CN100355447C - 一种治疗肝纤维化的复方制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属中药领域，具体涉及一种的治疗肝纤维化的复方制剂及其制备方法。本发明采用中药材仙灵脾、鳖甲、炙黄芪、枸杞子、紫丹参、广郁金、苦参为主药，配以辅料制成。经体外和动物实验表明，具有抑制肝细胞胶原合成，促进肝细胞增殖和抑制HSC增殖作用，对大鼠的肝纤维化有明显改善作用；经临床实践证实，对肝纤维化患者临床症状，体征、血清生化学指标及肝病理变化有较好的改善作用，其中肝功能及肝纤维化指标改善率达60-75%，本发明服用方便，长期服用无任何毒副作用。本发明制备方法，能高效率地保留药材中的有效成分，简化中药制剂的制备，保护环境，有利于大生产的操作。

Description

一种治疗肝纤维化的复方制剂及其制备方法

技术领域

本发明属中药领域，涉及中药复方制剂，具体涉及一种含仙灵脾、炙鳖甲等中药的治疗肝纤维化的复方制剂及其制备方法。

背景技术

肝纤维化的发生是由于各种慢性肝损伤引起的肝脏细胞外基质(ExtraCellalur Matrx，ECM)合成增加和/或降解减少的结果，国内外许多学者都在积极探索治疗肝纤维化和肝硬化的有效方法，随着细胞学、分子生物学技术的进展，肝纤维化的基础研究有了较大的进展，然而，临床治疗学的研究明显滞后于基础研究，已报道的治疗药物几乎均处于实验研究阶段，就治疗药物的实验研究而言，现代医学主要集中于以下几个方面：(1)抑制胶原基因的转录及转换，如γ-干扰素，类视黄醇；(2)抑制胶原蛋白转译后的修饰，如4-脯氨酸羟化酶抑制物(HOE077)，赖氨酸羟化的酶抑制物如Minoxidil；(3)抑制胶原的分泌，如秋水仙碱；(4)抑制前胶原三股螺旋或胶原分子的交换，如β-氨基丙晴；(5)增加胶原降解，如二亚油酰磷脂酰胆碱，黄体驰缓素等。

迄今，大多数药物在临床实践中均未得到预期的效果，就连一度认为很有希望的抗肝纤维化药物HOE077(Lufironil)也因其有严重的副作用而停止了临床应用，γ-干扰素对肝纤维化的疗效尚须进一步验证。

近年来，国内应用中医中药治疗肝纤维化的研究有了一定的进展，有关文献主要集中在单味中药(或其提取物)、固定复方、辨证论治等三方面，实验研究发现单味中药(或其提取物)中的丹参，丹参酚丹酸B，葫芦素B，齐墩果酸，汉防已甲素及复方中的鳖甲煎丸、强肝汤、乌鸡白凤丸、319胶囊、861等复方有一定的抗肝纤维化作用，辩证论治现尚无规范化的标准，由于病例入选标准的差异，疗效考核标准不一，特别是肝脏组织学检查难以普遍开展，故迄今仍无成熟的治疗方案或药物在临床普遍应用。

我国是慢性乙型肝炎病毒感染的高发区域，也是血吸虫感染严重地区，近年来酒精性肝炎、脂肪性肝炎的发病率也正在逐年提高。上述疾病导致肝纤维化的发生明显上升。肝纤维化是一种可逆性的病理诊断，各种病因所引起的慢性肝病绝大多数都有肝纤维化，其中25％-40％最终发展为肝硬化及至肝癌。阻断和逆转肝纤维化对改善肝病的预后，降低肝硬化和原发性肝细胞癌的发生有着极其重要的意义，是防治慢性肝病的关键和难题之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有改善肝纤维化、预防肝硬化作用的治疗肝纤维化的中药复方制剂及其制备方法。

中医内科认为肝纤维化多属于“积聚”“胁痛”、“瘀证”等范畴，其病机复杂。正虚血瘀、肝肾亏损是肝纤维化的主要病机特征，或可兼挟湿、热等病邪，病变主要影响肝、脾、肾三脏。

本发明采用中药材以中药材仙灵脾、炙鳖甲、炙黄芪、枸杞子、紫丹参、广郁金、苦参为主药，配以辅料，制成本发明治疗肝纤维化的复方制剂。

本发明所涉及的药材仙灵脾、炙鳖甲、炙黄芪、枸杞子、紫丹参、广郁金、苦参为中国药典2000年版一部所收载中药，并符合药典质量要求。

本发明复方制剂其中所述组分的质量/质量百分比配比如下述，

仙灵脾20-30％、炙鳖甲12-15％、炙黄芪8-10％、枸杞子8-10％、紫丹参8-10％、广郁金8-10％、苦参3-5％，余为辅料。

优选组分的质量/质量百分比配比是：仙灵脾15-25％、炙鳖甲10-15％、炙黄芪5-10％、枸杞子5-10％、紫丹参5-10％、广郁金5-10％、苦参1-5％，余为辅料。

所述的辅料包括微粉硅胶、糊精、β-环糊精包合物等。其比例在10％-20％时具有符合中国药典2000年版一部片剂规定的崩解时限。

本发明复方制剂通过下述方法制备，

本发明根据所采用的中药材淫羊藿、炙黄芪、丹参均含有大量的脂溶性有效成分，选用乙醇作为溶媒提取；郁金含有挥发性有效成分，选用水蒸气蒸馏法提取；同时，郁金、丹参还含有水溶性有效成分，且鳖甲、枸杞子、苦参的有效部位基本上能溶于水，确定将郁金水蒸气蒸馏后的药渣、丹参醇提后的药渣与鳖甲、枸杞子、苦参加水提取。

根据本发明制剂中药物的成分及剂型要求，选用干膏收率和丹参水溶性成分原儿茶醛的含量为评价指标，进行综合评价。干膏收率作为选择剂型的参考指标，影响除杂方法的选择，是胶囊剂日服量、单服量及包装规格确定的重要参数。因此，以干膏收率作为评价指标之一，但其与疗效强度不成量效关系，故综合评价时权重系数应较小，以0.3为宜。本制剂中丹参所含原儿茶醛为主要药效成分，因此可测定原儿茶醛的含量，作为评价指标之一，且权重系数应相对较大，以0.7为宜。

本发明复方制剂进行了动物实验和肝纤维化临床研究，结果显示：

(1)对CCl₄所致小鼠急性肝损伤和小鼠免疫性肝损伤具有显著防治作用，使两种肝损伤小鼠升高的血清ALT和AST活性均有显著降低作用；

(2)对CCl₄综合因素所致大鼠肝纤维化模型和DMN所致大鼠肝纤维化模型，具有显著的治疗作用。主要表现在对升高的血清ALT和AST活性有降低作用，对血清总蛋白含量升高、球蛋白含量升高和白蛋白含量降低的代谢异常变化具有治疗性的调节作用，对增高的血清透明质酸、III型前胶原和层粘连蛋白含量均有降低作用，对增高的肝组织羟脯氨酸含量亦有降低作用，并显著地减轻大鼠肝组织胶原纤维病变，使肝组织切片上的胶原纤维组织的面积总和、周长总和、平均光密度总和、积分光密度总和及平均黑度总和均显著降低；

(3)大样本的临床实验结果表明本发明制剂不仅可改善临床症状、体征，对肝功能也有明显的改善作用。其中血清肝纤维化指标、B超的变化结果表明，本发明制剂具有较好的抗肝纤维化的作用。通过7例前后肝穿的病理学观察结果表明，本发明制剂具有抗炎、抗纤维化的作用，对α-SMA、I、III型胶原的表达程度和面积有减轻作用，对HBsAg和HBcAg表达程度和类型有改善作用。

本发明制剂经临床实践应用证实，其对肝纤维化患者临床症状，体征、血清尘化学指标及肝病理变化有较好的改善作用，其中肝功能及肝纤维化指标改善率达60-75％，对肝纤维化大鼠的组织学有明显的改善作用；体外原代肝细胞的血清药理学研究结果显示本发明制剂具有抑制肝细胞胶原合成和促进肝细胞增殖等作用；体外原代肝星状细胞的血清药理学研究结果显示本发明制剂具有抑制HSC增殖及其胶原合成作用。

本发明制剂服用方便，长期服用无任何毒副作用。本发明的制备方法，能高效率地保留药材中的有效成分，简化中药制剂的制备，保护环境，有利于大生产的操作。

具体实施方式

实施例1

取上述配比组分淫羊藿、炙黄芪加入10倍量70％的乙醇回流提取两次，每次1小时，静置，滤过，合并滤液备用；丹参用6倍量70％乙醇回流提取两次，第一次1小时，第二次0.5小时，滤过，药渣备用，合并两次提取液，再与淫羊藿、炙黄芪醇提液合并，回收乙醇，减压浓缩成相对密度为1.08(60℃)的清膏；郁金加6倍量水浸泡2小时，用水蒸气蒸馏提取挥发油6小时，收集挥发油，每1ml挥发油用4gβ-环糊精在30℃的条件下超声包合45分钟，抽滤，所得包合物在40℃干燥4小时，备用；蒸馏后的药液滤过，滤液另器保存，备用；蒸馏后的郁金药渣与醇提丹参药渣、鳖甲、枸杞子、苦参共煎二次，每次加8倍量水，第一次煎煮1小时，第二次煎煮0.5小时，合并煎液，滤过，滤液与蒸馏后的郁金药液合并，浓缩至相对密度为1.15(60℃)的清膏，放冷，加入乙醇使含醇量达70％，静置12小时，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度1.08(60℃)的清膏，合并两种清膏，在进液速度：50～60ml/min、进风温度160～170℃、出风温度80～90℃的条件下喷雾干燥，收集干浸膏粉末，过筛，加入适量微粉硅胶、糊精、β-环糊精包合物混合均匀，填充0号胶囊，即得。

实施例2

采用本发明制剂进行动物实验，结果表明，对CCl₄综合因素所致大鼠肝纤维化和DMN所致大鼠肝纤维化多方面的指标均具有显著的治疗作用，对CCl₄所致小鼠急性肝损伤和小鼠免疫性肝损伤亦具有较好的防治保护作用。其中，用CCl₄对小鼠注射造成急性肝损伤模型后，血清ALT和AST活性均比正常对照组显著升高，分别升高463.93％和766.36％，P均＜0.01。本发明制剂高、中、低三种剂量均可使急性肝损伤小鼠血清升高的AST活性显著降低，降低率可达28.05％～56.09％，P均＜0.01；本发明制剂高剂量和中剂量可使升高的血清ALT活性显著降低，降低率分别为50.93％和31.64％，P均＜0.01。表明本发明制剂对CCl₄所致的小鼠急性肝损伤有显著的防治作用。高、中、低三种剂量组5.50、3.67、1.83g生药/kg(药液浓度分别为0.275、0.183、0.092g生药/mL，给药体积均为0.4mL/20g体重，分别为临床成年人每日拟用剂量的15倍、10倍、5倍。结果证实，本发明制剂对肝纤维化具有较好的治疗作用。

其中，C57BL/6J小鼠在复制形成免疫性肝损伤模型后，血清ALT和AST活性均比正常对照组显著升高，分别升高481.82％和313.59％，P均＜0.01。本发明制剂对小鼠免疫性肝损伤具有显著的治疗作用，表现在高、中、低三种剂量均可使升高的血清ALT活性显著降低(P＜0.01)；而高剂量和中剂量对升高的血清AST活性也具有显著降低作用(P＜0.05～0.01)。

其中，在CCl₄所致大鼠肝纤维化模型形成后，肝纤维化模型对照组大鼠血清ALT和AST活性比正常对照组大鼠均显著升高。其中ALT活性升高77.44％(P＜0.01)，AST活性升高114.93％(P＜0.01)。而经本发明制剂高、中、低三种剂量治疗4周后，对升高了的血清ALT活性具有显著的降低作用，分别使ALT降低43.24％、40.94％和32.71％，P均＜0.01；对升高的血清AST活性仅有高剂量具有显著的降低作用，降低率为35.83％(P＜0.05)，而中剂量和低剂量对AST活性仅有降低作用趋势。表明本发明制剂对CCl₄所致大鼠肝纤维化具有显著的保肝降酶作用。同样，复方鳖甲软肝片在高剂量(临床人用剂量的10倍)时，仅对CCl₄所致肝纤维化大鼠血清ALT活性具有显著降低作用，对AST活性有降低作用趋势。

其中，在CCl₄所致大鼠肝纤维化模型形成后，大鼠肝纤维化模型形成后，肝纤维化模型对照组大鼠血清总蛋白(TP)含量比正常对照组大鼠略为升高(可能由于血清球蛋白含量增加所致)，增加3.63％(P＞0.05)。经本发明制剂三种剂量治疗4周后，对增高的TP含量具有不同程度的降低作用趋势，分别降低12.50％、8.95％和13.39％，P均＞0.05。在大鼠肝纤维化模型形成后，肝纤维化模型对照组大鼠血清白蛋白(Alb)含量比正常对照组大鼠显著降低，降低41.84％(P＜0.01)。经本发明制剂高、中、低三种剂量治疗4周后，对降低的Alb含量均具有不同程度的回升作用，其中高剂量组具有显著回升Alb的作用，比模型对照组回升增加55.87％(P＜0.01)。在大鼠肝纤维化模型形成后，肝纤维化模型对照组大鼠血清球蛋白(Glob)含量比正常对照组大鼠显著增高，增高20.68％(P＜0.01)。经本发明制剂高、中、低三种剂量治疗4周后，对增高的Glob含量均具有不同程度的降低作用，分别降低28.07％(P＜0.01)、11.17％(P＞0.05)和16.66％(P＞0.05)。表明在CCl₄所致的肝纤维化大鼠血清总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)和球蛋白(Glob)的代谢发生了异常变化(血清TP含量略升高，血清Glob含量显著升高，而Alb含量显著降低)，而本发明制剂具有治疗性的调节作用，尤其在高剂量时作用显著。同样，复方鳖甲软肝片在高剂量(临床人用剂量的10倍)时，对肝纤维化大鼠具仅有降低血清TP、降低血清Glob和升高血清ALP含量的作用趋势，P均＞0.05。

其中，在CCl₄等复合因素所致大鼠肝纤维化模型形成后，大鼠血清中的肝纤维化标志物HA(透明质酸)、PCIII(III型前胶原)和LN(层粘连蛋白)含量，均比正常对照组大鼠显著增高。其中，使HA含量增加256.72％(P＜0.01)，使PCIII含量增加40.51％(P＜0.01)，使LN含量增加100.73％(P＜0.01)。经本发明制剂高、中、低三种剂量治疗4周后，可使升高的血清HA、PCIII和LN含量有不同程度的降低作用。其中，三种剂量分别使HA含量分别降低31.09％(P＜0.05)、12.12％(P＞0.05)和12.12％(P＞0.05)；分别使PCIII含量分别降低5.77％(P＞0.05)、18.59％(P＜0.05)和15.07％(P＜0.05)；分别使LN含量分别降低27.46％(P＜0.01)、25.51％(P＜0.05)和17.23％(P＜0.05)。可见，本发明制剂给药对CCl₄所致肝纤维化大鼠血清升高了的PCIII和LN的含量均有显著降低作用，在高剂量时对升高的HA含量也具有显著的降低作用。表明本发明制剂对CCl₄所致肝纤维化具有显著的治疗作用。同样，阳性对照药物复方鳖甲软肝片在高剂量(临床人用剂量的10倍)时，亦可显著降低CCl₄所致肝纤维化大鼠血清PCIII和LN的含量(分别降低20.97％和19.01％，P均＜0.05)，表明复方鳖甲软肝片对CCl₄所致肝纤维化亦具有显著的治疗作用。

其中，在CCl₄所致大鼠肝纤维化模型形成后，肝纤维化模型对照组大鼠血清羟脯氨酸(Hyp)含量比正常对照组大鼠显著增高，增加了691.08％(增加6.91倍)。而经本发明制剂高、中、低三种剂量治疗4周后，对升高了的血清羟脯氨酸含量均具有显著的降低作用，分别比肝纤维化比模型对照组降低30.03％、37.51％和26.29％，P均＜0.05～0.01。表明本发明制剂对CCl₄所致大鼠肝纤维化具有显著的治疗作用。同样，复方鳖甲软肝片在高剂量(临床人用剂量的10倍)时，亦可使肝纤维化大鼠血清羟脯氨酸含量显著降低，降低23.50％(p＜0.05)。

其中，在CCl₄所致大鼠肝纤维化模型形成后，肝纤维化模型对照组大鼠肝组织中所含的羟脯氨酸含量比正常对照组大鼠显著增高，增高77.40％(P＜0.01)。而经本发明制剂高、中、低三种剂量治疗4周后，对升高的肝组织羟脯氨酸含量均具有显著的降低作用，分别比肝纤维化比模型对照组降低23.84％、20.86％和24.50％，P均＜0.01。表明本发明制剂对CCl₄所致大鼠肝纤维化具有显著的治疗作用。同样，复方鳖甲软肝片在高剂量(临床人用剂量的10倍)时，亦可使肝纤维化大鼠肝组织羟脯氨酸含量显著降低，降低15.51％(p＜0.05)。

其中，在使用注射CCl₄和饲喂高脂饲料的复合因素条件共6周，可以成功地复制大鼠肝纤维化模型。与正常对照组大鼠肝组织比较，肝纤维化模型对照组大鼠肝组织切片上的胶原纤维组织的面积总和、周长总和、平均光密度总和、积分光密度总和及平均黑度总和均极大程度地增加。其中，模型组肝胶原纤维组织的面积总和比正常对照组增加413.90％(增加了4.139倍，P＜0.01)；模型组肝胶原纤维组织的周长总和比正常对照组增加118.36％(P＜0.01)；模型组肝胶原纤维组织的平均光密度总和比正常对照组增加86.58％(P＜0.01)；模型组肝胶原纤维组织的积分光密度总和比正常对照组增加418.58％(增加了4.19倍，P＜0.01)；模型组肝胶原纤维组织的平均黑度总和比正常对照组增加156.96％(P＜0.01)。表明应用CCl₄等复合因素能够成功地复制大鼠肝纤维化模型。在经过应用本发明制剂高、中、低三种剂量治疗4周后，可以显著地减轻大鼠肝组织胶原纤维病变，表现为三种剂量能使大鼠肝胶原纤维组织的面积总和分别缩小75.17％、66.98％和59.38％(P均＜0.01)；使肝胶原纤维组织的周长总和分别缩短30.47％、24.50％和21.64％(P均＜0.01)；使肝胶原纤维组织的平均光密度总和分别降低38.73％、39.14％和40.45％(P均＜0.01)；使肝胶原纤维组织的积分光密度总和分别降低70.47％、62.05％和55.21％(P均＜0.01)；使肝胶原纤维组织的平均黑度总和分别降低48.11％、49.33％和54.20％(P均＜0.01)。表明本发明制剂对CCl₄复合因素所诱发的大鼠肝胶原纤维病变具有较好的治疗作用，能够显著地减轻肝胶原纤维病变程度。同样，阳性对照药物复方鳖甲软肝片在高剂量(临床人用剂量的10倍)时，对CCl₄复合因素所诱发的大鼠肝胶原纤维病变亦具有显著的治疗作用。本发明制剂质量比范围为：仙灵脾20-30％、炙鳖甲12-15％、炙黄芪8-10％、枸杞子8-10％、紫丹参8-10％、广郁金8-10％、苦参3-5％，余为辅料，疗效更好。

表1是本发明制剂对CCl₄所致急性肝损伤小鼠血清ALT和AST活性的影响

表2是本发明制剂对免疫性肝损伤小鼠血清ALT和AST活性的影响

表3是本发明制剂对CCl₄所致肝纤维化大鼠血清ALT和AST活性的影响

表4是本发明制剂对CCl₄所致肝纤维化大鼠血清TP、Alb和Glob含量的影响

表5是本发明制剂对CCl₄所致肝纤维化大鼠血清HA、PCIII和LN含量的影响

表6是本发明制剂对CCl₄所致肝纤维化大鼠血清羟脯氨酸(Hyp)含量的影响

表7是本发明制剂对CCl₄所致肝纤维化大鼠肝组织羟脯氨酸(Hyp)含量的影响

表8是本发明制剂对CCl₄所致肝纤维化大鼠肝胶原纤维含量的影响

表1

组  别	动物数(只)	ALT活性(U/L)	降低率(％)	AST活性(U/L)	降低率(％)
						正常对照组肝损伤模型对照组肝损伤+高剂量组肝损伤+中剂量组肝损伤+低剂量组肝损伤+小范围组	101010101010	36.87±11.11207.92±10.77102.03±15.02**142.13±12.70**202.67±63.9899.81±12.37	--50.9331.642.5357.61	31.72±12.35274.81±36.49120.68±32.93**175.04±49.53**197.73±53.75**117.54±42.34**	--56.0936.3128.0557.21
肝损伤+“鳖甲”组	10	141.02±27.56**	32.18	78.22±25.80**	71.54

注：与肝损伤模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

表2

组  别	动物数(只)	ALT活性(U/L)	降低率(％)	AST活性(U/L)	降低率(％)
						正常对照组肝损伤模型对照组肝损伤+高剂量组肝损伤+中剂量组肝损伤+低剂量组肝损伤+“鳖甲”组	101010101010	36.87±9.34272.70±57.57107.36±15.12**118.44±12.52**163.49±34.01**107.36±15.12**	--60.6356.5740.0560.63	36.49±9.57192.28±50.1497.14±29.24**164.61±51.59*220.66±93.73104.02±5.63**	--49.4814.39-14.7645.90

注：与肝损伤模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

表3

组    别	动物数(只)	ALT活性(U/L)	降低率(％)	AST活性(U/L)	降低率(％)
						正常对照组肝损伤模型对照组肝损伤+高剂量组肝损伤+中剂量组肝损伤+低剂量组肝损伤+“鳖甲”片组	101010101010	37.99±13.9267.41±4.4938.26±9.52**39.81±6.63**45.36±8.56**48.53±9.50**	--43.2440.9432.7128.01	36.50±16.8378.45±25.4150.34±16.79*71.92±24.8171.49±26.8561.92±35.47	--35.838.328.8721.07

注：与肝损伤模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

表4

组  别	动物数(只)	TP含量(g/L)	Alb含量(g/L)	Glob含量(g/L)
					正常对照组肝纤模型对照组肝纤+高剂量组肝纤+中剂量组肝纤+低剂量组肝纤+“鳖甲”组	101010101010	55.44±10.7157.45±5.3150.27±10.31(降低12.50％)52.31±6.99(降低8.95％)49.76±12.34(降低13.39％)56.96±5.17(0.85％)	18.30±3.1810.65±1.7116.60±4.81**(升高55.87％)10.73±4.69(升高0.75％)10.75±4.79(升高0.94％)11.73±3.77(升高10.14％)	37.13±11.0246.81±4.5033.67±11.06**(降低28.07％)41.58±6.35(降低11.17％)39.01±11.51(降低16.66％)45.24±6.65(降低3.35％)

注：与肝纤模型对照组比较，**P＜0.01。

表5

组  别	动物数(只)	HA(ng/mL)	PCIII(μg/L)	LN(ng/mL)
					正常对照组肝纤模型对照组肝纤+高剂量组肝纤+中剂量组肝纤+低剂量组肝纤+“鳖甲”组	101010101010	102.27±41.30364.82±183.13251.42±31.22*(降低31.09％)320.60±89.49(降低12.12％)320.60±150.62(降低12.12％)363.53±23.45(降低0.36％)	56.09±18.2978.81±11.8074.26±16.98(降低5.77％)64.16±15.85*(降低18.59％)66.93±7.92*(降低15.07％)62.28±11.21*(降低20.97％)	58.66±3.38117.75±32.8985.41±17.97**(降低27.46％)87.71±15.32*(降低25.51％)97.46±16.18*(降低17.23％)95.37±35.1*(降低19.01％)

注：(1)与肝纤模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

(2)括号内数值为与肝纤模型对照组比较的抑制(降低)百分率。

表6

组    别	动物数(只)	血清Hyp含量(mmol/L)	降低率(％)	P值
					正常对照组肝纤维化模型对照组肝纤维化+高剂量组肝纤维化+中剂量组肝纤维化+低剂量组肝纤维化+“鳖甲”片组	101010101010	0.1278±0.06021.0110±0.44490.7074±0.20630.6318±0.19580.7452±0.23610.7734±0.2254	--30.0337.5126.2923.50	--＜0.05＜0.01＜0.05＜0.05

表7

组  别	动物数(只)	肝组织Hyp含量(μg/mg肝组织)	降低率(％)	P值
					正常对照组肝纤维化模型对照组肝纤维化+高剂量组肝纤维化+中剂量组肝纤维化+低剂量组肝纤维化+“鳖甲”片组	101010101010	15.49±2.9127.47±5.9920.91±3.8621.74±3.3320.74±2.9723.21±5.12	--23.8420.8624.5015.51	--＜0.01＜0.01＜0.01＜0.05

表8

组  别	面积总和(μm2)	周长总利(μm)	平均光密度总和	积分光密度总和	平均黑度总和
						正常组肝纤维化模型对照组肝纤维化+高剂量组肝纤维化+中剂量组肝纤维化+低剂量组	18473±446594831±461423548±9330(75.17％)**31315±8831(66.98％)**38516±9845(59.38％)**	9201±142020091±518413970±4241(30.47％)**15168±3389(24.50％)**15744±4379(21.64％)**	20836±566938876±749223819±6784(38.73％)**23659±4166(39.14％)**21407±7355(44.94％)**	37621±849315747632±70577914650111±1700648(70.47％)**5976008±1661119(62.05％)**7053465±1538857(55.21％)**	12773±423232821±480117032±3982(48.11％)**16630±2936(49.33％)**15032±4668(54.20％)**

肝纤维化+小范围组	22546±8732(76.31％)**	12678±2369(31.21％)**	22975±5489(39.68％)**	4452101±1721347(71.32％)**	16982±2371(49.53％)**
						肝纤维化+鳖甲片组	38393±6561(59.51％)**	16205±2614(19.34％)*	23149±5751(40.45％)**	7192957±1147026(54.32％)**	16963±3853(48.32％)**

注：(1)与肝纤维化模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

(2)括号内数值为与肝纤维化模型对照组比较的抑制(降低)百分率。

实施例3

本发明制剂对小鼠灌胃在一日内分2次给予的最大给药量为175g生药/kg体重，此剂量为临床成年人拟用剂量的477倍。即表明小鼠能耐受灌胃给予本发明制剂的剂量为175g生药/kg体重(为临床成年人拟用剂量的477倍)。由于在一日内分2次灌胃给予较大体积的浓稠药物，使动物摄食量减少，动物的体重增长稍慢(无统计学意义，P＞0.05)，但在给药后7天内不致引起明显中毒症状和死亡。表明本发明制剂对动物灌胃给药的急性毒性较小，口服用药安全。

以本发明制剂高、中、低三种剂量(18.33、9.17、4.59g生药/kg，分别为成年人临床拟用日服剂量的50倍、25倍和12.5倍)对大鼠连续灌胃给药6个月。在给药3个月后，各组随机抽取活杀10只大鼠(雌雄各5只，第一批次)；在给药6个月后，各组随机抽取活杀14只大鼠(雌雄各7只，第二批次)；余下每组6只大鼠停药观察6周后再行活杀(雌雄各3只，第三批次)。收集大鼠腹股沟髂外静脉血，进行血液学和血液生化学检测；取动物重要脏器称重(计算脏器重量系数)和进行病理形态学检查。试验结果表明：本发明制剂高、中、低三种剂量对大鼠的外观行为、生长(体重增长)、血液学(造血功能，WBC、RBC、HGB、RC、PLT、HCT、MCV、MCH、MCHC、W-SCR、W-LCR、W-SCC、W-LCC、RDW-CV、PDW、MPV)、血液生化学(主要为肝脏功能和肾脏功能，ALT、AST、TP、ALB、BU、Cre、AKP、TBil、Glu、T-CHO)等均未见明显毒性影响。本发明制剂三种剂量对大鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肾上腺、甲状腺、胸腺、子宫、卵巢、睾丸、附睾、前列腺等13种器官的重量系数均无明显毒性的影响；上述器官组织，未发现有明显的出血、瘀血、肿胀、溃烂或色泽异常等病变情况。经与空白对照组比较，本发明制剂高剂量(18.33g生药/kg)对大鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肾上腺、甲状腺、胸腺、胃、十二指肠、前列腺、睾丸、附睾、子宫、卵巢等15种器官组织的形态亦未发现有明显的病理学损害性变化。

实施例4

本发明制剂在临床试用的基础上，选慢性乙型肝炎肝纤维化患者62例，观察本发明制剂治疗慢性乙型肝炎肝纤维化，结果显示治疗后患者绝大多数症状明显改善，其中以乏力、胁痛、食欲不振、腰膝酸软、口干咽燥、目干涩、腹胀、舌象脉象改善尤为明显(P＜0.05)。主要体征有改善，其中脾肿大、肝病面容、爪甲不荣改善较为明显。本发明制剂治疗后，ALT、AST、GGT、SB下降显著(P＜0.01)，AKP、G也有较明显的下降(P＜0.05)。各指标中HA在治疗后下降显著，CIV下降较显著，PIIINP下降较明显，AGA也有一定程度的下降，而LN、ApoAI、TRF在治疗后均有所上升。上述研究结果表明，HA、CIV、PIIINP、AGA与肝纤维化呈正相关关系，而LN、ApoAI、TRF与肝纤维化呈负相关关系，表明本发明制剂具有较明显的抗纤维化作用。治疗结束时，乙肝病毒学的主要指标中HBeAg、HBV DNA转阴率分别为20％、26.47％。上述结果表明，本发明制剂不仅可改善临床症状、体征，对肝功能也有明显的改善作用。血清肝纤维化指标、B超的变化结果表明，本发明制剂具有较好的抗肝纤维化的作用，其中，ALT、AST、GGT、SB下降非常显著(P＜0.01)，AKP、G也有较明显的下降(P＜0.05)，A虽有上升，但未有统计学意义。各项指标复常率中以ALT、AST、G、SB较高。表9是治疗前后血清肝功能主要指标的变化。表10是治疗前后血清HA、CIV、PIIINP、LN、AGA、ApoAI、TRF治疗前后的变化

表9

指标	治疗前	治疗后	T值	复常率
					ALTASTGGTAKPAGGG(％)SB	144.20±22.29114.21±25.3177.41±21.3728.31±11.2737.92±5.5431.46±4.2520.29±5.6819.47±5.36	53.66±5.63**55.46±8.99**43.53±16.78**20.56±10.12*38.78±7.5927.26±3.56*17.46±4.51*13.81±3.12**	12.8911.545.082.040.871.761.592.03	81.82(45/55)79.24(42/53)68.75(22/32)63.16(12/19)60.00(21/35)73.68(12/19)70.00(14/20)78.57(11/14)

治疗前后比较**P＜0.01，*P＜0.05

表10

指标	治疗前	治疗后	t值	P值
					HACIVPIIINPLNAGAApoAITRF	303.02±208.1965.37±48.919.08±7.82115.45±42.941.77±0.471.54±0.322.22±0.58	159.11±105.9143.81±51.566.06±3.25127.53±87.091.54±0.493.21±0.942.36±0.49	6.812.921.43-1.0151.393-0.98-1.17	0.0010.0260.090.310.100.330.25

结果显示，各指标中HA在治疗后下降非常显著，CIV下降较显著，PIIINP下降较明显，AGA也有一定程度的下降，而LN、ApoAI、TRF在治疗后均有所上升。上述研究结果表明，HA、CIV、PIIINP、AGA与肝纤维化呈正相关关系，而LN、ApoAI、TRF与肝纤维化呈负相关关系，表明本发明制剂具有较明显的抗纤维化作用。

病理学疗效：通过7例前后肝穿组织学观察，7例患者治疗前后肝穿切片比较，镜下观大多数患者有不同程度的好转，按95标准进行分级分期：炎症活动度，1例由G3降为G2，1例由G4转为G3，其余5例肝组织标本虽镜下可见改善，但尚达不到降一级的标准，如汇管区炎症细胞由较多变为少量，小叶内点灶状坏死每视野计数减少等；纤维化程度，1例由S4降为S3，1例由S3降为S2，1例由S2降为S1，1例由S3升为S4，1例由S2升为S3，其余2例部分可见纤维化程度下降，如纤维隔变少、变细、变短，但尚达不到降一级的标准。治疗后，炎症活动度由8.44±4.21降至7.11±5.03，纤维化程度计分由7.55±5.05降至5.92±4.21，本发明制剂对α-SMA、I、III型胶原的表达程度和面积有减轻作用，对HBsAg和HBcAg表达程度和类型有改善作用。

Claims (6)

1、一种治疗肝纤维化的复方制剂，它是由有效成分与药物辅料制成，其特征在于制备有效成分的原料药及其重量百分比组成为：

仙灵脾15-25％、炙鳖甲10-15％、炙黄芪5-10％、枸杞子5-10％、紫丹参5-10％、广郁金5-10％、苦参1-5％，余为辅料。

2、按权利要求1所述的治疗肝纤维化的复方制剂，其特征是所述的各原料药的重量百分比是：仙灵脾15-25％、，炙鳖甲12-15％，炙黄芪8-10％，枸杞子8-10％，紫丹参8-10％，广郁金8-10％，苦参3-5％。

3、按权利要求1或2所述的治疗肝纤维化的复方制剂，其特征是所述的辅料包括微粉硅胶、糊精和β-环糊精包合物。

4、按权利要求1所述的治疗肝纤维化的复方制剂的制备方法，其特征是采用乙醇作为溶媒提取淫羊藿、炙黄芪、丹参的脂溶性有效成分，采用水蒸气蒸馏法提取郁金，含有挥发性有效成分；将郁金水蒸气蒸馏后的药渣、丹参醇提后的药渣与鳖甲、枸杞子、苦参加水提取，加入辅料微粉硅胶、糊精和β-环糊精包合物混合均匀，填充胶囊，即得。

5、按权利要求4所述的制备方法，其中所述的制备方法包括下述步骤，

1)取所述重量配比的淫羊藿、炙黄芪加入10倍量70％的乙醇回流提取两次，静置，滤过，合并滤液备用；

2)用6倍量70％乙醇回流提取丹参两次，滤过，合并两次提取液，再与淫羊藿、炙黄芪醇提液合并，回收乙醇，减压浓缩成相对密度为1.08的清膏；

3)郁金加6倍量水浸泡2小时，用水蒸气蒸馏提取挥发油6小时，收集挥发油，每1ml挥发油用4gβ-环糊精在30℃的条件下超声包合45分钟，抽滤，所得包合物40℃干燥4小时，备用；蒸馏后的药液滤过，备用；

4)蒸馏后的郁金药渣与醇提丹参药渣、鳖甲、枸杞子、苦参共煎二次，每次加8倍量水，合并煎液，滤过，滤液与蒸馏后的郁金药液合并，浓缩至相对密度为1.15的清膏，放冷，加入乙醇使含醇量达70％，静置，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度1.08的清膏，合并两种清膏，喷雾干燥，收集干浸膏粉末，过筛，加入微粉硅胶、糊精、β-环糊精包合物混合均匀，填充胶囊，即得。

6、按权利要求5所述的制备方法，其中所述的喷雾干燥条件为：进液速度为50～60ml/min，进风温度为160～170℃，出风温度为80～90℃。