伤均有较好的治疗和保护作用，并可抑制、改善肝纤维化，且在治疗和预防肝脏疾病方面比黄芩苷具有更为显著的功效。

Description

二乙酰化黄芩素在制备治疗或预防肝脏疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及化合物医药用途，具体地说是二乙酰化黄芩素制药领域中的应用。

背景技术

二乙酰化黄芩素为黄芩苷的衍生物。黄芩苷是临床上常用的用于治疗感冒疾病的药物，在中国也常用于治疗肝炎。其对急性黄疸型、急性无黄疸型及慢性肝炎均有明显疗效。但也有研究表明黄芩苷口服给药吸收较慢，生物利用度低(详见黄芩苷的吸收及药动学研究进展·王玉英·中国现代实用医学杂志·2005年4卷9期)。为寻求更理想的同类药物，人们一直在对类似化合物进行深入研究，但目前尚未有所收获。

发明内容

本发明的目的就是要提供一种比黄芩苷效果更好的同类药物，同时为临床治疗或预防肝脏疾病提供更多的用药选择。

本发明的目的是这样实现的：

本发明使二乙酰化黄芩素在制备治疗或预防肝脏疾病药物中的应用得以实现。其对多种急、慢性肝损伤均有较好的治疗和保护作用，并可抑制、改善肝纤维化，且在治疗和预防肝脏疾病方面比黄芩苷具有更为显著的功效。因而本发明提供了一种比黄芩苷效果更好的同类药物，同时为临床治疗肝脏疾病提供了一种新的用药选择。

本发明所述的二乙酰化黄芩素，其化学结构如下：

其制备方法包括有以下步骤：

a、以黄芩苷为原料，加葡萄糖醛酸水解酶，在10—80℃条件下，保温1-4天；过滤，沉淀物用水洗涤、干燥，得黄芩素；其中葡萄醛酸水解酶的用量最好为原料量的0.1-10倍。

b、以黄芩素为原料，加醋酐乙酰化，沉淀物用水洗涤、干燥，得二乙酰化黄芩素。

本发明所述二乙酰化黄芩素可用于治疗和预防急慢性肝炎、肝硬化等肝脏疾患。

本发明所述二乙酰化黄芩素在用于治疗肝脏疾病时，可经口服或不经口服给药，给药量也因剂型不同而各有不同，对成年人来说，口服用药每天200～900mg比较适宜。肌注或静脉注射用药每天50～100mg比较适宜。

本发明的有益效果通过以下实验得到了验证。

1材料

试验药物

二乙酰化黄芩素：白色粉末，纯度≥95％；黄芩苷：黄色粉末，纯度≥95％，承德中药集团雾灵药业有限公司产品。联苯双酯滴丸，规格1.5mg/丸，浙江温岭制药厂产品。

动物

ICR小鼠(二级)，雌雄兼用，体重18-22g，Wistar大鼠(二级)雌雄兼用，体重180-220g，均购自北京维通利华实验动物有限公司，合格证号：SCXK11-00-0008。

试剂

血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定试剂盒，天门冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒，血清总蛋白(TP)测定试剂盒(双缩脲法)，血清白蛋白(ALB)测定试剂盒(溴甲酚氯法)，血清唾液酸(SA)快速测定法试剂盒，以上为重庆医学检验试剂研究所产品；羟脯氨酸(Hyp)试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。

四氯化碳(CCl₄)，AR级，500ml/瓶，西安化学试剂厂产品。D-氨基半乳糖：白色粉末，纯度≥90％，北京科技协作中心粗细化学分部产品，临用时以生理盐水配成10％溶液(pH7.4)。十二烷基磺酸钠(SDS)，进口分装，上海试剂一厂经营公司供应。2，4，6三硝基氯苯(PC)，日本东京化成工业株式会社产品。环磷酰胺(Cy)，片剂50mg/片，南通第二制药厂产品。

2方法与结果

2.1对小鼠四氯化碳急性肝损伤的影响

小鼠随机分成7组，每天灌胃给药1次连续4日，末次给药1h后，按10ml/kg一次性腹腔注射0.1％CCl₄(液体石蜡研磨成乳剂)造模，造模后16h，摘眼球收集血液，分离血清，按试剂盒说明测定ALT、AST。每只动物测定肝脏系数[肝脏系数＝肝脏重量(mg)/体重(g)]，并取肝左叶固定于10％福尔马林液，常规石蜡包埋切片5μm，HE染色，光镜观察(肝损伤组织病理学评分标准：0，未见明显病变；1，肝细胞水肿变性、胞浆疏松；2，肝细胞散在的点灶状坏死；3，肝细胞片块状坏死，范围<肝小叶1/3；4，肝细胞片块状坏死，范围≥肝小叶1/3)。结果见表1

表1对小鼠CCl₄急性肝损伤的影响(x±s，n＝10)

与正常对照组比较^##P<0.01

与模型对照组比较^*P<0.05，^**P<0.01

由表1可见，模型组血清ALT、AST显著升高，肝脏表面粗糙、呈黄白色，水肿明显，肝脏系数增大，肝组织变性、坏死明显；二乙酰化黄芩素100mg/kg对CCl₄所致血清转氨酶升高以及肝组织水肿、变性、坏死均有明显对抗作用，且作用优于同等剂量的黄芩苷。

2.2对小鼠D-氨基半乳糖急性肝损伤的影响

小鼠随机分成7组，每天灌胃给药1次，连续4天，末次给药后1h小鼠一次性腹腔注射D-氨基半乳糖1000mg/kg(正常对照组注射等容量盐水)，24h后摘眼球取血测定血清ALT、AST，同前法测定肝脏系数、进行肝组织病检，结果见表2。

表2对小鼠D-氨基半乳糖急性肝损伤的影响(x±s，n＝10)

与正常对照组比较^##P<0.01

与模型对照组比较^*P<0.05，^**P<0.01

由表2可见，二乙酰化黄芩素100mg/kg对D-氨基半乳糖所致小鼠血清转氨酶升高以及肝组织水肿、变性、坏死均有明显对抗作用。

2.3对大鼠CCl₄亚急性肝损伤的影响

大鼠随机分为7组。除正常对照外，其余各组动物用15％CCl₄液体石蜡灌胃2ml/kg，以后每隔3d(72h)用该剂量CCl₄造模1次，共计4次。在首次造模当日开始灌胃给药，每天1次，连续13d，末次造模后16h摘眼球取血测定ALT、AST、TP、ALB，同前法测定肝脏系数、作肝损伤组织病理学观察。另作高碘酸Schiff反应(PAS)染色切片，显示肝组织糖原(肝组织内糖原含量以半定量记分方法表示：0，阴性反应，1，弱阳性；2，阳性；3，强阳性)结果见表3。

表3对大鼠亚急性肝损伤的影响(x±s，n＝10)

与正常对照组比较^##P<0.01

与模型对照组比较^*P<0.05，^**P<0.01

二乙酰化黄芩素在所试剂量范围内对CCl₄所致亚急性大鼠血清转氨酶升高以及肝组织变性、坏死有明显的对抗作用，并且可以抑制肝组织内糖原的丢失，升高肝损伤大鼠血清白蛋白含量。且二乙酰化黄芩素的作用优于同等剂量的黄芩苷。

2.4对2，4，6三硝基氯苯致小鼠迟发型变态免疫性肝损伤的影响

动物分为7组。实验前剪去小鼠腹部毛发，实验第1d用大剂量Cy150mg/kg腹腔注射处理小鼠。实验第4d、第9d用1％PC乙醇液100μl外涂腹部致敏。第15d用0.5％PC橄榄油溶液10μl肝穿刺攻击诱发肝内迟发型变态反应(PC DTH)。正常对照组动物用不含PC的等体积溶媒致敏、攻击。药物组于首次致敏(实验第4d)当日开始灌胃给药，每天1次，连续12d。攻击18·h后眼眶采血测定ALT，取肝脏测定肝脏系数，并取肝组织作HE染色切片，同前法光镜观察肝组织病理改变，结果见表4。

表4对小鼠PC DTH肝损伤模型的影响(x±s，n＝10)

与正常对照组比较^##P<0.01

与模型对照组比较^*P<0.05，^**P<0.01

二乙酰化黄芩素所试3个剂量可以显著抑制PC DTH肝损伤小鼠血清ALT的升高，高剂量组可明显对抗该模型肝组织的变性、坏死。表明二乙酰化黄芩素对IV型变态反应介导的免疫性肝损伤有明显保护作用。且二乙酰化黄芩素的作用优于同等剂量的黄芩苷。

2.5对大鼠CCl₄慢性肝损伤(肝纤维化)的影响

Wistar大鼠70只，雄性，体重150-200克，按体重随机分为7组，10％CCl₄液体石蜡皮下注射5ml/kg造模(正常对照注射等容积液体石蜡)，每周两次，连续12周。药物治疗从第9周起开始灌胃给药，每天1次，连续4周。末次给药24h后眼眶取血测定血清ALT、TP、ALB、SA。断头处死大鼠，测定肝脏系数。取部分肝脏，用冷生理盐水冲洗后制备成10％的肝匀浆，消化法测定Hyp含量。另取肝左叶置于10％福尔马林固定，常规石蜡包埋切片5μm，HE染色作病理组织学检查，并作VG特殊染色显示肝组织内胶原纤维。慢性肝损伤(肝纤维化)组织学评分标准：0，无明显病变；1，胶原纤维从汇管区或中央静脉向外延伸；2，胶原纤维延伸明显，但尚未相互连结包绕整个肝小叶；3，胶原纤维延伸连结，包绕整个肝小叶；4，胶原纤维包绕分割肝小叶，正常肝小叶结构破坏，假小叶形成以六方形为主；5，肝小叶完全破坏，假小叶形成以小圆形为主，假小叶间可见粗大增大的胶原纤维。结果见表5。

表5对大鼠CCl₄慢性肝损伤(肝纤维化)的影响(x±s)

与正常对照组比较^##P<0.01

与模型对照组比较^*P<0.05，^**P<0.01

二乙酰化黄芩素在所试剂量范围内对CCl₄所致大鼠慢性肝损伤模型有明显治疗作用，可显著降低血清ALT、AS和Hyp的含量，对肝组织纤维化有明显对抗作用。高剂量组对该模型低蛋白血症有明显改善作用。且二乙酰化黄芩素的作用优于同等剂量的黄芩苷。

上述实验表明，二乙酰化黄芩素对CCl₄、D-氨基半乳糖所致小鼠急性肝损伤血清转氨酶升高以及肝组织水肿、变性、坏死均有明显对抗作用。对CCl₄所致亚急性、慢性大鼠肝损伤也有明显的对抗作用，可以抑制肝内糖原丢失，抑制肝纤维化，对肝纤维化模型低蛋白血症有明显改善作用。还可以显著抑制PCDTH肝损伤小鼠血清ALT的升高，二乙酰化黄芩素100mg/kg组可明显对抗该模型肝组织的变性、坏死。

上述实验同时表明，二乙酰化黄芩素的各项作用均强于同等剂量的黄芩苷。

由此可见，二乙酰化黄芩素对多种急、慢性肝损伤均有较好的治疗保护作用，并且可抑制肝纤维化，改善肝纤维化的多项病理指标。

本发明所述二乙酰化黄芩素与常规的药用辅剂如赋形剂、崩解剂、黏合剂、润滑剂、抗氧化剂、包衣剂、着色剂、芳香剂、表面活性剂等混合，可将其制成颗粒剂、胶囊剂、片剂的等口服制剂。也可按照采用常规制剂技术制备成注射液、输液剂等制剂。

具体实施方式

下面的制剂实施例可更详细地说明二乙酰化黄芩素在制备治疗肝脏疾病药物中的应用，但不以任何形式限制本发明。

实施例1：

二乙酰化黄芩素的制备：

(a).黄芩素的制备：黄芩苷一公斤，溶于升30升水中，加入葡萄糖醛酸水解酶0.3公斤，在50℃保温搅拌4天，过滤，沉淀用水洗涤后干燥，得黄芩素(0.6公斤)。

黄芩素的鉴定：质谱EI-MS：m/z270[M]⁺；紫外光谱max(MeOH)nm：277，315；mp.273-275.

核磁共振氢谱1H-NMR(dmso-d6)：12.64(1H，s，5-OH)，10.55(1H，7-OHs)，8.80(1H，s，6-OH)，8.04(2H，d，J＝6.0Hz，H-2’，6’)，7.56(3H，m，H-3’，4’，5’)，6.92(1H，s，H-3)，6.61(1H，s，H-8).

核磁共振碳谱13C-NMR(dmso-d6)：182.1(C-4)，162.8(C-2)，153.6(C-7)，149.8(C-9)，147.0(C-5)，131.7(C-4’)，131.0(C-1’)，129.3(C-6)，129.0(C-2’，6’)，126.2(C-3’，5’)，104.4(C-3)，104.2(C-10)，94.0(C-8)。

这些数据与文献(滇黄芩化学成分的分离与鉴定；沈阳药科大学学报，Vol.20，No.3，pp.181-183，2003)报道的黄芩素数据一致，证明在实施例1(a)中得到的化合物为黄芩素。

(b).二乙酰化黄芩素的制备：

黄芩素10g，加入100ml乙酸酐中，搅拌，反应温度50℃，3小时后终止反应。水洗，抽滤，沉淀干燥后得二乙酰化黄芩素产品12g。

二乙酰化黄芩素的鉴定：质谱EI-MS：EI-MSm/z(rel.int.％)：270(100)，312(23)，241(8)，168(16)，139(10)，69(28)，43(45)；紫外光谱max(MeOH)nm：269，299.

¹HNMR(300MHz)and¹³CNMR(75MHz)data(CDCl₃)

这些数据与文献(J.Med.Chem.，2004，47：5555-5566)报道的二乙酰化黄芩素数据一致，证明在实施例1(b).中得到的化合物为二乙酰化黄芩素。

实施例2：

二乙酰化黄芩素口服液：

将5000mg二乙酰化黄芩素，溶于1000ml水中，制成0.5％浓度的水溶液，调节pH至6-6.5，加热溶解，混合均匀，装入20ml药瓶中，封口、消毒。

服用方法：口服，每日服用二乙酰化黄芩素100-300mg。

实施例3：

二乙酰化黄芩素注射液：

取二乙酰化黄芩素2000mg，溶于1000ml水中，制成水溶液，调节pH至6-6.5，加热溶解，混合均匀，分装成20mg/10ml/支的注射液，蒸汽流通灭菌30分钟。

用法用量：肌注或静脉注射，每日50-100mg。

实施例4：

二乙酰化黄芩素片剂：

取二乙酰化黄芩素2000g，按公知片剂制备方法，加入淀粉，糊精、硬酯酸镁等，混合制成湿粒，机器冲压成片，每片含二乙酰化黄芩素100mg。

用法用量：口服，每日2—3次，每次100mg-300mg。

本发明在制药领域中的应用，完全不局限于此，例如：二乙酰化黄芩素还可引入药学上可以接受的盐类，如二乙酰化黄芩素磷酸盐，二乙酰化黄芩素盐酸盐，二乙酰化黄芩素硫酸盐等等。

本发明的药物剂型也完全不限于此，它可以制备成更多的剂型，如滴丸、胶囊剂、软胶囊剂、缓控释制剂等等。

Claims (2)

1.二乙酰化黄芩素在制备治疗急、慢性肝损伤药物中的应用，其中所述的二乙酰化黄芩素的化学结构如下：

2.二乙酰化黄芩素在制备抑制、改善肝纤维化药物中的应用，其中所述的二乙酰化黄芩素的化学结构如下：