CN1312169C

CN1312169C - 一种新的龙胆有效部位的制备及其应用

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Publication number: CN1312169C
Application number: CNB200410042874XA
Authority: CN
Inventors: 胡少勇; 袁解乾
Original assignee: 胡少勇; 袁解乾
Current assignee: Shanxi Powerdone Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2004-05-28
Filing date: 2004-05-28
Publication date: 2007-04-25
Anticipated expiration: 2024-05-28
Also published as: CN1590398A

Abstract

本项发明公开一种由马钱酸(lognic acid)和龙胆苦苷(gentiopicroside)组成的龙胆有效部位的制备以及该有效部位在制药领域中的应用。这种由马钱酸和龙胆苦苷组成的龙胆有效部位来自传统中药龙胆，药理试验结果表明该有效部位具有显著的抗炎、利胆作用，对各种原因导致的肝损伤、胆囊炎、胆管阻塞具有良好的治疗作用。

Description

一种新的龙胆有效部位的制备及其应用

技术领域

本项发明涉及一种中药有效部位的制备，以及该有效部位在制药领域当中的应用。

背景技术

目前在全世界范围内，各种原因导致的肝病仍是威胁人类健康的大敌。在发展中国家，情况更加严峻，尤其是各种病毒性肝炎的发病率居高不下。病毒性肝炎(viral hepatitis)是由多种肝炎病毒引起的常见传染病，具有传染性强、传播途径复杂、流行面广泛，发病率较高等特点。据估计，世界上大约有3.5亿名乙型肝炎病毒(HBV)携带者，保守推测HBV携带者约占世界总人口的10％左右，每年有近100万人死于HBV引起的疾病。中国是全球HBV感染率较高的地区之一。

来自中国统计年鉴的全国肝炎流行病学调查数据表明，中国有6亿多人感染过乙型肝炎，大约1.2亿人携带乙型肝炎病毒。在中国，病毒性肝炎是普遍的致命性疾病平均年发病率约为0.1％左右，即全国每年发生急性病毒性肝炎约120万例，但估计实际发病数目比报告数目高出5至8倍，因此每年实际发病数目应超过600万。慢性肝炎的病例数目亦高居不下，据中国医药报调查，中国现有慢性肝炎病人2000万例，每年死于肝病约30万人，其中50％为原发性肝细胞癌，绝大多数与乙型和丙型肝炎病毒感染有关。

近年来，有关病毒性肝炎治疗药物的研究，主要分为两大主流：一为抗病毒药物，主要作用为抑制病毒复制；一为免疫调节药物，用于调整患者的免疫反应。在药物分类上，则可分为疫苗、干扰素、核苷类似物及免疫修饰剂四大类。目前在我国，肝病的治疗以干扰素、核苷类似物以及中草药制剂为主。但是无论是干扰素还是核苷类似物对肝病的治疗效果较为有限，而且治疗成本较高，给患者带来较大的经济压力，同时这些化学药副作用大，如干扰素常见的副作用有发热、疲劳、肌肉疼痛、血小板减少、白血球减少等；核苷类似物Lamivudine常出现停药反弹、耐药性，部分患者还会出现肝脏代偿失全等较为严重的不良反应。中医对肝病的治疗具有长久的历史，并且总结出一套行之有效的防治经验，如在金匱要略中将黄疸分为下列数种：黄疸、酒疸、女劳疸、黑疸等，并有大量的方剂在广泛应用。现代研究亦表明，中医药在肝病治疗当中确有独到优势，体现在可以多方面调节机体平衡，保肝作用确切，不良反应少等；与化学药物相比，中药的成本相对较低，开发传统药物治疗肝病与我国实际国情相符。

在传统中医当中龙胆为泻肝胆实火、清下焦湿热之要药，具有悠久的应用历史。如以龙胆为君药的方剂龙胆泻肝汤、当归龙荟丸等的使用尤为广泛。在中医当中肝病的病因主要归于湿热毒邪内蕴于肝胆，累及其他经络脏腑，对于肝阳上亢、湿热黄疸等证，多取龙胆之泻火除湿之功进行治疗。

现代研究亦发现龙胆中的次生代谢产物龙胆苦苷(gentiopicroside)可以抑制多种原因导致的体内炎症介质TNF(Tumor Necrosis Factor)水平上升，从而减缓由TNF导致的肝损伤(Yoshikazu Kondo，Fumihide Takano，et al.Suppresion of Chemically andImmunologically Induced Hepatic Injuries by Gentiopicroside.Planta Med.1994，60：414-416)。马钱酸亦属于环烯醚萜苷类物质，其甲酯马钱素具有显著的抗炎作用(Maria delCarmen Recio，RosaMaria Giner，et al.Structural Considerations on the Iridoids asAnti-Inflammatory Agents.Planta Med.1994，60：232-234)。因此根据传统医学综合目前相关专业领域的基础研究进展，结合现代新技术对传统中药进行二次开发是中药现代化的必由之路。

发明内容

本项发明是利用现代技术手段，对传统中药进行二次开发的研究成果。对一系列传统肝病治疗用中药进行系统的研究，以一种先进的技术手段从传统中药龙胆当中获得了一种全新的具有显著生物活性的龙胆有效部位。本项发明所涉及龙胆药材为传统中药龙胆，龙胆为龙胆科多年生植物龙胆Gentiana scabra，三花龙胆G.triflora和东北龙胆G.manshurica的根。

本项发明所解决的技术问题是在药理筛选模型的基础之上得到具有显著保肝、抗炎作用的龙胆有效部位，该有效部位能够大体上代表传统药材的功效，但是具有质量可控，剂量小、使用方便等优点，有别于传统中药的相、大、黑的落后面貌；由此有效部位制成的中药制剂与传统中成药相比，在质量可控性、疗效等诸多方面有了显著提高。

本项发明解决的另外一个重要技术问题是对筛选出的龙胆有效部位进行技术控制，我们从2个方面进行解决，首先是细化制备方法，确保这种龙胆有效部位的稳定；其次是制定有效部位的质量标准，对有效部位进行详尽的化学研究，以合适的技术手段控制有效部位质量。研究发现筛选出的有效部位主要由马钱酸和龙胆苦苷组成，故将该活性物质称为主要由马钱酸和龙胆苦苷组成的龙胆有效部位；分析表明马钱酸和龙胆苦苷的重量百分比为50-95％，不同制备方法得到的提取物含量略有差别；这种主要由马钱酸和龙胆苦苷组成的龙胆有效部位为我们首次获得，目前尚未见此类有效部位的报道或是应用。

本项发明还公开了主要由马钱酸和龙胆苦苷组成的龙胆有效部位与合适药用辅料制成的制剂，具体剂型包括针剂、片剂和胶囊剂等，如：水针剂、粉针剂、片剂、软胶囊剂、硬胶囊剂、颗粒剂。所述中药制剂含20-90重量％的主要由马钱酸和龙胆苦苷组成的龙胆有效部位和10-80重量％药用辅料。

1、主要由马钱酸和龙胆苦苷组成的龙胆有效部位的制备

参照文献，龙胆当中的主要次生代谢产物环烯醚萜苷类物质具有明显的生物活性，此类物质稳定性较差，以水提取降解损失较多，研究发现以醇/水和丙酮/水混和溶剂提取则可以有效的解决降解问题，尤其是丙酮/水的混和溶媒，可以有效提高此类物质的提取转移率。龙胆当中还含有大量的单糖、双糖类物质，这些成分为非活性物质，为获得较高效价的有效部位，应当选择性的祛除这些物质。

合成吸附剂可以有效的富集次生代谢产物当中的糖苷类物质，目前在抗生素工业当中有大量的应用，在中药当中的应用也逐渐增多。通过比较数种吸附剂制备龙胆有效部位，最终发现日本三菱化工出产的聚苯乙烯合成吸附剂DIAION HP20型填料制备得到的龙胆有效部位的生物活性和产品稳定性均是最好。而且该吸附剂机械、化学稳定性均较好，各种合成残余物均得到有效控制，能够达到药物对溶剂残留的要求。

取龙胆药材粗粉，加入3-5倍体积的30-90％甲醇、乙醇或丙酮，热回流提取，每次1小时，提取2-3次；合并提取液，减压浓缩，至1-5g(生药)/mL，冷藏24小时以上，过滤或离心除去沉淀。

取DIAION HP20填料装入层析柱当中，以乙醇充分处理，祛除残余有机杂质，然后以水洗除乙醇，备用。将上述龙胆提取液上柱，每克填料上0.5-2.5mL药液，现以2-3倍柱床体积去离子水冲洗，再以2-4倍柱床体积40-70％的醇液(甲醇或乙醇)洗脱，收集醇洗脱液，减压挥干，真空干燥，得到龙胆有效部位。

2、含有主要由马钱酸和龙胆苦苷组成的龙胆有效部位的中药制剂

(1)粉针剂

取龙胆有效部位，加入适量支架剂及其他必须辅料，如甘露醇、右旋糖苷等，加入活性炭脱色，过滤，调节PH至7.0，分装，灭菌，冻干即得。优选每支含有龙胆有效部位300mg。

(2)片剂

取龙胆有效部位，加入必须量的崩解剂如淀粉、羧甲基淀粉钠、L-HPC等，润滑剂如硬脂酸镁等，以干法或湿法制粒，干燥，压片，包衣即得。

(3)胶囊剂

取龙胆有效部位，加入必须药用辅料，制粒，干燥，装胶囊，即得龙胆有效部位硬胶囊剂。软胶囊剂的制备如下：取龙胆有效部位，加入适量植物油如氢化植物油，适量磷脂，过胶体磨混匀，压制制备得到软胶囊剂。

3、从龙胆当中得到的有效部位的化学成分的研究

取龙胆有效部位20g，以硅胶柱色谱和薄层色谱反复制备得到一系列化合物，具体结构经光谱解析并对照相关参考文献鉴定(化合物结构如下所示)。其中龙胆苦苷(GS-1)和马钱酸(GS-3)的量较多(在TLC色谱图上可以清晰的看到此2化合物的斑点)，由此将该有效部位称为由马钱酸和龙胆苦苷组成的龙胆有效部位；獐牙苦苷(GS-2)与马钱素和龙胆苦苷同属于环烯醚萜苷类物质，亦具有明显的保肝作用，为民间常用的急性肝炎治疗用草药青叶胆的主要活性成分；在该有效部位中，除环烯醚萜苷外尚含有其他物质，如咖啡酸糖苷(GS-4)等。

根据对龙胆有效部位的化学研究结果，我们制定出了主要由马钱酸和龙胆苦苷组成的龙胆有效部位的质控项目：

(1)马钱酸和龙胆苦苷的检查、鉴别

采用薄层色谱法(TLC)，通过与对照标准物质比较，鉴别出有效部位当中含有的马钱酸和龙胆苦苷。色谱板：正相硅胶板；展开系统：甲苯：甲酸甲酯：甲醇：甲酸＝10∶20∶2∶1；显色剂：香草醛-硫酸试液或紫外光254nm观察；具体薄层色谱图参见附图2。

从TLC色谱图可以清晰的看到龙胆有效部位当中2个主要成分龙胆苦苷和马钱酸。

(2)马钱酸和龙胆苦苷含量测定

龙胆有效部位中马钱素和龙胆苦苷的含量测定法参照中国药典2000版一部，采用HPLC法测定。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂：甲醇∶水(3∶7)为流动相；检测波长为270nm。分别取龙胆有效部位和2个对照品马钱酸及龙胆苦苷，配制为合适浓度，注入液相色谱仪，外标法计算含量。

马钱酸和龙胆苦苷的含量占固形物的50-95％。

4、主要由马钱酸和龙胆苦苷组成的龙胆有效部位的药理药效研究

采用CCl₄所致急性肝损伤模型(小鼠、大鼠)，对龙胆有效部位的保肝效果进行评价，如下述试验数据，龙胆有效部位具有显著的保肝作用。

表1小鼠口服龙胆有效部位对CCl4所致急性肝损伤的保护作用

	N	SGPT	SGOT
	N	SGPT	SGOT	对照组模型组龙胆有效部位(100mg/Kg)龙胆有效部位(200mg/Kg)联苯双酯(150mg/Kg)联苯双酯(300mg/Kg)	131313131313	34.04±8.0661.42±15.9434.07±11.41^32.90±7.01^31.51±5.80^29.17±9.88^	46.09±10.6569.01±7.1242.58±9.68^36.82±6.13^34.80±9.81^32.05±9.48^

与模型组比较：**P＜0.01

表2.大鼠口服GS龙胆有效部位对CCl₄所致急性肝损伤的保护作用

	N	SGPT	SGOT
	N	SGPT	SGOT	对照组模型组龙胆有效部位(70mg/Kg)龙胆有效部位(140mg/Kg)联苯双酯(100mg/Kg)	1313131313	41.33±4.3185.23±11.4074.08±21.08^58.99±9.89^46.72±18.89^*	69.98±7.24184.27±33.11119.05±23.82^88.38±24.82^122.28±17.71^

联苯双酯(200mg/Kg)

13

40.12±6.78^**

79.13±11.83^**

与模型组比较：**P＜0.01；*P＜0.05

表3.大鼠静脉注射龙胆有效部位对CCl₄所致急性肝损伤的保护作用

	N	SGPT	SGOT
	N	SGPT	SGOT	对照组模型组龙胆有效部位(40mg/Kg)龙胆有效部位(80mg/Kg)甘利欣(2mg/Kg)甘利欣(4mg/Kg)	131313131313	47.58±8.4996.00±11.2678.35±13.42^43.85±8.93^56.41±5.42^41.16±5.02^**	53.17±8.22161.22±27.17127.71±22.56^69.64±16.31^87.95±19.77^69.12±12.08^**

与模型组比较：**P＜0.01；*P＜0.05

附图说明

附图1、3批龙胆有效部位正相TLC色谱图

附图2、口服龙胆有效部位对小鼠急性肝损伤的保护作用

附图3、口服龙胆有效部位对大鼠急性肝损伤的保护作用

附图4、静注龙胆有效部位对大鼠急性肝损伤的保护作用

具体实施方式

例1、主要由马钱酸和龙胆苦苷组成的龙胆有效部位的制备实施例1

取100g龙胆药材粗粉，加入30％的乙醇溶液400mL，热回流1小时，重复提取2次，滤出提取液，合并，减压回收至100mL，冰箱冷藏1天，离心，取上清液，加入装有300mL HP20填料的层析柱中，以500mL去离子水冲洗，然后以60％乙醇溶液冲洗，收集乙醇洗脱液600mL，减压挥干，真空干燥得到龙胆有效部位7.6g。

TLC展开得到的龙胆有效部位，可以看到在与标准品马钱酸和龙胆苦苷相同的Rf值处均出现清晰的斑点；

HPLC法测定马钱酸和龙胆苦苷的含量，2个主要化合物的含量占有效部位固形物含量的66.54％。

例2、取100g龙胆药材粗粉，加入40％的丙酮溶液400mL，热回流1小时，重复提取3次，滤出提取液，合并，减压回收至100mL，冰箱冷藏2天，离心，取上清液，加入装有300mLHP20填料的层析柱中，以500mL去离子水冲洗，然后以60％乙醇溶液冲洗，收集乙醇洗脱液600mL，减压挥干，真空干燥得到龙胆有效部位6.2g。

HPLC法测定马钱酸和龙胆苦苷的含量，2个主要化合物的含量占有效部位固形物含量的90.54％。

例3、主要由马钱酸和龙胆苦苷组成的龙胆有效部位的粉针剂的制备实施例

粉针剂处方：

龙胆有效部位 300g

甘露醇 300g

注射用水加至4000mL

制法：按照上述处方，将龙胆有效部位和甘露醇溶于注射用水当中，加入活性炭4g，100℃煮沸15min，静置24小时；过滤，加稀盐酸调节PH至7.0；分装于10ml西林瓶中，每支4mL；置入冻干机冻干，冷冻温度为-40℃，5小时；升华温度-15℃-20℃，共24小时；40℃干燥2小时；压盖密封。

性状：本品为淡黄色块状物

质量指标：每支制剂含有龙胆有效部位300mg，每支含马钱酸和龙胆苦苷不低于150mg(HPLC法测定)。

例4主要由马钱酸和龙胆苦苷组成的龙胆有效部位的粉针剂的制备实施例

粉针剂处方：

龙胆有效部位 300g

右旋糖苷 30g

注射用水加至4000mL

制法：按照上述处方，将龙胆有效部位和右旋糖苷溶于注射用水当中，加入活性炭4g，100℃煮沸15min，静置24小时；过滤，加稀盐酸调节PH至7.0；分装于10ml西林瓶中，每支4mL；置入冻干机冻干，冷冻温度为-40℃，5小时；升华温度-15℃-20℃，共24小时；40℃干燥2小时；压盖密封。

性状：本品为淡黄色块状物

例5、主要由马钱酸和龙胆苦苷组成的龙胆有效部位的胶囊剂的制备

胶囊剂处方：

龙胆有效部位 150g

淀粉 90g

5％羟丙甲纤维素(HPMC) q.s.

微粉硅胶 1.5g

制成1000粒胶囊

制法：取龙胆有效部位研细，过100目筛，淀粉过80目筛，备用；取HPMC，加水制成5％溶液，作为黏合剂；龙胆有效部位与淀粉以等量递加法混匀，加入5％HPMC溶液，过30目筛制粒，60℃干燥，30目筛整粒，得到干颗粒；干颗粒加入过100目筛的微粉硅胶混匀；测定颗粒当中中药物的含量；装胶囊，装量约为280mg，包装即得。

质量指标：每粒胶囊含有龙胆有效部位150mg，每粒含马钱酸和龙胆苦苷不低于75mg(HPLC法测定)。

例6、主要由马钱酸和龙胆苦苷组成的龙胆有效部位的片剂制备

片剂处方：

龙胆有效部位 300g

微晶纤维素 95g

L-HPC 20g

交联CMC-Na 20g

硬脂酸镁 4.0g

制成1000片

制法：按照上述制剂处方，取龙胆有效部位，加入微晶纤维素、L-HPC，以95％乙醇作为黏合剂，过20目筛制软材，60℃干燥，整粒，加交联CMC-Na和硬脂酸镁混匀后压片；以7％的LE薄膜包衣即得。

质量指标：每片含有龙胆有效部位300mg，每粒含马钱酸和龙胆苦苷不低于150mg(HPLC法测定)。

例7主要由马钱酸和龙胆苦苷组成的龙胆有效部位的片剂制备

片剂处方：

龙胆有效部位 100g

玉米淀粉 300g

乳糖 70g

L-HPC 20g

交联CMC-Na 20g

硬脂酸镁 4.0g

制成1000片

制法：按照上述制剂处方，取龙胆有效部位，加入淀粉、乳糖、L-HPC，以95％乙醇作为黏合剂，过20目筛制软材，60℃干燥，整粒，加交联CMC-Na和硬脂酸镁混匀后压片；以7％的LE薄膜包衣即得。

质量指标：每片含有龙胆有效部位100mg，每粒含马钱酸和龙胆苦苷不低于50mg(HPLC法测定)。

Claims

1、一种主要由马钱酸和龙胆苦苷组成的龙胆有效部位的制备方法，其特征在于该制备方法包括下列步骤：

(1)取龙胆药材粗粉，以30-90％甲醇、乙醇或丙酮热回流提取，提取液减压浓缩至每毫升浓缩液含有1-5g药材，冷藏24小时以上，离心或过滤除去沉淀，得到提取液；

(2)取步骤(1)得到的提取液，以DIAION HP20为填料的柱色谱进行纯化，每克填料上0.5-2.5mL药液，先以2-3倍柱床体积的去离子水冲洗，再以2-4倍柱床体积的40-70％甲醇或40-70％乙醇洗脱，收集醇洗脱液，减压挥干，真空干燥，得到主要由马钱酸和龙胆苦苷组成的龙胆有效部位。

2、一种根据权利要求1所述制备方法得到的主要由马钱酸和龙胆苦苷组成的龙胆有效部位，其特征在于马钱酸和龙胆苦苷的重量百分比为50-95％。

3、一种中药制剂，其特征在于该制剂含20-90重量％的由权利要求1所述方法制得的主要由马钱酸和龙胆苦苷组成的龙胆有效部位和10-80重量％药用辅料。

4、一种如权利要求3所述的中药制剂，其具体剂型为水针剂、粉针剂、片剂、软胶囊剂、硬胶囊剂、颗粒剂。

5、根据权利要求1所述制备方法得到的主要由马钱酸和龙胆苦苷组成的龙胆有效部位在制备用于治疗肝损伤药物的用途。

6、权利要求5所述的用途，其特征在于根据权利要求1所述制备方法得到的主要由马钱酸和龙胆苦苷组成的龙胆有效部位，其中马钱酸和龙胆苦苷的重量百分比为50-95％。