CN108976308B - 辽东楤木根多糖提取物及其制备方法和在肝损伤保护中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了辽东楤木根多糖提取物及其制备方法和在肝损伤保护中的用途。所述辽东楤木根多糖提取物的制备方法包括:(1)将辽东楤木根用水加热回流提取得到水提取液;(2)水提取液加入乙醇沉淀多糖,离心,取沉淀用水复溶,透析;(3)将透析袋内的溶液去除色素后冷冻干燥,即得。本发明所提供的楤木根多糖提取物的制备方法工艺简便,易于操作,重现性良好,成本低,易于大规模生产。药理药效学实验证明,本发明所制备的楤木根多糖提取物具有确切的肝损伤保护药理作用,可应用于临床预防或治疗肝损伤。
Description
技术领域
本发明涉及辽东楤木根(Aralia elata(Miq.)Seem.Roots)多糖提取物及其制备方法,本发明进一步涉及辽东楤木根多糖提取物在制备肝损伤保护药物中的用途,属于辽东楤木根多糖提取物及其医药用途领域。
背景技术
中国肝脏疾病发病率较高,仅肝癌而言,其发病率位居恶性肿瘤第4,死亡率第2。就目前而言,治疗肝损伤的药物药效性有限,而且有一定的副作用和耐药性。与之相比,中草药以其疗效独特、毒副作用小、开发潜能巨大引起人们广泛的关注,中草药的研究将是治疗药物开发的有效途径。
辽东楤木(Aralia elata(Miq.)Seem.)是伞形目五加科植物。现代医学证明辽东楤木根具有抗肿瘤、镇静、镇痛、抗胃溃疡等作用。目前对楤木研究保护肝损伤作用有效成分大多为楤木皂苷成分,而对于楤木多糖的药理活性尚未见报道。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种辽东楤木根多糖提取物;
本发明的目的之二是提供一种制备所述辽东楤木根多糖提取物的方法;
本发明的目的之三是将所述的辽东楤木根多糖提取物应用于肝损伤保护。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的:
辽东楤木根多糖提取物的制备方法,包括以下步骤:
(1)将辽东楤木根用水加热回流提取得到水提取液;
(2)将水提取液加入乙醇沉淀多糖,离心,取沉淀用水复溶,透析;
(3)将透析袋内的溶液去除色素后冷冻干燥,即得。
其中,步骤(1)中向辽东楤木根可加入3-20倍质量的水加热回流提取1-5次,每次可提取0.5-5h;作为本发明的一种优选的实施方式,步骤(1)中向辽东楤木根加10倍质量的水加热回流提取3次,每次提取2h,将得到水提取液过滤后进行合并。
作为本发明的一种优选的实施方式,步骤(2)将水提取液加入乙醇至50-90%浓度沉淀多糖;更优选的,步骤(2)将水提取液加入乙醇至75%浓度沉淀多糖。
步骤(3)中去除透析袋内溶液中色素的方式可以是柱层析或凝胶分离等手段,作为本发明的一种优选的实施方式,可以将透析袋内的溶液采用Sephadex G50去除色素。
本发明采用CCl4建立肝损伤模型小鼠,以血清中转移酶(ALT、AST)含量,肝组织中炎性因子(TNF-α、IL-6、IL-8)以及氧化应激相关因子(SOD、GSH-Px、MDA)的水平为指标,考察所制备的楤木根多糖提取物对小鼠的肝损伤代谢指标、肝损伤程度、自由基代谢水平的影响,以确证其是否具有确切的保护肝损伤的药理作用。试验结果发现,楤木根多糖提取物给药组炎性因子含量显著降低(p<0.05)并恢复到与正常大鼠相近水平。楤木根多糖提取物给药组的SOD与GSH-Px活力水平明显增加,且具有显著意义,并且呈现一定的剂量依赖性(p<0.05)。楤木根多糖提取物给药组大鼠血清中MDA水平明显减少(p<0.05),且具有一定的剂量依赖性。楤木根多糖提取物给药组高、低剂量小鼠肝脏病变程度与模型组比较有明显改善,高剂量组尤为明显。根据这些试验结果证实,本发明所提供的辽东楤木根多糖具有确切地保护肝损伤活性,能够在临床上用于肝损伤的预防或治疗。
因此,本发明提供了一种预防或治疗肝损伤的药物组合物,该药物组合物中含有有效量的辽东楤木根多糖提取物以及药学上可接受的载体。
所述药物组合物按照中药常规制剂方法制备成适宜的临床制剂,优选为口服制剂;所述药物的剂型包括:片剂、喷雾剂、冻干粉、颗粒剂、丸剂、胶囊剂或口服液。
本发明所述辅料或载体是指药学领域常规的辅料或载体,例如:稀释剂、崩裂剂、润滑剂、赋形剂、粘合剂、助流剂、填充剂、表面活性剂等;另外,还可以在组合物中加入其它辅助剂,如香味剂和甜味剂。所述稀释剂可以是一种或几种增加片剂重量和体积的成分,常用的稀释剂包括乳糖、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、山梨醇、甘露醇以及无机钙盐等;其中最常用为乳糖、淀粉、微晶纤维素。所述崩解剂可以为交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2-6%),交联羧甲基纤维素钠(与总重量比为2-6%)、海藻酸(与总重量比为2-5%)、微晶纤维素(与总重量比为5-15%)中之一种或几种混合物。所述的润滑剂包括硬脂酸,硬脂酸钠,硬脂酸镁,硬脂酸钙,聚乙二醇,滑石粉,氢化植物油中之一种或几种混合物。润滑剂的用量范围(与总重量比)为0.10-1%,一般用量为0.25-0.75%。所述的粘合剂可以是一种或几种有利于制粒的成分;可以是淀粉浆(10-30%,与粘合剂总重量比),羟丙基甲基纤维素(2-5%,与粘合剂总重量比),聚乙烯吡咯烷酮(2-20%,与粘合剂总重量比),以聚乙烯吡咯烷酮的乙醇水溶液为佳。所述助流剂可以为微粉硅胶、滑石粉、三硅酸镁中之一种或几种混合物。所述表面活性剂可以为一种或几种能够提高润湿性和增加药物溶出的成分,常用为十二烷基硫酸钠(常用范围为0.2-6%,与总重量比)。
本发明所提供的楤木根多糖提取物的制备方法工艺简便,易于操作,重现性良好,成本低,易于大规模生产。药效学实验证明,本发明所提供的楤木根多糖提取物具有确切的肝损伤保护作用,临床可应用于预防或治疗肝损伤。
附图说明
图1楤木根多糖单糖组成;1,木糖;2,阿拉伯糖;3,核糖;4,鼠李糖;5,葡萄糖醛酸;6,半乳糖醛酸;7,甘露糖;8,葡萄糖;9,半乳糖。
图2空白组肝组织HE染色结果。
图3阳性对照组肝组织HE染色结果。
图4模型组肝组织HE染色结果。
图5模型组肝组织HE染色结果。
图6多糖高剂量组肝组织HE染色结果。
图7多糖低剂量组肝组织HE染色结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
试验材料及仪器
1.仪器与动物
1.1仪器
分析天平;旋转蒸发仪;冷冻干燥器;离心机;多功能酶标仪;RM 2125型石蜡切片机。Agilent7890A-5975C气质联用仪,配备DB-5毛细管柱(60m×0.25mm×0.25μm);
1.2动物
实验中心提供小鼠50只,清洁级,雌雄各半,体重在20~22g;
实施例1辽东楤木根多糖提取物的制备
(1)向辽东楤木根加10倍质量的水加热回流提取3次,每次提取2h,将得到水提取液过滤后进行合并得到水提取液;
(2)将步骤(1)得到的水提取液加入乙醇至75%浓度沉淀多糖,离心,取沉淀用蒸馏水复溶,放入透析袋中,用蒸馏水透析4次,每次12小时;
(3)将透析袋内溶液旋到一定小的体积后,经Sephadex G50除色素,水洗脱液冷冻干燥后冷冻干燥成淡黄色絮状粉末,即为辽东楤木根多糖提取物。
实施例2辽东楤木根多糖提取物的制备
(1)向辽东楤木根加8倍质量的水加热回流提取4次,每次提取1.5h,将得到水提取液过滤后进行合并得到水提取液;
(2)将步骤(1)得到的水提取液加入乙醇至80%浓度沉淀多糖,离心,取沉淀用蒸馏水复溶,放入透析袋中,用蒸馏水透析5次,每次8小时;
(3)将透析袋内溶液旋到一定小的体积后,经Sephadex G50除色素,水洗脱液冷冻干燥后冷冻干燥成淡黄色絮状粉末,即为辽东楤木根多糖提取物。
实施例3辽东楤木根多糖提取物的制备
(1)向辽东楤木根加12倍质量的水加热回流提取3次,每次提取2h,将得到水提取液过滤后进行合并得到水提取液;
(2)将步骤(1)得到的水提取液加入乙醇至65%浓度沉淀多糖,离心,取沉淀用蒸馏水复溶,放入透析袋中,用蒸馏水透析3次,每次14小时;
(3)将透析袋内溶液旋到一定小的体积后,经Sephadex G50除色素,水洗脱液冷冻干燥后冷冻干燥成淡黄色絮状粉末,即为辽东楤木根多糖提取物。
实施例4片剂的制备
取实施例1制备的辽东楤木根多糖提取物100g,加入甘露醇25g,蔗糖25g,用5%聚维酮乙醇液湿法制粒,24目筛制粒,60℃条件下干燥4小时,20目筛整粒,加入硬脂酸镁0.5g,混和均匀,压片,制成1000片。每片含辽东楤木根多糖提取物100mg。
试验例1辽东楤木根多糖提取物的鉴别和分析
一、检测方法
1.检测样品:实施例1-3所制备的辽东楤木根多糖提取物;
2.多糖的分析
2.1多糖含量的测定
采用苯酚-硫酸法测定样品中总多糖含量。
2.2糖醛酸含量的测定
采用硫酸咔唑法,以半乳糖醛酸为标准测定样品中糖醛酸含量。
2.3辽东楤木根多糖水解
称取5mg楤木根多糖提取物样品放于安瓿瓶中,加入2mol/L TFA2mL,充入氮气,密封后于110℃水解2h。水解完毕待冷却后,反应液减压浓缩蒸干,加入适量甲醇,重复蒸干多次,除去其中残留的TFA(无酸味)。
2.4阿尔迪醇硅醚化衍生物的制备
取完全水解后的楤木根多糖提取物样品溶液1ml,加入10mg四氢硼钠和10μL氨水,室温静置1.5h,加入适量冰乙酸,浓缩至干,加入1%(v/v)盐酸甲醇溶液中和,浓缩至干,重复几次,直至无酸味。加入100μL吡啶溶解,再加入330μL六甲基二硅胺烷和110μL三甲基氯硅烷,70℃水浴,反应30min。反应后,加入100μL水,离心,取上层溶液,可直接进行气相色谱分析。
3.5标准曲线的建立
配制混合单糖标准品储备液,含Glc、Gal、Man、Ara、Xyl、Rha、Fuc、Rib、GlcUA和GalUA。肌醇设定为内标物,其浓度为2.0mg/mL。把混合单糖稀释成不同浓度,各单糖浓度均分别依次为0.1mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL、5.0mg/mL和10.0mg/mL,以不同浓度时的单糖对照品峰面积与内标峰面积之比为纵坐标,以每种单糖的浓度为横坐标进行线性回归分析。
4.试验结果
4.1楤木根多糖含量和糖醛酸含量
经过苯酚-硫酸法计算得检测样品中楤木根总多糖含量为94.87%;楤木根多糖中糖醛酸含量为4.30%;
4.2楤木根多糖单糖组成
10种单糖标准品和样品硅醚化衍生产物的GC-MS图谱,如图1所示,各个单糖标准品的衍生产物能很好的分离,计算出检测样品中所含单糖比例最高的是阿拉伯糖,其它含量较小,且依次为半乳糖,鼠李糖,木糖,半乳糖醛酸,葡萄糖,甘露糖,核糖和葡萄糖醛酸。
试验例2楤木根多糖提取物预防肝损伤的药效学试验
1试验方法
1.1动物分组和造模
取健康小鼠50只,随机分为5组,每组10只,分别为空白组(生理盐水0.02ml/g);阳性组(护肝片,200mg/kg);模型对照组(生理盐水0.02ml/g);实施例1制备的多糖提取物高剂量组(1200mg/kg);实施例1制备的多糖提取物低剂量组(300mg/kg);各组连续给药10天。最后一天给药2小时后,除空白组外,其余各组小鼠的腹腔内均注射0.2%CCl4的食用油溶液10ml/kg,空白组则注射食用油10ml/kg,开始对小鼠禁食但不禁水,18小时后,对各组小鼠进行眼眶采血,离心(3000r/min)后取血清,待测其血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的活性。取血后,进行脱臼处死,解剖并摘取肝脏部分置于甲醛溶液中固定,进行苏木素-伊红(HE)染色观察肝损伤组织病理切片。其余放入盐水中,冷藏保存,待测其肝脏中超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA),白介素-6(IL-6),白介素-8(IL-8),肿瘤坏死因子-α(TNF-α),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)的活性。
1.2测定ALT和AST的活性
严格按照试剂盒说明步骤进行,测定血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶AST的活性。
1.3测定肝脏中SOD、MDA、IL-6、IL-8、TNF-α、GSH的活性
称取适量肝脏,以肝脏(g):生理盐水(ml)=1:9的比例,制成10%的组织匀浆,按照试剂盒说明步骤进行,测定组合匀浆中超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA),白介素-6(IL-6),白介素-8(IL-8),肿瘤坏死因子-α(TNF-α),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)的活性。
1.4肝脏病理学检查
多聚甲醛固定后的肝组织经常规脱水、石蜡包蜡、切片后,经苏木素-伊红(HE)染色,观察肝组织病理学改变。
1.5统计学分析
2.试验结果
2.1楤木根多糖提取物对CCl4诱导肝损伤模型小鼠AST、ALT、转氨酶含量的影响
由表1可以看出,通过四氯化碳诱导肝损伤实验,与空白组相比,模型组小鼠血清AST、ALT、水平明显升高,具有显著性统计学差异(p<0.01),与模型组相比,阳性药组与给药组炎性因子含量显著降低(p<0.05),并恢复到与正常大鼠相近水平。
表1
**p<0.01versus the model group.
*p<0.05versus the model group.
2.2楤木根多糖对CCl4诱导肝损伤模型小鼠SOD、MDA、GSH水平的影响
由表2可以看出,与空白组相比,肝损伤模型组肝组织中SOD与GSH-Px水平明显降低(p<0.05);与模型组相比,阳性药组、给药组的SOD与GSH-Px活力水平明显增加,且具有显著意义,并且呈现一定的剂量依赖性(p<0.05)。
同时,与空白组相比,肝损伤模型组肝组织中MDA水平明显升高(p<0.05);与模型组相比,阳性药组、给药组组大鼠血清中MDA水平明显减少(p<0.05),且具有一定的剂量依赖性。
表2
**p<0.01versus the model group.
*p<0.05versus the model group.
2.3楤木根多糖对CCl4诱导肝损伤模型小鼠TNF-α、IL-6、IL-8炎症因子的影响
由表3可以看出,通过四氯化碳诱导肝损伤实验,与空白组相比,模型组大鼠肝组织中的炎性因子TNF-α、IL-6、IL-8、含量明显增加(p<0.05)。与模型组相比,阳性药组与给药组炎性因子含量显著降低(p<0.05),并恢复到与正常大鼠相近水平。
表3
**p<0.01versus the model group.
*p<0.05versus the model group.
2.4楤木根多糖对CCl4诱导肝损伤模型小鼠肝脏组织病变化的影响
肝组织切片经HE染色后光镜下观察,正常组小鼠肝组织清晰,肝小叶结构完整肝细胞呈放射状排列,汇管区清楚,肝细胞形态基本正常。模型组小鼠肝脏可见肝细胞部分坏死,肝细胞气泡样变、包浆嗜伊红增强、水样变性,部分可见散在脂质空泡;辽东楤木根多糖提取物给药组高、低剂量小鼠肝脏病变程度与模型组比较有明显改善,其中,高剂量组的改善尤为明显(图2-图7)。
Claims (7)
1.辽东楤木根(Aralia elata(Miq.) Seem. Roots)多糖提取物在制备预防或治疗肝损伤药物中的用途;所述辽东楤木根多糖提取物的制备方法,包括以下步骤:
(1)将辽东楤木根用水加热回流提取得到水提取液;
(2)将水提取液加入乙醇沉淀多糖,离心,取沉淀用水复溶,透析;
(3)将透析袋内的溶液去除色素后冷冻干燥,即得。
2.按照权利要求1所述的用途,其特征在于:步骤(1)中向辽东楤木根加入3-20倍质量的水加热回流提取1-5次,每次提取0.5-5 h,将得到水提取液过滤后进行合并。
3.按照权利要求2所述的用途,其特征在于:步骤(1)中向辽东楤木根加10倍质量的水加热回流提取3次,每次提取2h。
4.按照权利要求1所述的用途,其特征在于:步骤(2)将水提取液加入乙醇至50-90%浓度沉淀多糖。
5.按照权利要求4所述的用途,其特征在于:步骤(2)将水提取液加入乙醇至75%浓度沉淀多糖。
6.按照权利要求1所述的用途,其特征在于:步骤(3)中采用柱层析或凝胶分离方式去除透析袋内溶液中的色素。
7.按照权利要求6所述的用途,其特征在于:所述的凝胶分离方式是Sephadex G50。
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