CN105878362A - 龙胆环烯醚萜总苷在制备治疗肝损伤药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属中药制药技术领域,涉及中药有效部位龙胆环烯醚萜总苷。本发明通过碱沉工艺制得主要含龙胆苦苷及獐牙菜苷、獐牙菜苦苷的龙胆环烯醚萜总苷;经动物实验结果显示,所述的龙胆环烯醚萜总苷能明显抑制乙型病毒性肝炎谷丙转氨酶和谷草转氨酶的升高,且具有明显量效关系,对实验鼠肝损伤具有明显的保护作用,其效果明显优于单一成分龙胆苦苷及阳性对照药物联苯双酯,本龙胆环烯醚萜总苷毒性明显低于非碱沉工艺制备的龙胆环烯醚萜总苷及龙胆苦苷单体。该龙胆环烯醚萜总苷可作为活性成分制备治疗肝损伤药物,并进一步制成片剂、胶囊、纳米粒、脂质体、注射剂、透皮贴剂用于临床。
Description
技术领域
本发明属中药制药技术领域,涉及中药有效部位龙胆环烯醚萜总苷,具体涉及通过碱沉工艺制备的龙胆环烯醚萜总苷及其在制备治疗肝损伤药物中的用途。
背景技术
研究报道了常见的肝损伤的原因有病毒性肝炎、化学药物中毒、酒精性肝病、肝郁血等。肝病时,肝细胞的损害是肝脏病理改变的关键,因此,通过保护肝细胞,减轻肝细胞的损伤抑制肝脏病变的进展,通过肝细胞的再生对病变肝脏进行修复,是肝损伤治疗的重点。临床治疗方案主要包括:通过药物直接消除病因(如抑制肝炎病毒)、调整免疫功能(减轻免疫性肝损伤,加强免疫保护)、抗炎以及减轻肝脏负荷等;其中抗病毒类化学药物占据着重要地位,主要包括两大类:直接抗病毒药和免疫增强剂有:(1)直接抗病毒药如拉米夫啶(贺普丁)、恩替卡韦等核苷类似物是临床主要应用的药物;“贺普丁”(葛兰素史克公司)是核苷类似物的代表,虽然其疗效确切,但实践显示其并不能清除乙肝病毒,停药后复发率高,长期应用可导致乙肝病毒变异,患者出现肝功能及病毒学指标的反复,甚至可能发生肝功能衰竭,是此类药物的致命缺陷;免疫增强剂包括:α干扰素和胸腺肽等;干扰素的优点是在抗病毒的同时还可以提高人体自身的免疫力,作用较持久,停药以后不会出现病毒变异,但其缺点是抗病毒作用较弱,而毒副作用较多,除了可能引起流感样症候群之外,还可引起白细胞、血小板减少,且有脱发、抑郁等情况发生,同时,其价格较高,一般患者难以承受。
中国中医研究院的有关“中医药的优势领域”研究课题表明,中药在防治肝病方面优势明显,与化学药物相比主要集中在抗病毒不同,多数中药产品在保肝护肝、抗病毒、增强免疫、抗炎等方面发挥综合疗效,对HBsAg等指标的阴转率与干扰素相近(约10%~30%),并能有效地改善症状体征,副作用少、医疗费用较低且使用方便,因此中医药疗法仍然是目前治疗乙肝患者及无症状病毒携带者的主要方法之一。
目前,被SFDA批准上市的中药肝病治疗药物主要产品包括五仁醇、联苯双酯、甘草酸锌、水飞蓟宾等单一成分,除此之外还有不下数百种复方。虽然中药在肝炎的症状减轻及治疗中起到了积极作用,但由于其中多数只能通过单一抑制谷丙氨基转移酶的升高来治疗乙型肝炎。但在乙型肝炎的临床诊断中,最重要的指标包括谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST或GOT)两项,因此单一针对其中ALT进行治疗难以获得真正满意的疗效,这也是目前中药治疗乙型肝炎多处于辅助用药地位的重要原因之一。与本发明相关的现有技术有;1,龙胆苦苷在制备抑制乙型肝病毒炎药物中的应用(授权公告号CN 1259054C),2,含龙胆总甙中药制剂在制备治疗重症肝炎药物中的应用(授权公告号CN 1202839C)等;此外中药复方仍然存在组方复杂、有效成分不明、作用机理不清、质量控制不严、剂型落后等问题,整体而言,影响了治疗肝病中药制剂的发展和推广应用。其中以龙胆泄肝汤为代表的方剂在临床已经具有多年应用于乙肝治疗的基础,但其真正有效的物质基础、作用机理、作用方式以及成分配比都没有十分明确。因此本申请的发明人应用现代科学技术对龙胆进行不同有效部位,不同配比的提取、分离、纯化同时开展药理及毒理学研究的基础上,拟提供一种有效治疗肝损伤的中药制剂,尤其是提供龙胆环烯醚萜总苷在制备治疗肝损伤药物中的用途。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷,提供中药有效部位龙胆环烯醚萜总苷及其在制药中的新的用途,尤其涉及通过碱沉工艺制备的龙胆环烯醚萜总苷及其在制备治疗肝损伤药物中的用途。
本发明公开了一种碱沉工艺制备的龙胆环烯醚萜总苷及其在制备治疗肝损伤药物中的用途;龙胆环烯醚萜总苷能明显抑制谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST或GOT)升高。
本发明所述的龙胆环烯醚萜总苷是从我国传统龙胆、秦艽中提取精制的有效部位,其制备方法主要是提取后通过采用大孔吸附树脂精制得到主要含龙胆苦苷及一定比例的獐牙菜苷、獐牙菜苦苷等裂环环烯醚萜苷类化合物的有效部位。
具体而言,本发明提供了龙胆环烯醚萜总苷,其中龙胆苦苷含量在50%-80%之间,獐牙菜苦苷含量在0.67%-10%之间,其中优选獐牙菜苦苷含量1-6%,獐牙菜苷含量在0.48-8%之间,优选獐牙菜苷含量1-4%。
本发明的龙胆环烯醚萜总苷通过通过碱沉工艺按下述方法制备:
取龙胆药材去杂质,制成小段,然后加入6倍-12倍70%乙醇溶媒提取3次,每次1h,合并提取液,减压回收乙醇至密度1.1-1.2g/ml,得浓缩液;向浓缩液中加入95%乙醇调节至乙醇浓度80%,静置醇沉;取醇沉上清液回收乙醇至密度1.1-1.2g/ml,得浓缩液,过滤;向滤液中加入NaOH,调节pH至7.0-9.0进行碱沉工艺处理,离心去除沉淀;上清液上大孔吸附树脂,用2BV体积水洗脱,弃去水洗液,然后用20%乙醇洗脱,收集洗脱液至无色、合并,减压浓缩至相对密度1.1-1.2,50-60℃减压干燥48h,粉碎,制成干粉,即得。
本发明中,碱沉工艺条件pH值优选为8.0;
本发明中,在加入碱过程中优选快速搅拌方式,防止局部pH过高引起有效成分损失;
本发明中,pH调节剂选自NaOH、NaHCO3、Na2CO3、KOH、KHCO3或K2CO3等可药用的碱;
本发明中,所述的大孔吸附树脂优选HPD300。
本发明对通过碱沉工艺制得的龙胆环烯醚萜总苷中间体指标成分进行了稳定性考察,结果如表1所示。
表.1十批龙胆环烯醚萜总苷中间体指标成分稳定性考察
本发明将上述方法制得的龙胆环烯醚萜总苷进行了动物实验,结果显示,所述的龙胆环烯醚萜总苷能明显抑制乙型病毒性肝炎谷丙转氨酶和谷草转氨酶的升高,且具有明显量效关系,对实验大鼠及小鼠肝损伤均具有明显的保护作用,本发明的一个实施例中结果显示,所述的龙胆环烯醚萜总苷在降低四氯化碳致小鼠急性肝损伤、D-半乳糖致大鼠慢性肝损伤所致ALT、AST水平升高方面明显优于单一成分龙胆苦苷及阳性对照药物联苯双酯,本发明方法制备的龙胆环烯醚萜总苷毒性明显低于非碱沉工艺制备的龙胆环烯醚萜总苷及龙胆苦苷单体。
本发明的龙胆环烯醚萜总苷可作为活性成分制备治疗肝损伤药物,并进一步加入药物辅料制成片剂、胶囊、纳米粒、脂质体、注射剂、透皮贴剂等任何一种临床常用的剂型。
附图说明
图1是十批龙胆环烯醚萜总苷中间体指纹图谱。
图2是不同工艺提取精制的中药材龙胆有效部位指纹图谱,其中,
A:碱沉工艺得到的提取物指纹图谱,
B:非碱沉工艺得到的提取物的指纹图谱。
图3是实施例1的实验动物肝脏病理切片,其中,
A:模型对照组肝脏,肝小叶中央性肝细胞凝固性坏死。;B:龙胆环烯醚萜总苷低剂量组肝脏,肝小叶中央肝细胞气球样变;C:龙胆环烯醚萜总苷中剂量组肝脏,肝细胞弥漫性肿胀,部分细胞出现气球样变;D:(放大倍数:100×)龙胆环烯醚萜总苷高剂量组肝脏,肝细胞弥漫性肿胀,部分细胞出现气球样变。
图4是实施例2的实验动物肝脏病理切片,其中,
A:模型对照组肝脏,肝小叶中央性肝细胞凝固性坏死;B:低剂量组,部分细胞出现气球样变;C:中剂量组肝细胞弥漫性肿胀;D:高剂量组,肝细胞弥漫性肿胀。
图5实施例3的实验动物肝脏病理切片,其中,
A:模型对照组肝脏,肝细胞中度脂肪变,肝脏内局灶坏死灶,慢性炎细胞浸润,嗜酸性小体形成;B:低剂量组,肝小叶中央性肝细胞凝固性坏死。肝细胞弥漫性中度脂肪变(++);C:中剂量组肝细胞弥漫性肿胀,,部分细胞脂肪变±;D:高剂量组,肝细胞弥漫性肿胀并弥漫性轻度脂肪变(+)。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步解释本发明,但绝不是对本发明的限制。
实施例1
取龙胆科植物条叶龙胆(Gentiana manshurica Kitag.)干燥根及根茎,洗净,切制成饮片,经70%乙醇加热回流提取两次,每次1h,溶剂用量分别为10倍、8倍,合并两次提取液,减压回收溶剂,浓缩后离心;加入NaOH快速搅拌,调节pH至8.5进行碱沉,离心出去沉淀,然后将上清液上于经预处理的AB-8型大孔树脂,上样量40mg/mL,依此用3倍蒸馏水及30%乙醇洗脱,收集30%洗脱部分,喷雾干燥,得龙胆环烯醚萜总苷固体粉末,经HPLC检测,其中龙胆苦苷含量为78.96%,獐牙菜苷含量为1.32%,獐牙菜苦苷含量为3.72%;
将制得的龙胆环烯醚萜总苷(供试品)于纯净水中溶解,制成混悬液,进行龙胆环烯醚萜总苷预防性给药试验,以龙胆苦苷含量计算,分别按高、中、低剂量给予SPF级小鼠,对照组给予联苯双酯0.2g/kg,龙胆苦苷(含量>98%)0.3g/kg,连续给药4天,于第4天给药后除阴性对照组外,其余各组小鼠均腹腔注射0.2%四氯化碳油溶液,0.2ml/鼠,阴性对照组给予等容积溶剂,随后禁食18小时,然后眼眶取血进行血清生化学检查(如表2所示),
表2.龙胆环烯醚萜总苷对0.3%四氯化碳致急性肝损伤小鼠血.清ALT、AST的影响
其中:与阴性对照组比较,*代表P<0.05,**代表P<0.01;
与模型对照组比较,#代表P<0.05,##代表P<0.01;
与联苯双酯对照组比较,△代表P<0.05,△△代表P<0.01;
与LDZG中剂量比较,■代表P<0.05,■■代表P<0.01;
与LDZG高剂量比较,▲代表P<0.05,▲▲代表P<0.01;
与LDZG低剂量比较,□代表P<0.05,□□代表P<0.01;
并作肝脏病理组织学检查,结果如图3所示,其中,
ALT:供试品低、中、高剂量组小鼠血清ALT分别与模型对照组比较,均有不同程度的降低,两组之间的差异均具有统计学意义(低剂量:P=0.001<0.01;中剂量:P=0.001<0.01;高剂量:P=0.000<0.01),说明供试品低、中、高剂量均可使0.3%四氯化碳致急性肝损伤小鼠升高的血清ALT水平降低;供试品低、中剂量组小鼠血清ALT分别与供试品高剂量组比较,两组之间的差异均具有统计学意义(低剂量:P=0.029<0.05;中剂量:P=0.049<0.05),说明供试品高剂量在使0.3%四氯化碳致急性肝损伤小鼠升高的血清ALT水平降低方面优于供试品中、低剂量。阳性药(联苯双酯)组小鼠血清ALT与模型对照组比较,ALT水平明显降低,两组之间的差异具有统计学意义(P=0.000<0.01),说明阳性药(联苯双酯)可使0.3%四氯化碳致急性肝损伤小鼠升高的血清ALT水平降低,这与联苯双酯所公开信息一致;阳性药(联苯双酯)组小鼠血清ALT分别与供试品三个剂量组比较,两组之间的差异均不具有统计学意义(低剂量:P=1.000>0.05;中剂量:P=1.000>0.05;高剂量:P=0.137>0.05),说明供试品在使0.3%四氯化碳致急性肝损伤小鼠升高的血清ALT水平降低方面与阳性药(联苯双酯)作用相当;
龙胆苦苷与对照组比较,两组之间差异不具有统计学意义(P=1.000,>0.05),说龙胆苦苷在使0.3%四氯化碳致急性肝损伤小鼠升高的血清ALT水平方面与联苯双酯相当;供试品低剂量组与龙胆苦苷组比较,两组之间的差异不具有统计学意义(P=0.161,>0.05),说明供试在使0.3%四氯化碳致急性肝损伤小鼠升高的血清ALT水平方面与龙胆苦苷相当;
AST:供试品低、中、高剂量组小鼠血清AST分别与模型对照组比较,均有不同程度的降低,两组之间的差异均具有统计学意义(低剂量:P=0.000<0.01;中剂量:P=0.000<0.01;高剂量:P=0.000<0.01),说明供试品低、中、高剂量均可使0.3%四氯化碳致急性肝损伤小鼠升高的血清AST水平降低。阳性药(联苯双酯)组小鼠血清AST与模型对照组比较,两组之间的差异不具有统计学意义(P=1.000>0.05),说明阳性药(联苯双酯)不能使0.3%四氯化碳致急性肝损伤小鼠升高的血清AST水平降低,联苯双酯所公开的信息未提到它可以使0.3%四氯化碳致急性肝损伤小鼠升高的血清AST水平降低;阳性药(联苯双酯)组小鼠血清AST分别与供试品三个剂量组比较,两组之间的差异均具有统计学意义(低剂量:P=0.022<0.05;中剂量:P=0.011<0.05;高剂量:P=0.001<0.01),说明供试品在使0.3%四氯化碳致急性肝损伤小鼠升高的血清AST水平降低方面明显优于阳性药(联苯双酯);
供试品低剂量组与龙胆苦苷组比较,两组之间的差异不具有统计学意义(P=0.188,>0.05),说明供试在使0.3%四氯化碳致急性肝损伤小鼠升高的血清AST水平方面与龙胆苦苷相当;
病理检查:阴性对照组中出现的肝细胞局灶性坏死,中性粒细胞浸润,嗜酸性小体形成的改变在供试品低剂量组中也可见,并且此种改变的比例很低,故认为这种改变是本批小鼠肝脏背景性改变;
模型对照组与阴性对照组相比,出现明显的肝小叶中央性肝细胞凝固性坏死及程度加重的肝细胞脂肪变,两者之间有明显差异;
与模型对照组相比,供试品各剂量组间出现剂量相关性的肝小叶中央性肝细胞凝固性坏死程度减轻、脂肪变程度减轻,且出现广泛的肝细胞水肿,肝细胞水肿为轻微的可逆性的改变,故认为其病变程度轻微;
阳性药物对照组与模型对照组相比,可见肝小叶中央性肝细胞凝固性坏死的比例稍降低,脂肪变程度稍减轻;
结果表明龙胆环烯醚萜总苷低、中、高剂量均能降低0.3%四氯化碳致肝损伤小鼠血清ALT、AST的水平,且在降低血清ALT方面的作用与阳性对照药(联苯双酯)相当,在降低血清AST方面的作用明显优于阳性对照药(联苯双酯);病理切片显示供试品组全肝弥漫性水肿及肝细胞气球样变的比例增加而引起,因此认为龙胆环烯醚萜总苷可减少肝脏组织坏死区面积,或使肝脏组织的坏死转变为可逆性改变,从而认为减轻肝损伤的效果更加明显,具有对肝损伤的预防作用。
实施例2
取龙胆科植物坚龙胆(Gentiana rigescens Franch.)干燥根及根茎200kg,经洗净,切制成饮片,经70%乙醇加热回流提取两次,每次1h,溶剂用量分别为10倍、8倍,合并两次提取液,减压回收溶剂,浓缩后离心,加入Na2CO3快速搅拌,调节pH至8.0碱沉,过滤除去沉淀。将上清液上于经预处理的D101型大孔树脂,上样量50mg/mL,依此用3倍蒸馏水及2倍20%乙醇洗脱,收集20%洗脱部分,喷雾干燥,得龙胆环烯醚萜总苷有效部位固体粉末9.8kg,经HPLC检测,其中龙胆苦苷含量为65.70%,獐牙菜苷含量为1.13%,獐牙菜苦苷含量为1.54%,分装备用;
将制得的胆环烯醚萜总苷有效部位粉末(供试品)溶于蒸馏水,制备成混悬液,进行龙胆环烯醚萜总苷治疗性给药试验;试验除阴性对照组外,其余各组小鼠均于造模第1天小鼠右侧腹腔进行腹腔注射0.3%四氯化碳油溶液,10ml/kg(折合四氯化碳的剂量为48mg/kg BW),然后以龙胆苦苷含量计算,分别按高、中、低剂量给予小鼠,其余造模小鼠造模第2天起每天给予右侧腹腔进行腹腔注射0.15%四氯化碳油溶液,10ml/kg然后以龙胆苦苷含量计算,分别按高、中、低剂量给予小鼠,对照组给予联苯双酯0.2g/kg,龙胆苦苷(含量>98%)0.3g/kg,连续造模给药6天,阴性对照组均给予等容积溶剂(花生油),第6次给药后60分钟开始眼眶取血进行血清生化学检查(如表3所示),
表3各组小鼠血清ALT
其中:与阴性对照组比较,*代表P<0.05,**代表P<0.01;
与模型对照组比较,#代表P<0.05,##代表P<0.01;
与联苯双酯对照组比较,△代表P<0.05,△△代表P<0.01;
与LDZG中剂量比较,■代表P<0.05,■■代表P<0.01;
与LDZG高剂量比较,▲代表P<0.05,▲▲代表P<0.01;
并作肝脏病理组织学检查,结果如图4所示,其中,
ALT:供试品低、中、高剂量组小鼠血清ALT分别与模型对照组比较,均有不同程度的降低,两组之间的差异均具有统计学意义(低剂量:P=0.001<0.01;中剂量:P=0.006<0.01;高剂量:P=0.000<0.01),说明供试品低、中、高剂量均可使0.3%四氯化碳致肝损伤小鼠升高的血清ALT水平降低;供试品低、中剂量组小鼠血清ALT分别与供试品高剂量组比较,两组之间的差异均具有统计学意义(低剂量:P=0.012<0.05;中剂量:P=0.002<0.05),说明供试品高剂量在使0.3%四氯化碳致肝损伤小鼠升高的血清ALT水平降低方面优于供试品中、低剂量。阳性药(联苯双酯)组小鼠血清ALT与模型对照组比较,ALT水平明显降低,两组之间的差异具有统计学意义(P=0.0001<0.01),说明阳性药(联苯双酯)可使0.3%四氯化碳致肝损伤小鼠升高的血清ALT水平降低;阳性药(联苯双酯)组小鼠血清ALT分别与供试品三个剂量组比较,两组之间的差异均不具有统计学意义(低剂量:P=1.20>0.05;中剂量:P=1.11>1.05;高剂量:P=2.55>0.05),说明供试品在使0.3%四氯化碳致急性肝损伤小鼠升高的血清ALT水平降低方面与阳性药(联苯双酯)作用相当;
龙胆苦苷与对照组比较,两组之间差异不具有统计学意义(P=1.000,>0.05),说龙胆苦苷在使0.3%四氯化碳致急性肝损伤小鼠升高的血清ALT水平方面与联苯双酯相当;供试品低剂量组(0.175g/kg)与龙胆苦苷组(0.3g/kg)比较,两组之间的差异不具有统计学意义(P=1.000,>0.05),说明供试在使0.3%四氯化碳致急性肝损伤小鼠升高的血清ALT水平方面优于龙胆苦苷;
AST:供试品低、中、高剂量组小鼠血清AST分别与模型对照组比较,均有不同程度的降低,两组之间的差异均具有统计学意义(低剂量:P=0.000<0.01;中剂量:P=0.000<0.01;高剂量:P=0.000<0.01),说明供试品低、中、高剂量均可使0.3%四氯化碳致肝损伤小鼠升高的血清AST水平降低;供试品低、中剂量组小鼠血清AST分别与供试品高剂量组比较,两组之间的差异均具有统计学意义(低剂量:P=0.026<0.05;中剂量:P=0.023<0.05),说明供试品高剂量在使0.3%四氯化碳致肝损伤小鼠升高的血清ALT水平降低方面优于供试品中、低剂量。阳性药(联苯双酯)组小鼠血清AST与模型对照组比较,两组之间的差异不具有统计学意义(P=1.500>0.05),说明阳性药(联苯双酯)不能使0.3%四氯化碳致肝损伤小鼠升高的血清AST水平降低;阳性药(联苯双酯)组小鼠血清AST分别与供试品三个剂量组比较,两组之间的差异均具有统计学意义(低剂量:P=0.011<0.05;中剂量:P=0.021<0.05;高剂量:P=0.001<0.01),说明供试品在使0.3%四氯化碳致肝损伤小鼠升高的血清AST水平降低方面明显优于阳性药(联苯双酯);
供试品低剂量组与龙胆苦苷组比较,两组之间的差异不具有统计学意义(P=1.000,>0.05),说明供试在使0.3%四氯化碳致急性肝损伤小鼠升高的血清AST水平方面与龙胆苦苷相当;
病理检查:供试品低剂量组与模型组相比,可见肝小叶中央区坏死,坏死区面积较模型对照组减小,此外出现不同程度的肝细胞水肿,部分标本出现少量肝细胞气球样变;供试品中剂量组及供试品高剂量组与供试品低剂量组相比,可见肝脏坏死区进一步减少及几乎全肝的弥漫性水肿,肝细胞气球样变的比例增加;结果表明:小鼠肝损伤模型造模成功,阳性对照可减轻肝脏损伤程度,供试品各剂量组均可不同程度的减轻肝损伤,其中供试品中剂量组及供试品高剂量组减轻肝损伤,主要表现为细胞肿胀,细胞肿胀为一种可逆性的改变,因此认为供试品中剂量组及供试品高剂量组减轻肝损伤的效果更加明显;
结果表明,所述的龙胆环烯醚萜总苷低、中、高剂量均能降低0.3%四氯化碳致肝损伤小鼠血清ALT、AST的水平,且在降低血清ALT方面的作用与阳性对照药(联苯双酯)相当,在降低血清AST方面的作用明显优于阳性对照药(联苯双酯);病理切片认为供试品组全肝弥漫性水肿及肝细胞气球样变的比例增加而引起,因此认为龙胆环烯醚萜总苷可减少肝脏组织坏死区面积,或使肝脏组织的坏死转变为可逆性改变,从而认为减轻肝损伤的效果更加明显,具有对肝损伤的预防作用。
实施例3
取龙胆科植物秦艽(Gentiana macrophylla Pall.)干燥根及根茎200kg,经洗净,切制成饮片,经70%乙醇加热回流提取两次,每次1h,溶剂用量分别为10倍、8倍,合并两次提取液,减压回收溶剂,浓缩后离心。加入KOH后快速搅拌,调节pH至7.5碱沉,离心,除去沉淀。将上清液上于经预处理的HPD300型大孔树脂,上样量50mg/mL,依此用3倍蒸馏水及20%乙醇洗脱,收集20%洗脱部分,喷雾干燥,得龙胆环烯醚萜总苷固体粉末10.06kg,经HPLC检测龙胆苦苷含量为52.03%,獐牙菜苷含量为0.88%,獐牙菜苦苷含量为0.96%;
将所述的龙胆环烯醚萜总苷有效部位粉末(供试品)溶于蒸馏水,制备成混悬液,进行治疗性给药试验:SD大鼠雌雄各半,按体质量、性别随机分为:模型组:D-氨基半乳糖(160mL/L,5mL/kg);对照药组:D-氨基半乳糖+联苯双酯(0.2g/kg);D-氨基半乳糖+龙胆环烯醚萜总苷(500,250,120mg/kg)3个剂量组,对照组给予联苯双酯0.2g/kg,龙胆苦苷(含量>98%)0.3g/kg;各组动物于第1次给药的同时ip D-氨基半乳糖,阴性对照组注射等体积溶剂0.5mL/kg,最后1次给药后禁食,12h后摘眼球取血离心,测血清ALT、AST,同时做肝脏标本病理检查,结果如表4,图5所示;
表4LDZG制剂对D-氨基半乳糖致肝损伤大鼠血清ALT、AST的影响
其中:与阴性对照组比较,*代表P<0.05,**代表P<0.01;
与模型对照组比较,#代表P<0.05,##代表P<0.01;
与联苯双酯对照组比较,△代表P<0.05,△△代表P<0.01;
与LDZG中剂量比较,■代表P<0.05,■■代表P<0.01;
与LDZG高剂量比较,▲代表P<0.05,▲▲代表P<0.01;
ALT:与模型组比较,龙胆环烯醚萜总苷高、中、低剂量组ALT均具有显著性差异,表明龙胆环烯醚萜总苷可使半乳糖所致大鼠肝损伤的血清ALT水平降低;供试品低、中剂量组大鼠血清ALT分别与供试品高剂量组比较,两组之间的差异均具有统计学意义,说明供试品高剂量在使半乳糖致肝损伤大鼠升高的血清ALT水平降低方面优于供试品中、低剂量。阳性药(联苯双酯)组小鼠血清ALT与模型对照组比较,ALT水平明显降低,两组之间的差异具有统计学意义,说明阳性药(联苯双酯)可使半乳糖致肝损伤大鼠升高的血清ALT水平降低;阳性药(联苯双酯)组大鼠血清ALT与供试品组高剂量比较,两组间差异具有统计学意义,说明供试品在高剂量下使半乳糖致肝损伤大鼠升高的血清ALT水平降低方面优于阳性药(联苯双酯);阳性药分别与供试品低、中剂量组比较,两组之间的差异均不具有统计学意义,说明供试品在使半乳糖致肝损伤大鼠升高的血清ALT水平降低方面与阳性药作用相当;
龙胆苦苷与对照组比较,两组之间差异不具有统计学意义(P=1.000,>0.05),说龙胆苦苷在使半乳糖致肝损伤大鼠升高的血清ALT水平方面与联苯双酯相当;供试品低剂量组(0.175g/kg)与龙胆苦苷组(0.3g/kg)比较,两组之间的差异不具有统计学意义(P=1.000,>0.05),说明供试在使半乳糖致肝损伤小鼠升高的血清ALT水平方面优于龙胆苦苷;
AST:与模型组比较,龙胆环烯醚萜总苷高、中、低剂量组AST均具有显著性差异,表明龙胆环烯醚萜总苷可使半乳糖所致大鼠肝损伤的血清AST水平降低。供试品低、中剂量组大鼠血清AST分别与供试品高剂量组比较,两组之间的差异均具有统计学意义,说明供试品高剂量在使半乳糖致肝损伤大鼠升高的血清AST水平降低方面优于供试品中、低剂量。阳性药(联苯双酯)组小鼠血清AST与模型对照组比较,两组之间的差异不具有统计学意义,说明阳性药(联苯双酯)不能使半乳糖致肝损伤大鼠升高的血清AST水平降低;阳性药(联苯双酯)组小鼠血清AST分别与供试品三个剂量组比较,两组之间的差异均具有统计学意义,说明供试品在使半乳糖致肝损伤大鼠升高的血清AST水平降低方面优于阳性药(联苯双酯);
供试品低剂量组(0.175g/kg)与龙胆苦苷组(0.3g/kg)比较,两组之间的差异不具有统计学意义(P=1.000,>0.05),说明供试在使半乳糖致肝损伤小鼠升高的血清AST水平方面优于龙胆苦苷;
病理检查结果显示:模型组相比,肝细胞中度脂肪变,肝脏内局灶坏死灶,慢性炎细胞浸润,嗜酸性小体形成。低剂量组,部分细胞出现气球样变;C:中剂量组肝细胞弥漫性肿胀、气球样变,部分细胞脂肪变;D:高剂量组,肝细胞弥漫性肿胀并弥漫性轻度脂肪变;结果表明:大鼠肝损伤模型造模成功,供试品各剂量组均可不同程度的减轻肝损伤,其中供试品中剂量组及供试品高剂量组减轻肝损伤,主要表现为细胞肿胀及脂肪变,为一种可逆性的改变,因此认为供试品对D-半乳糖所致大鼠肝损伤具有明显的保护作用。
实施例4
取龙胆科植物抱茎獐牙菜(Swertia franchetiana H.Smith)干燥根及根茎200kg,经洗净,切制成饮片,经70%乙醇加热回流提取两次,每次1h,溶剂用量分别为10倍、8倍,合并两次提取液,减压回收溶剂,浓缩后离心,加入KHCO3调节pH8.8,快速搅拌,离心除去沉淀,将上清液上于经预处理的HPD300型大孔树脂,上样量50mg/mL,依此用3倍蒸馏水及10%乙醇洗脱,收集10%洗脱部分,喷雾干燥,得龙胆环烯醚萜总苷固体粉末9.5kg,经HPLC检测龙胆苦苷含量为86.91%,獐牙菜苷含量为5.88%,獐牙菜苦苷含量为9.66%。
将制得的龙胆环烯醚萜总苷(供试品)于纯净水中溶解,制备成混悬液;SD大鼠雌雄各半,肌肉注射以龙胆苦苷含量计算,分别按高、中、低剂量给予龙胆环烯醚萜总苷,对照组给予联苯双酯0.2g/kg,龙胆苦苷(含量>98%)0.3g/kg,正常组和模型组给予同体积生理盐水,于第2次给药后除正常组外,其余各组按照50m g/kg剂量ip给予硫代乙酰胺,禁食,第3日给药后1h摘眼球取血,测量血清ALT及AST值结果如表5所示;
表5LDZG制剂对硫代乙酰胺致肝损伤大鼠血清ALT、AST的影响
其中:与阴性对照组比较,*代表P<0.05,**代表P<0.01;
与模型对照组比较,#代表P<0.05,##代表P<0.01;
与联苯双酯对照组比较,△代表P<0.05,△△代表P<0.01;
与LDZG中剂量比较,■代表P<0.05,■■代表P<0.01;
与LDZG高剂量比较,▲代表P<0.05,▲▲代表P<0.01;
ALT:与模型组比较,龙胆环烯醚萜总苷高、中、低剂量组ALT均具有显著性差异,表明龙胆环烯醚萜总苷可使硫代乙酰胺所致大鼠肝损伤的血清ALT水平降低,供试品低、中剂量组大鼠血清ALT分别与供试品高剂量组比较,两组之间的差异均具有统计学意义,说明供试品高剂量在使硫代乙酰胺致肝损伤大鼠升高的血清ALT水平降低方面优于供试品中、低剂量。阳性药(联苯双酯)组小鼠血清ALT与模型对照组比较,ALT水平明显降低,两组之间的差异具有统计学意义,说明阳性药(联苯双酯)可使硫代乙酰胺致肝损伤小鼠升高的血清ALT水平降低;阳性药(联苯双酯)组小鼠血清ALT分别与低、中剂量组比较,两组之间的差异均不具有统计学意义,说明供试品在使硫代乙酰胺致肝损伤小鼠升高的血清ALT水平降低方面与阳性药(联苯双酯)作用相当;
龙胆苦苷与对照组比较,两组之间差异不具有统计学意义(P=1.000,>0.05),说龙胆苦苷在使硫代乙酰胺致肝损伤小鼠升高的血清ALT水平方面与联苯双酯相当;供试品低剂量组(0.175g/kg)与龙胆苦苷组(0.3g/kg)比较,两组之间的差异不具有统计学意义(P=1.000,>0.05),说明供试在使硫代乙酰胺致肝损伤小鼠升高的血清ALT水平方面优于龙胆苦苷相当;
AST:与模型组比较,龙胆环烯醚萜总苷高、中、低剂量组AST均具有显著性差异,表明龙胆环烯醚萜总苷可使硫代乙酰胺所致大鼠肝损伤的血清AST水平降低;供试品低、中剂量组大鼠血清AST分别与供试品高剂量组比较,两组之间的差异均具有统计学意义,说明供试品高剂量在使硫代乙酰胺致肝损伤大鼠升高的血清AST水平降低方面优于供试品中、低剂量。阳性药(联苯双酯)组大鼠血清AST与模型对照组比较,两组之间的差异不具有统计学意义,说明阳性药(联苯双酯)不能使硫代乙酰胺致肝损伤大鼠升高的血清AST水平降低;阳性药(联苯双酯)组小鼠血清AST分别与供试品中、高剂量组比较,两组之间的差异均具有统计学意义,说明供试品在使硫代乙酰胺致肝损伤大鼠升高的血清AST水平降低方面优于阳性药(联苯双酯);
供试品低剂量组与龙胆苦苷组比较,两组之间的差异不具有统计学意义(P=1.000,>0.05),说明供试在使硫代乙酰胺致肝损伤大鼠升高的血清AST水平方面优于龙胆苦苷。
实施例5毒理学实验
供试品制备:
取龙胆科植物条叶龙胆(Gentiana manshurica Kitag.)干燥根及根茎,经洗净,切制成饮片,经70%乙醇加热回流提取两次,每次1h,溶剂用量分别为10倍、8倍,合并两次提取液,减压回收溶剂,浓缩后离心。加入NaOH快速搅拌,调节pH至8.5进行碱沉,离心出去沉淀,然后将上清液上于经预处理的AB-8型大孔树脂,上样量40mg/mL,依此用3倍蒸馏水及30%乙醇洗脱,收集30%洗脱部分,喷雾干燥,得龙胆环烯醚萜总苷固体粉末I号,经HPLC检测龙胆苦苷含量为78.96%,獐牙菜苷含量为1.32%,獐牙菜苦苷含量为3.72%;
取龙胆科植物条叶龙胆(Gentiana manshurica Kitag.)干燥根及根茎,经洗净,切制成饮片,经70%乙醇加热回流提取两次,每次1h,溶剂用量分别为10倍、8倍,合并两次提取液,减压回收溶剂,浓缩后离心。然后将上清液上于经预处理的AB-8型大孔树脂,上样量40mg/mL,依此用3倍蒸馏水及30%乙醇洗脱,收集30%洗脱部分,喷雾干燥,得龙胆环烯醚萜总苷固体粉末II号,经HPLC检测龙胆苦苷含量为76.07%,獐牙菜苷含量为1.02%,獐牙菜苦苷含量为3.88%;
龙胆苦苷单体(含量>98%)为III号;
LD50的测定
方法:挑选健康小鼠,体重为17.8-19.9g,按体重分层随机分组,每组各10只,雌雄各半,给药前禁食不禁水过夜,给药组剂量分别按等比级数0.84(5.00g/kg,5.95g/kg,7.08g/kg,8.43g/kg,10.0g/kg)、最大给药容量(40ml/kg)单次灌胃碱沉制备的龙胆环烯醚萜总苷(I号)、非碱沉工艺制备的龙胆环烯醚萜总苷(制备工艺中醇沉浓缩后上清液不加碱,直接上大孔吸附树脂精制)(II号)及龙胆苦苷(含量>98%)(III号),对照组同时间给予等容量纯水,给药后4h内严密观察,然后每天上、下午各一次,连续观察14天,包括动物体重变化、饮食、外观、行为、分泌物、排泄物、动物异常反应的症状、起始时间、严重程度、持续时间、是否可逆以及动物死亡情况,在给药当天、给药后第7天、第15天测定小鼠体重;在给药后第6~7天及第14~15天测定耗食量,发现有动物死亡或濒死动物及时剖检,其他动物在观察期结束后进行大体解剖,记录病变情况,并作书面记录。发现器官出现体积、颜色、质地等改变时进行病理检查,
小鼠单次灌胃I号、II号、III号后各给药组均有部分动物死亡,动物死亡数随剂量增加而增加,且给药各剂量组之间显示出毒性时效关系;除III号组1只雌性动物(第3组,5.95g/kg)在第6天发现濒死送解剖外,其余死亡发生在给药后第2天至第3天,死亡前出现颤抖,活动减少,困倦,精神萎靡等症状。其余动物自给药后第4天至14天观察期内无明显异常,大体解剖肉眼观察各脏器未见明显异常,本试验例采用Bliss法计算I号小鼠LD50为5.11g/kg(95%可信限:3.5923-5.741g/kg);II小鼠LD50为3.15g/kg(95%可信限:2.6650-3.5890g/kg)、III号小鼠LD50为3.35g/kg(95%可信限:2.3450-4.055g/kg);
长期毒理学研究
观察大鼠连续3个月重复给予I号、II号、III号供试品所产生的毒性反应、出现的症状和严重程度、毒副反应的靶器官,预测其可能对人体产生的不良反应,为拟订人安全服用剂量提供参考:
方法:
取合格动物120只按随机分为4组,即阴性对照组、I号、II号、III号供试品组,每组30只,其中雄性15只,雌性15只。5只/笼饲养;
首次给药前所测定的动物体重作为初始体重,适应性饲养结束次日开始测定动物耗食量作为给药前耗食量;
供试品按方案规定配制成不同浓度的供试液,每日定时给药(1.0g/kg相当于人拟临床用剂量(0.1g/kg)的10)三个剂量组口服灌胃给予不同浓度的供试液,阴性对照组同法给予对照品。给药体积均为5ml/kg,一日1次,连续3个月,
每日于给药前后观察动物大体状况,包括观察其外观体征,行为活动和粪便形状;
于末次给药后禁食不禁水16小时,腹腔注射乌来糖1g/kg麻醉,腹主动脉取血作血液学、血清生化学检查,并进行大体剖检;
(1)血液学检查:II号供试品组大鼠与阴性对照组相比,网织红细胞数量与百分比均显著升高(P<0.05,P<0.01),其余血液学各项指标均未见明显组间差异(P>0.05),I号、III号血液学各项指标均未见明显组间差异(P>0.05)如表6所示;
(2)血液生化学检查:给药30天后II号供试品组总胆红素(TB)与阴性对照组相比升高(P<0.05,P<0.01),如表7所示;
I号、III号供试品各剂量组与阴性对照组相比,给药期与恢复期中其余各项血液生化学各项指标均未见明显差异(P>0.05);
(3)大体剖检:除部分脏器出现的一些自发、偶发或非特异性改变外,受试大鼠各主要器官均未发现明显的药物相关性病理改变;
实验结果表明:网织红细胞增加与TB升高提示可能存在溶血性贫血症状;II号供试品作用靶点提示为肝脏。
表6对大鼠血液学检查结果的影响(n=10)
表7对大鼠血生化检查结果的影响()
综合毒理学及药效学研究结果表明,碱沉工艺制备的龙胆环烯醚萜总苷在降低四氯化碳致小鼠急性肝损伤、D-半乳糖致大鼠慢性肝损伤所致ALT、AST水平升高方面明显优于单一成分龙胆苦苷及阳性对照药物联苯双酯;碱沉工艺制备的龙胆环烯醚萜总苷毒性明显低于非碱沉工艺制备的龙胆环烯醚萜总苷及龙胆苦苷单体。
实施例6制备片剂
将制得的龙胆环烯醚萜总苷固体粉末与微晶纤维素以1∶2混合,加入1%CMS-Na,2%PVP,0.1%硬脂酸镁,混合均匀,压制成片,备用。
实施例7制备胶囊
将制得的龙胆环烯醚萜总苷固体粉末与预胶化淀粉以1∶3混合,加入2%PVPP,混合均匀,将PVP配制成15%的浆,湿法制粒,40℃烘干,加入0.1%硬脂酸镁后装胶囊,备用。
实施例8制备自微乳
将制得的龙胆环烯醚萜总苷固体粉末与大豆磷脂1∶2在四氢呋喃溶剂中反应4h,搅拌温40℃,得龙胆环烯醚萜总苷磷脂复合物,然后按照Maisine35-1∶Miglycol(1∶2)=30%,Labrasol∶CremorphorEL(1∶4)=40%,Transcutol P=30%,制备成空白自微乳溶液,按1∶10(g/g)的比例加入龙胆磷脂复合物,37℃搅拌1d,既得龙胆自微乳制剂。
实施例9制备磷脂复合物
将制得的龙胆环烯醚萜总苷固体粉末与大豆磷脂1∶2在四氢呋喃溶剂中反应4h,搅拌温40℃,减压干燥得龙胆环烯醚萜总苷磷脂复合物,然后按照1∶3比例加入微晶纤维素,加入5%PVPP,高剪切制粒,然后加入1%微粉硅胶,装入胶囊。
Claims (8)
1.一种龙胆环烯醚萜总苷,其特征在于,其中龙胆苦苷含量为50%-80%,獐牙菜苦苷含量为0.67%-10%,獐牙菜苷含量为0.48-8%;
所述的龙胆环烯醚萜总苷通过碱沉工艺按下述方法制备:
取龙胆药材去杂质,制段后加入6-12倍70%乙醇溶媒提取3次,每次1h,合并提取液,减压回收乙醇至密度1.1-1.2g/ml,得浓缩液;向浓缩液中加入95%乙醇调节至乙醇浓度80%,静置醇沉;取醇沉上清液回收乙醇至密度1.1-1.2g/ml,得浓缩液,过滤;向滤液中加入NaOH,调节pH至7.0-9.0进行碱沉工艺处理,离心去除沉淀,上清液上大孔吸附树脂,用2BV体积水洗脱,弃去水洗液,然后用20%乙醇洗脱,收集洗脱液至无色、合并,减压浓缩至相对密度1.1-1.2,50-60℃,减压干燥48h,粉碎,制成干粉,即得。
2.按权利要求1所述的龙胆环烯醚萜总苷,其特征在于,其中獐牙菜苦苷含量为1-6%,獐牙菜苷含量为1-4%。
3.按权利要求1所述的龙胆环烯醚萜总苷,其特征在于,其中碱沉工艺处理中pH值为8.0。
4.按权利要求1所述的龙胆环烯醚萜总苷,其特征在于,所述的制备方法中,选用NaOH、NaHCO3、Na2CO3、KOH、KHCO3或K2CO3为pH调节剂。
5.按权利要求1所述的龙胆环烯醚萜总苷,其特征在于,所述的制备方法中,所述的大孔吸附树脂为HPD300。
6.权利要求1的龙胆环烯醚萜总苷在制备治疗肝损伤药物中的用途。
7.按权利要求6所述的用途,其特征在于,所述的龙胆环烯醚萜总苷降低肝损伤谷丙转氨酶和谷草转氨酶升高。
8.按权利要求6所述的用途,其特征在于,所述的治疗肝损伤药物制成片剂、胶囊、纳米粒、脂质体、注射剂或透皮贴剂剂型。
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