CN110117333B - 一种分离的防风多糖及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及医药领域。本申请涉及一种分离的防风多糖及其在制备用于治疗糖尿病或高脂血症的药物中的用途。特别地，本申请涉及一种包含L‑阿拉伯糖、D‑半乳糖醛酸、D‑甘露糖、D‑葡萄糖和D‑半乳糖的分离的防风多糖，其中L‑阿拉伯糖、D‑半乳糖醛酸、D‑甘露糖、D‑葡萄糖和D‑半乳糖的摩尔比为1‑20：1‑10：1‑10：1‑15：1‑10，优选为10‑15：1‑5：1‑5：5‑10：5‑10。

Description

一种分离的防风多糖及其用途
技术领域
本申请涉及医药领域。具体而言，本申请涉及一种分离的防风多糖(Saposhnikovia Divaricata polysaccharide，SDP)及其在制备用于治疗糖尿病或高脂血症的药物中的用途。
背景技术
近年的研究发现，糖类物质不仅是一类重要的结构物质和能量物质，而且还具有重要的生物学功能。糖类物质参与细胞间的相互识别及信息传递过程，被认为是生物体内除核酸以外的又一类重要的信息分子。而且，糖类物质还是细胞表面信号识别、抗原抗体反应、细胞间信息传递和感受的关键因子。因此，对具有生物活性的多糖的研究日益受到重视。由于糖类物质结构复杂，其分离及结构鉴定均很困难。到目前为止，只有云芝多糖、猪苓多糖、香菇多糖、裂褶多糖、茯苓多糖等用于临床。本领域中需要更多具有生物活性的多糖。
中药防风为伞形科植物防风的未抽花茎植株的干燥根。防风常用于治疗感冒头痛、风湿麻痹、风疹瘙痒、和破伤风等疾病。
防风主要的化学成分有挥发油、色原酮、香豆素、有机酸、防风多糖等。防风多糖是一种由多种单糖连接成的支链多糖。通常，通过其中所含的单糖组成及其连接方式来表征防风多糖。通过不同提取方法制得的各种防风多糖的单糖组成及其连接方式彼此并不相同。窦红霞等(防风的化学成分与药理作用研究进展，中医药信息，2009，26(2)，15)从防风中提取得到多种防风多糖：XC-1(平均分子量为13100)、XC-2(平均分子量为73500)、Saponikovan A、B、C(分子量分别为54000、280000、132000)。防风多糖在本领域中通常用于抗肿瘤、抗氧化、提高机体免疫力等。迄今尚未报道防风多糖用于治疗糖尿病或高脂血症。
糖尿病(diabetes mellitus)是指由于胰岛素分泌缺陷和/或胰岛素不能发挥正常生理作用所致的以高血糖为特征的代谢疾病。糖尿病还可以引发多种并发症，例如糖尿病性心脏病、糖尿病性眼病、糖尿病性血管病等。糖尿病是当前严重威胁公共健康的慢性疾病。
高脂血症(Hyperlipoidemia)是指血液中一种或多种脂质水平异常(例如，多种脂质水平高于正常水平)的代谢疾病。高脂血症表现为血液中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平过高或高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平过低。近年来，高脂血症的发病率不断上升。高脂血症还与一些严重的心脑血管疾病(比如动脉粥样硬化、冠心病等)密切相关。
发明内容
由于糖类物质结构复杂，不同的提取方式会直接影响到多糖的结构组成，从而影响药效。本发明提供一种改进的制备防风多糖的方法，所述方法包括碱性提取和梯度沉淀的步骤。经结构分析，发现本发明所述的分离的防风多糖与已知的防风多糖结构完全不相同。经动物试验验证，发现本发明所述分离的防风多糖具有潜在的治疗糖尿病和调节血脂的作用。
本申请的一个方面提供了一种包含L-阿拉伯糖(L-Ara)、D-半乳糖醛酸(D-GlaA)、D-甘露糖(D-Man)、D-葡萄糖(D-Glc)和D-半乳糖(D-Gal)等单糖的分离的防风多糖，其中L-阿拉伯糖、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖的摩尔比为1-20：1-10：1-10：1-15：1-10，优选为10-15：1-5：1-5：5-10：5-10。
一种实施方式中，所述分离的防风多糖包含的单糖组分以特定的方式相互连接在一起。所述L-阿拉伯糖包括1,4-连接的L-阿拉伯糖和/或1,3,4-连接的L-阿拉伯糖；所述D-半乳糖醛酸包括端基D-半乳糖醛酸和/或1,3-连接的D半乳糖醛酸；所述D-甘露糖包括1,6-连接的D-甘露糖；所述D-葡萄糖包括1,4-连接的D-葡萄糖和/或1,3,6-连接的D-葡萄糖；或所述D-半乳糖包括1,4-连接的D-半乳糖。
在一种优选的实施方式中，本申请L-阿拉伯糖包括1,4-连接的L-阿拉伯糖和/或1,3,4-连接的L-阿拉伯糖。
在一种优选的实施方式中，本申请所述D-半乳糖醛酸包括端基D-半乳糖醛酸和/或1,3-连接的D半乳糖醛酸。
在一种优选的实施方式中，本申请所述D-甘露糖包括1,6-连接的D-甘露糖。
在一种优选的实施方式中，本申请所述D-葡萄糖包括1,4-连接的D-葡萄糖和/或1,3,6-连接的D-葡萄糖。
在一种优选的实施方式中，本申请所述D-半乳糖包括1,4-连接的D-半乳糖。
在一种实施方式中，所述分离的防风多糖包含1,4-连接的L-阿拉伯糖、1,3,4-连接的L-阿拉伯糖、端基D-半乳糖醛酸、1,3-连接的D半乳糖醛酸、1,6-连接的D-甘露糖、1,4-连接的D-葡萄糖、1,3,6-连接的D-葡萄糖和1,4-D-连接的半乳糖。在另一优选实施方式中，所述1,4-连接的L-阿拉伯糖：1,3,4-连接的L-阿拉伯糖：端基D-半乳糖醛酸：1,3-连接的D半乳糖醛酸：1,6-连接的D-甘露糖：1,4-连接的D-葡萄糖：1,3,6-连接的D-葡萄糖：1,4-D-连接的半乳糖的摩尔比为1-10：1-10：1-5：1-5：1-10：1-10：1-5：1-10，优选为1-5：5-10：1-3：1-3：1-5：1-5：1-3：5-10。
在一种优选的实施方式中，本申请提供一种包含L-阿拉伯糖、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖的分离的防风多糖，其中所述L-阿拉伯糖包括1,4-连接的L-阿拉伯糖和/或1,3,4-连接的L-阿拉伯糖；所述D-半乳糖醛酸包括端基D-半乳糖醛酸和/或1,3-连接的D半乳糖醛酸；所述D-甘露糖包括1,6-连接的D-甘露糖；所述D-葡萄糖包括1,4-连接的D-葡萄糖和/或1,3,6-连接的D-葡萄糖；或所述D-半乳糖包括1,4-连接的D-半乳糖。在进一步优选的实施方式中，所述1,4-连接的L-阿拉伯糖：1,3,4-连接的L-阿拉伯糖：端基D-半乳糖醛酸：1,3-连接的D半乳糖醛酸：1,6-连接的D-甘露糖：1,4-连接的D-葡萄糖：1,3,6-连接的D-葡萄糖：1,4-连接的D-半乳糖的摩尔比为1-10：1-10：1-5：1-5：1-10：1-10：1-5：1-10，优选为1-5：5-10：1-3：1-3：1-5：1-5：1-3：5-10。
在一种优选的实施方式中，本申请所述分离的防风多糖分子量为5×104至5×105Da，优选地为1×105至3.5×105Da。
在另一种实施方式中，所述单糖中的一种或多种是吡喃糖；在一种优选的实施方式中，所述单糖都是吡喃糖。
本申请在另一个方面提供一种制备分离的防风多糖的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)用碱性溶液一次或多次提取防风，得到防风碱性提取液；
(2)向所述防风碱性提取液加入酸以调节pH至7.0，以得到中性提取液，任选浓缩所述中性提取液；
(3)向所述中性提取液加入有机溶剂以得到有机溶剂浓度为15-30％的混合物，离心处理所述混合物以得到上清液；
(4)向所述上清液中加入有机溶剂以得到有机溶剂浓度为70-90％的混合物，离心处理所述混合物以得到沉淀；
(5)干燥所述沉淀，以得到所述的分离的防风多糖。
在一种实施方式中，所述步骤(1)所述碱性溶液选自氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液、碳酸钠水溶液、碳酸氢钠水溶液、碳酸钾水溶液或碳酸氢钾水溶液中的一种或多种，优选氢氧化钠水溶液。
在一种实施方式中，所述步骤(1)所述碱性溶液的浓度为0.01-5mol/L，优选为0.1-1mol/L。
在一种实施方式中，所述步骤(1)中碱性溶液与防风的体积重量比为8：1至30：1，优选20：1至30：1。
在一种实施方式中，所述步骤(2)所述的酸选自盐酸、磷酸、硝酸、甲酸、乙酸中的一种或多种，优选为盐酸。
在一种实施方式中，所述步骤(3)中的有机溶剂浓度优选为17-28％，更优选20-25％。在一些实施方式中，所述步骤(3)也被称为第一梯度沉淀。
在一种实施方式中，所述步骤(4)中的有机溶剂浓度优选为75-85％，更优选80-85％。
在一种实施方式中，所述步骤(1)中所述提取温度为40-100℃，优选60-100℃，更优选80-100℃、最优选90-95℃。在一种实施方式中，所述步骤(1)中所述提取时间为1-4小时，优选1-2小时。在一种实施方式中，所述步骤(1)中用碱性溶液提取防风的次数为1、2、3或4次。
在一种实施方式中，所述步骤(4)和(5)之间还存在步骤(4’)：用水溶解步骤(4)所得沉淀以得到水溶液，向所述水溶液加入有机溶剂以得到有机溶剂浓度为70-90％、优选为75-85％、更优选80-85％的混合物，离心处理所述混合物以得到沉淀；步骤(4’)可以重复一次或多次，优选1、2或3次。
在一些实施方式中，所述步骤(4)和(4’)也被称为第二梯度沉淀。
在一种实施方式中，所述步骤(3)和/或(4)和/或(4’)中所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、或其混合物，优选乙醇。
本申请所述防风包括商业上可获得的药材防风(即植物防风的未抽花茎植株的干燥根)和防风饮片。在一种实施方式中，本申请所述防风是防风饮片。
术语“分离的防风多糖”是指通过人工手段(例如提取、纯化等)将防风多糖从其原始植物原料的自然环境中分离出来而得到的防风多糖。所述植物原料可以是植物形式的防风或药材形式的防风，例如植物防风的未抽花茎植株的干燥根或防风饮片。
本申请在另一个方面提供一种分离的防风多糖，其是根据本申请所述方法获得的。在一种优选的实施方式中，所述分离的防风多糖包含L-阿拉伯糖、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖的防风多糖，其中L-阿拉伯糖、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖的摩尔比为1-20：1-10：1-10：1-15：1-10，优选为10-15：1-5：1-5：5-10：5-10。所述L-阿拉伯糖包括1,4-连接的L-阿拉伯糖和1,3,4-连接的L-阿拉伯糖；所述D-半乳糖醛酸包括端基D-半乳糖醛酸和1,3-连接的D半乳糖醛酸；所述D-甘露糖包括1,6-连接的D-甘露糖；所述D-葡萄糖包括1,4-连接的D-葡萄糖和1,3,6-连接的D-葡萄糖；所述D-半乳糖包括1,4-连接的D-半乳糖。在进一步优选的实施方式中，所述1,4-连接的L-阿拉伯糖：1,3,4-连接的L-阿拉伯糖：端基D-半乳糖醛酸：1,3-连接的D-半乳糖醛酸：1,6-连接的D-甘露糖：1,4-连接的D-葡萄糖：1,3,6-连接的D-葡萄糖：1,4-连接的D-半乳糖的摩尔比为1-10：1-10：1-5：1-5：1-10：1-10：1-5：1-10，优选为1-5：5-10：1-3：1-3：1-5：1-5：1-3：5-10。
所述1,4-连接的L-阿拉伯糖是指通过糖环1和4位上的糖苷键与相邻基团(例如相邻单糖残基)连接的L-阿拉伯糖。
所述1,3,4-连接的L-阿拉伯糖是指通过糖环1、3和4位上的糖苷键与相邻基团(例如相邻单糖残基)连接的L-阿拉伯糖。
所述端基D-半乳糖醛酸是指通过糖环1位上的糖苷键与相邻基团(例如相邻单糖残基)连接的D-半乳糖醛酸。
所述1,3-连接的D半乳糖醛酸是指通过糖环1和3位上的糖苷键与相邻基团(例如相邻单糖残基)连接的D-半乳糖醛酸。
所述1,6-连接的D-甘露糖是指通过糖环1和6位上的糖苷键与相邻基团(例如相邻单糖残基)连接的D-甘露糖。
所述1,4-连接的D-葡萄糖是指通过糖环1和4位上的糖苷键与相邻基团(例如相邻单糖残基)连接的D-葡萄糖。
所述1,3,6-连接的D-葡萄糖是指通过糖环1、3和6位上的糖苷键与相邻基团(例如相邻单糖残基)连接的D-葡萄糖。
所述1,4-连接的D-半乳糖是指通过糖环1和4位上的糖苷键与相邻基团(例如相邻单糖残基)连接的D-半乳糖。
本申请所述糖可以是α构型或β构型。
本申请在另一个方面提供了本发明所获得的分离的防风多糖在制备治疗糖尿病或高脂血症药物中的用途。
本申请在另一个方面提供了一种药物组合物，包含治疗有效量的本发明所获得的分离的防风多糖，以及药学上可接受的载体。
在一种优选的实施方式中，所述药物组合物是片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、悬浮液、溶液、分散剂、用于口服或非口服给药的缓释制剂、静脉注射制剂、皮下注射制剂、吸入制剂、透皮制剂、直肠或阴道栓剂。
本申请所述药学上可接受载体是指本领域技术人员熟知的药学上可接受载体，本申请的药学上可接受载体包括但不限于：填充剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂、助流剂、掩味剂、表面活性剂、防腐剂等。填充剂包括但不限于乳糖、微晶纤维素、淀粉、糖粉、糊精、甘露醇、硫酸钙等。润湿剂与黏合剂包括但不限于羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、明胶、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮等。崩解剂包括但不限于羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素等。润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇、月桂醇硫酸镁等。粘合剂包括但不限于阿拉伯胶、藻酸、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、葡萄糖结合剂、糊精、右旋糖、乙基纤维素、明胶、液体葡萄糖、瓜尔胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硅酸铝镁、麦芽糖糊精、甲基纤维素、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、预明胶化淀粉、藻酸钠、山梨醇、淀粉、糖浆和黄蓍胶。助流剂包括但不限于胶体二氧化硅、粉状纤维素、三硅酸镁、二氧化硅和滑石粉。掩味剂包括但不限于阿斯巴坦、甜菊苷、果糖、葡萄糖、糖浆、蜂蜜、木糖醇、甘露醇、乳糖、山梨醇、麦芽糖醇、甘草甜素。表面活性剂包括但不限于吐温-80、泊洛沙姆。防腐剂包括但不限于尼泊金酯、苯甲酸钠、山梨酸钾等。
制备各种含有各种比例活性成分的药物组合物的方法是已知的，或根据本申请的公开内容对于本领域技术人员是显而易见的。如REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES,Martin,E.W.,ed.,Mack Publishing Company,19th ed.(1995)所述。制备所述药物组合物的方法包括掺入适当的药学赋形剂、载体、稀释剂等。以已知的方法制造本申请所述药物组合物，包括常规的混合、溶解或冻干方法。
在本申请所述药物组合物中，活性成分的比例可以变化，可占给定的单位剂型重量的大约0.01％至大约99％。在这种治疗有用的药物组合物制剂中，活性成分的量使得能够获得有效剂量水平。
本申请所述的片剂、胶囊剂等可以包含：粘合剂，如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸氢二钙；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂，如硬脂酸镁；和甜味剂，如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦；或调味剂，如薄荷、冬青油或樱桃香味。当单位剂型是胶囊时，除了上面类型的材料，它还可以包含液体载体，如植物油或聚乙二醇。各种其他材料可以存在，作为包衣，或以其他方式改变固体单位剂型的物理形式。例如，片剂或胶囊剂可以用明胶、蜡、虫胶或糖等包衣。糖浆可以包含活性成分，蔗糖或果糖作为甜味剂，对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯作为防腐剂，染料和调味剂(如樱桃香料或桔子香料)。当然，用于制备任何单位剂型的任何材料应该是药学上可以接受的且以应用的量为无毒。此外，活性成分可以掺入缓释制剂和缓释装置中。
活性成分也可以通过输注或注射到静脉内或腹膜内施用。可以制备活性成分或其盐的水溶液，任选可混和无毒的表面活性剂。也可以制备在甘油、液体聚乙二醇、甘油三乙酸酯及其混合物以及油中的分散剂。在普通的储存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物生长。
适于注射或输注的药物组合物剂型可以包括包含适于无菌的可注射或可输注的溶液或分散剂的即时制剂的活性成分(任选封装在脂质体中)的无菌水溶液或分散剂或无菌粉末。在所有情况下，最终的剂型在生产和储存条件下必须是无菌的、液体的和稳定的。液体载体可以是溶剂或液体分散介质，包括，例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒的甘油酯及其合适的混合物。可以维持合适的流动性，例如，通过脂质体的形成，通过在分散剂的情况下维持所需的粒子大小，或通过表面活性剂的使用。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)产生预防微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，如糖、缓冲剂或氯化钠。通过使用延缓吸收剂的组合物(例如，单硬脂酸铝和明胶)可以产生可注射的组合物的延长吸收。
通过将合适的溶剂中的需要量的活性成分与需要的上面列举的各种其他成分结合，然后进行过滤灭菌，制备无菌可注射溶液。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，这会产生活性成分加上任何另外需要的无菌过滤溶液中存在的成分的粉末。
有用的固体载体包括粉碎的固体(如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等)。有用的液体载体包括水、乙醇或乙二醇或水-乙醇/乙二醇混合物，本申请的药物组合物可以任选在无毒的表面活性剂的帮助下以有效含量溶解或分散在其中。可以加入佐剂(如香味)和另外的抗微生物剂来优化对于给定用途的性质。
增稠剂(如合成的聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或改性无机材料)也可和液体载体用于形成可涂覆的糊剂、凝胶、软膏、肥皂等，直接用于使用者的皮肤上。
活性成分的治疗有效量，不仅取决于选择的特定的盐，而且取决于施药方式、待治疗的疾病的性质和患者的年龄和状态，最终取决于在场医师或临床医生的决定。
上述制剂可以以单位剂型存在，该单位剂型是含有单位剂量的物理分散单元，适于向人体和其它哺乳动物体给药。单位剂型可以是胶囊或片剂。根据所涉及的具体治疗，活性成分的单位剂量的量可以在大约0.01到大约1000毫克或更多之间进行变化或调整。
本申请在另一个方面提供了含有治疗有效量的本发明所获得的分离的防风多糖的药物组合物在制备用于治疗糖尿病或高脂血症的药物中的用途。
在还有另一个方面，本申请提供一种治疗糖尿病或高脂血症的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明所获得的分离的防风多糖。
在一种优选的实施方式中，所述的治疗糖尿病或高脂血症的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的含有治疗有效量的本发明所获得的防风多糖的药物组合物。
在一个方面，本发明还提供分离的防风多糖，用于治疗糖尿病或高脂血症。
本申请所述治疗糖尿病包括降低血糖水平(例如降低空腹血糖水平)、改善糖耐受量、减轻胰岛细胞损伤、增加胰岛素释放等。本申请所述治疗高脂血症包括调节血脂代谢、调节血脂水平(比如降低血液中脂质的水平，例如降低血液中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的水平)。另外，本申请所述防风多糖还能增加受试者(例如血清和肝中)的超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)的活性，降低丙二醛(MDA)的含量。
本申请使用的术语“治疗”一般是指获得需要的药理和/或生理效应。该效应根据完全或部分地预防疾病或其症状，可以是预防性的；和/或根据部分或完全稳定或治愈疾病和/或由于疾病产生的副作用，可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖了对患者疾病的任何治疗，包括：(a)预防易感染疾病或症状但还没诊断出患病的患者所发生的疾病或症状；(b)抑制疾病的症状，即阻止其发展；或(c)缓解疾病的症状，即，导致疾病或症状退化。
除非特别说明，本申请所述百分数、比例、比率或份数是按体积计。本申请所述体积重量比是以毫升/克(或升/千克)计算的体积重量比。本申请所述浓度是体积浓度。
附图说明
图1：防风多糖对STZ诱导的糖尿病小鼠胰岛组织的影响。图1A：正常对照组；图1B：STZ 120mg/kg组；图1C格列本脲组25mg/kg组；图1D防风多糖50mg/kg组；图1E防风多糖200mg/kg组。STZ：链脲佐菌素。
图2：防风多糖对STZ诱导的糖尿病小鼠血清胰岛素水平的影响(
Figure BDA0001570195260000111
n＝10)。与正常对照组(正常组)比较，##P<0.01；与模型组(STZ 120mg/kg)比较，*P<0.05，**P<0.01；GLI：格列苯脲；SDP：防风多糖；STZ：链脲佐菌素。
图3：防风多糖对STZ诱导的糖尿病小鼠血清脂质的影响(
Figure BDA0001570195260000112
n＝10)。与正常对照组(正常组)比较，##P<0.01；与模型组(STZ 120mg/kg)比较，*P<0.05，**P<0.01；GLI：格列苯脲；SDP：防风多糖；STZ：链脲佐菌素。
图4：防风多糖对STZ诱导的糖尿病小鼠MDA含量和SOD活性的影响(
Figure BDA0001570195260000113
n＝10)。与正常对照组(正常组)比较，##P<0.01；与模型组(STZ 120mg/kg)比较，*P<0.05，**P<0.01；GLI：格列苯脲；SDP：防风多糖；STZ：链脲佐菌素。
图:5：防风多糖对高脂血症小鼠血脂水平的影响(
Figure BDA0001570195260000114
n＝10)。与正常对照组(正常组)比较，#P<0.05，##P<0.01；与高脂模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。
图6：防风多糖对高脂血症小鼠肝TC、TG以及肝重系数的影响(
Figure BDA0001570195260000115
n＝10)。与正常对照组(正常组)比较，##P<0.01；与高脂模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；。
图7：防风多糖对高脂血症小鼠肝形态学的影响。图7A：正常对照组；图7B：高脂模型组；图7C：力平之40mg/kg组；图7D：防风多糖50mg/kg组；图7E：防风多糖200mg/kg组。
图8：防风多糖对高脂血症小鼠肝脏SOD、GSH-px活性和MDA含量的影响(
Figure BDA0001570195260000116
n＝10)。与正常对照组(正常组)比较，#P<0.05，##P<0.01；与高脂模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。
具体实施方式
下面，本申请将通过实施例展示本申请的有益效果。本领域技术人员会知道，这些实施例是示例性的，而不是限制性的。这些实施例不会以任何方式限制本申请的范围。下述实施例中所述实验操作，如无特殊说明，均为常规操作；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
主要试剂与材料
防风饮片，购自安徽亳州中药材市场，产地安国；95％乙醇、盐酸、氢氧化钠、考马斯亮蓝、硫酸、苯酚、氯化钡、三氟乙酸、硼氢化钠、二甲基亚砜等均购自国药集团化学试剂有限公司；L-阿拉伯糖(L-Ara)、D-甘露糖(D-Man)、D-葡萄糖(D-Glc)、D-半乳糖(D-Gal)、D-半乳糖醛酸(D-GalA)对照品和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)均购自Sigma公司。
主要仪器
1260型高效液相色谱仪(DAD和RID检测器，美国Agilent公司)；DAWN HELEOS-Ⅱ型18角度激光光散射仪(美国Wayyat公司)；7890B型气相色谱质谱联用仪(美国Agilent公司)；Infinite M200型酶标微孔板读数仪(美国Tecan公司)。
实施例1：防风多糖的制备
(1)向300g防风饮片中加入0.1mol/L的NaOH水溶液9L。在90℃下用所述NaOH水溶液提取防风饮片3小时，以得到碱性提取液提取液。分离所述碱性提取液后，重复提取2次，每次使用9L 0.1mol/L的NaOH水溶液，每次3小时。合并所得碱性提取液。
(2)向所述碱性提取液中加入盐酸以调节pH至7，得到中性提取液，将所述中性提取液浓缩至2L。
(3)向所述中性提取液加入乙醇得到乙醇浓度为20％的混合物，离心处理所述混合物以得到上清液。
(4)向所述上清液中加入乙醇以得到乙醇浓度为80％的混合物，离心处理所述混合物以得到沉淀；
(4’)向所述沉淀加入0.5L蒸馏水，以使之溶解。然后，再次加入乙醇以得到乙醇浓度为80％的混合物，离心处理所述混合物以得到沉淀。
(5)干燥所得沉淀，以得到防风多糖11g，收率3.7％。
实施例2：防风多糖的制备
(1)向300g防风饮片中加入0.05mol/L的KOH水溶液9L。在40℃下用所述KOH水溶液提取防风饮片4小时，以得到碱性提取液提取液。分离所述碱性提取液后，重复提取3次，每次使用9L0.05mol/L的KOH水溶液，每次4小时。合并所得碱性提取液。
(2)向所述碱性提取液中加入甲酸以调节pH至7，得到中性提取液，将所述中性提取液浓缩至2L。
(3)向所述中性提取液加入甲醇以得到甲醇浓度为30％的混合物，离心处理所述混合物以得到上清液。
(4)向所述上清液中加入甲醇以得到甲醇浓度为90％的混合物，离心处理所述混合物以得到沉淀；
(4’)向所述沉淀加入0.5L蒸馏水，以使之溶解。然后，再次加入甲醇以得到甲醇浓度为90％的混合物，离心处理所述混合物以得到沉淀。重复步骤(4’)操作2次。
(5)干燥所得沉淀，以得到防风多糖8.8g，收率2.9％。
实施例3：防风多糖的制备
(1)向300g防风饮片中加入5mol/L的Na2CO3水溶液3L。在90℃下用所述Na2CO3水溶液提取防风饮片1小时，以得到碱性提取液提取液。分离所述碱性提取液后，重复提取3次，每次使用3L5mol/L的Na2CO3水溶液，每次1小时。合并所得碱性提取液。
(2)向所述碱性提取液中加入乙酸以调节pH至7，得到中性提取液，将所述中性提取液浓缩至2L。
(3)向所述中性提取液加入乙醇以得到乙醇浓度为15％的混合物，离心处理所述混合物以得到上清液。
(4)向所述上清液中加入乙醇以得到乙醇浓度为80％的混合物，离心处理所述混合物以得到沉淀；
(4’)向所述沉淀加入0.5L蒸馏水，以使之溶解。然后，再次加入乙醇以得到乙醇浓度为80％的混合物，离心处理所述混合物以得到沉淀。重复步骤(4’)操作1次。
(5)干燥所得沉淀，以得到防风多糖9.1g，收率3.0％。
实施例4：防风多糖的制备
(1)向300g防风饮片中加入3mol/L的NaHCO3水溶液2.4L。在100℃下用所述Na2CO3水溶液提取防风饮片1小时，以得到碱性提取液提取液。分离所述碱性提取液后，重复提取4次，每次使用2.4L3mol/L的NaHCO3水溶液，每次1小时。合并所得碱性提取液。
(2)向所述碱性提取液中加入磷酸以调节pH至7，得到中性提取液，将所述中性提取液浓缩至2L。
(3)向所述中性提取液加入丙醇以得到丙醇浓度为20％的混合物，离心处理所述混合物以得到上清液。
(4)向所述上清液中加入丙醇以得到丙醇浓度为70％的混合物，离心处理所述混合物以得到沉淀；
(4’)向所述沉淀加入0.5L蒸馏水，以使之溶解。然后，再次加入丙醇以得到丙醇浓度为70％的混合物，离心处理所述混合物以得到沉淀。
(5)干燥所得沉淀，以得到防风多糖8.5g，收率2.8％。
实施例5：防风多糖的制备
(1)向300g防风饮片中加入4mol/L的K2CO3水溶液6L。在60℃下用所述K2CO3水溶液提取防风饮片3小时，以得到碱性提取液提取液。分离所述碱性提取液后，重复提取2次，每次使用6L 4mol/L的K2CO3水溶液，每次3小时。合并所得碱性提取液。
(2)向所述碱性提取液中加入硝酸以调节pH至7，得到中性提取液，将所述中性提取液浓缩至2L。
(3)向所述中性提取液加入丙酮以得到丙酮浓度为20％的混合物，离心处理所述混合物以得到上清液。
(4)向所述上清液中加入丙酮以得到丙酮浓度为75％的混合物，离心处理所述混合物以得到沉淀；
(4’)向所述沉淀加入0.5L蒸馏水，以使之溶解。然后，再次加入丙酮以得到丙酮浓度为75％的混合物，离心处理所述混合物以得到沉淀。
(5)干燥所得沉淀，以得到防风多糖9.2g，收率3.1％。
实施例6：防风多糖的制备
(1)向300g防风饮片中加入2mol/L的KHCO3水溶液6L。在80℃下用所述KHCO3水溶液提取防风饮片2小时，以得到碱性提取液提取液。分离所述碱性提取液后，重复提取2次，每次使用6L 2mol/L的KHCO3水溶液，每次2小时。合并所得碱性提取液。
(2)向所述碱性提取液中加入盐酸以调节pH至7，得到中性提取液，将所述中性提取液浓缩至2L。
(3)向所述中性提取液加入乙醇以得到乙醇浓度为25％的混合物，离心处理所述混合物以得到上清液。
(4)向所述上清液中加入乙醇以得到乙醇浓度为80％的混合物，离心处理所述混合物以得到沉淀；
(5)干燥所得沉淀，以得到防风多糖9.1g，收率3.0％。
实施例7：防风多糖的制备
(1)向300g防风饮片中加入0.01mol/L的NaOH水溶液9L。在70℃下用所述NaOH水溶液提取防风饮片2小时，以得到碱性提取液提取液。分离所述碱性提取液后，重复提取3次，每次使用9L 0.01mol/L的NaOH水溶液，每次2小时。合并所得碱性提取液。
(2)向所述碱性提取液中加入盐酸以调节pH至7，得到中性提取液，将所述中性提取液浓缩至2L。
(3)向所述中性提取液加入乙醇以得到乙醇浓度为20％的混合物，离心处理所述混合物以得到上清液。
(4)向所述上清液中加入乙醇以得到乙醇浓度为85％的混合物，离心处理所述混合物以得到沉淀；
(4’)向所述沉淀加入0.5L蒸馏水，以使之溶解。然后，再次加入乙醇以得到乙醇浓度为85％的混合物，离心处理所述混合物以得到沉淀。
(5)干燥所得沉淀，以得到防风多糖9.6g，收率3.2％。
实施例8：防风多糖的制备
(1)向300g防风饮片中加入1mol/L的NaOH水溶液6L。在95℃下用所述NaOH水溶液提取防风饮片1小时，以得到碱性提取液提取液。分离所述碱性提取液后，重复提取1次，每次使用6L 1mol/L的NaOH水溶液，每次1小时。合并所得碱性提取液。
(2)向所述碱性提取液中加入盐酸以调节pH至7，得到中性提取液，将所述中性提取液浓缩至2L。
(3)向所述中性提取液加入乙醇以得到乙醇浓度为20％的混合物，离心处理所述混合物以得到上清液。
(4)向所述上清液中加入乙醇以得到乙醇浓度为80％的混合物，离心处理所述混合物以得到沉淀；
(4’)向所述沉淀加入0.5L蒸馏水，以使之溶解。然后，再次加入乙醇以得到乙醇浓度为80％的混合物，离心处理所述混合物以得到沉淀。
(5)干燥所得沉淀，以得到防风多糖10.3g，收率3.4％。
实施例9：防风多糖的制备
(1)向300g防风饮片中加入0.5mol/L的NaOH水溶液6L。在90℃下用所述NaOH水溶液提取防风饮片2小时，以得到碱性提取液提取液。分离所述碱性提取液后，重复提取2次，每次使用6L 0.5mol/L的NaOH水溶液，每次2小时。合并所得碱性提取液。
(2)向所述碱性提取液中加入盐酸以调节pH至7，得到中性提取液，将所述中性提取液浓缩至2L。
(3)向所述中性提取液加入乙醇以得到乙醇浓度为20％的混合物，离心处理所述混合物以得到上清液。
(4)向所述上清液中加入乙醇以得到乙醇浓度为80％的混合物，离心处理所述混合物以得到沉淀；
(4’)向所述沉淀加入0.5L蒸馏水，以使之溶解。然后，再次加入乙醇以得到乙醇浓度为80％的混合物，离心处理所述混合物以得到沉淀。
(5)干燥所得沉淀，以得到防风多糖11.6g，收率3.9％。
实施例10：防风多糖的结构鉴定
(1)总糖、糖醛酸、蛋白及硫酸基含量测定
根据硫酸-苯酚法(参见张泽庆，防风多糖的提纯、结构分析及生物活性研究，陕西师范大学硕士学位论文，2008，77页)定实施例1至实施例9所得防风多糖总糖含量。
(2)根据间羟联苯法(参见高林，MCP中糖醛酸的含量测定，化学工业与工程，2005，22(6)：487-489)测定实施例1至实施例9所得防风多糖糖醛酸含量。
(3)根据考马斯亮蓝法(参见张婕，盐炙前后关黄柏多糖基本含量测定及对免疫功能的影响，辽宁中医杂志，2017，44(6)：1263-1267)测定实施例1至实施例9所得防风多糖蛋白含量。
(4)根据BaCl2比浊法(参见陈乾，硫酸钡-比浊法测定褐藻糖胶中硫酸根的含量，药学实践杂志，2012，30(2)：118-120)测定实施例1至实施例9所得防风多糖硫酸基含量。
测定结果见下表1：
表1
实施例编号 总糖含量％ 糖醛酸含量 蛋白含量％ 硫酸基含量
1 77.17 8.92 1.28 未检测到
2 73.26 9.66 1.64 未检测到
3 75.38 7.23 1.88 未检测到
4 72.81 10.44 1.95 未检测到
5 75.74 7.57 1.29 未检测到
6 75.54 8.76 1.15 未检测到
7 76.36 7.61 1.64 未检测到
8 76.45 6.79 1.41 未检测到
9 77.97 7.44 1.32 未检测到
(5)重均分子量测定
采用多角度激光光散射法(丁厚强，多角度激光光散射仪与尺寸排阻色谱法联用测定透明质酸相对分子质量及其分布，食品与药品，2009，11(3)：24-26)测定实施例1至实施例9所得防风多糖的重均分子量。
测定方法
将10mg待测样品置于1.5mL离心管中。然后加入1mL去离子水，以使所述样品使溶解。在14000rpm转速下将所述离心管离心10min，以得到上清液。使用Agilent 1260HPLC色谱仪对所述上清液进行测定，以确定重均分子量。
色谱条件：
色谱柱：XBridge Protein BEH SEC
Figure BDA0001570195260000181
Column(3.5μm,7.8×300mm)；柱温：25℃；RID温度：35℃；流动相：0.1mol/L NaOAc溶液；流速：0.5mL/min；进样量：30μL。
测定结果见表2：
表2
Figure BDA0001570195260000182
Figure BDA0001570195260000191
(6)单糖组成分析
将2mg实施例1-9所得防风多糖分别溶解于安瓿瓶中的1mL的3mol/L的三氟乙酸(TFA)水溶液中，然后将所述安瓿瓶封口。将所述安瓿瓶中的防风多糖在105℃水解4小时。将所述安瓿瓶中的水在减压条件下蒸干后，向所述安瓿瓶中加入2mL甲醇，然后蒸干。重复添加乙醇并蒸干的操作2次以除去TFA。然后，向所述安瓿瓶中加入100μL水，得到所述多糖的酸性条件完全水解的样品。
再称取适量单糖对照品配制成浓度为1mg/mL的母液。吸取母液10μL，定容至100μL。
衍生化处理：取50μL对照品溶液，依次加入100μL 0.3mol/L NaOH溶液、120μL0.5mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液并混匀以得到混合溶液。将所述混合溶液在70℃反应60分钟。反应结束后，将所述溶液冷却至室温，加入适量0.3mol/L的HCl以调节pH值至中性，然后用1mL氯仿萃取并弃去有机相。取50μL所述多糖的酸性条件完全水解的样品，同样按照以上方法进行衍生化处理。
色谱条件：
Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱；流动相：0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH＝6.7)∶乙腈(v/v＝83∶17)；柱温25℃；检测波长245nm；流速1.0mL/min；进样体积10μL。
测定结果见下表3：
表3
实施例编号 摩尔比(L-Ara:D-GalA:D-Man:D-Glc:D-Gal)
1 13:2:2:5:8
2 2:9:2:14:9
3 14:5:4:5:8
4 18:2:8:2:7
5 15:3:5:3:6
6 13:3:4:6:5
7 14:2:4:3:6
8 15:2:2:5:7
9 12:2:3:8:6
参照文献方法(方积年，多糖的甲基化分析方法，国外医学(药学分册)，1986，(4)：222-226)分别对实施例1-9防风多糖进行甲基化。甲基化后的产物用90％甲酸解聚，并用2mol/L TFA全水解，得到甲基化单糖。然后所得甲基化单糖用NaBH4还原、并用醋酸酐乙酰化以制成所述甲基化单糖的阿尔迪醇乙酸酯衍生物，然后对所述衍生物进行GC-MS分析。
根据甲基化分析结果，可确定实施例1-9防风多糖包含以下单糖：1,4-L-阿拉伯糖、1,3,4-L-阿拉伯糖、端基D-半乳糖醛酸、1,3-D半乳糖醛酸、1,6-D-甘露糖、1,4-D-葡萄糖、1,3,6-D-葡萄糖、和1,4-D-半乳糖。甲基化分析结果见表4-12。
表4实施例1所得防风多糖的甲基化分析结果
甲基化糖残基 单糖 摩尔比
2,3-Me<sub>2</sub>-L-Ara 1,4-L-阿拉伯糖 5
2-Me-L-Ara 1,3,4-L-阿拉伯糖 8
2,3,4-Me<sub>3</sub>-D-GalA 端基D-半乳糖醛酸 2
2,4-Me<sub>2</sub>-D-GalA 1,3-D半乳糖醛酸 1
2,3,4-Me<sub>3</sub>-D-Man 1,6-D-甘露糖 2
2,3,6-Me<sub>3</sub>-D-Glc 1,4-D-葡萄糖 5
2,4-Me<sub>2</sub>-D-Glc 1,3,6-D-葡萄糖 1
2,3,6-Me<sub>3</sub>-D-Gal 1,4-D-半乳糖 8
表5实施例2所得防风多糖的甲基化分析结果
甲基化糖残基 单糖 摩尔比
2,3-Me<sub>2</sub>-L-Ara 1,4-L-阿拉伯糖 6
2-Me-L-Ara 1,3,4-L-阿拉伯糖 10
2,3,4-Me<sub>3</sub>-D-GalA 端基D-半乳糖醛酸 3
2,4-Me<sub>2</sub>-D-GalA 1,3-D半乳糖醛酸 2
2,3,4-Me<sub>3</sub>-D-Man 1,6-D-甘露糖 2
2,3,6-Me<sub>3</sub>-D-Glc 1,4-D-葡萄糖 9
2,4-Me<sub>2</sub>-D-Glc 1,3,6-D-葡萄糖 5
2,3,6-Me<sub>3</sub>-D-Gal 1,4-D-半乳糖 9
表6实施例3所得防风多糖的甲基化分析结果
甲基化糖残基 单糖 摩尔比
2,3-Me<sub>2</sub>-L-Ara 1,4-L-阿拉伯糖 5
2-Me-L-Ara 1,3,4-L-阿拉伯糖 9
2,3,4-Me<sub>3</sub>-D-GalA 端基D-半乳糖醛酸 1
2,4-Me<sub>2</sub>-D-GalA 1,3-D半乳糖醛酸 2
2,3,4-Me<sub>3</sub>-D-Man 1,6-D-甘露糖 3
2,3,6-Me<sub>3</sub>-D-Glc 1,4-D-葡萄糖 5
2,4-Me<sub>2</sub>-D-Glc 1,3,6-D-葡萄糖 3
2,3,6-Me<sub>3</sub>-D-Gal 1,4-D-半乳糖 8
表7实施例4所得防风多糖的甲基化分析结果
甲基化糖残基 单糖 摩尔比
2,3-Me<sub>2</sub>-L-Ara 1,4-L-阿拉伯糖 8
2-Me-L-Ara 1,3,4-L-阿拉伯糖 10
2,3,4-Me<sub>3</sub>-D-GalA 端基D-半乳糖醛酸 3
2,4-Me<sub>2</sub>-D-GalA 1,3-D半乳糖醛酸 1
2,3,4-Me<sub>3</sub>-D-Man 1,6-D-甘露糖 8
2,3,6-Me<sub>3</sub>-D-Glc 1,4-D-葡萄糖 1
2,4-Me<sub>2</sub>-D-Glc 1,3,6-D-葡萄糖 1
2,3,6-Me<sub>3</sub>-D-Gal 1,4-D-半乳糖 7
表8实施例5获得的防风多糖的甲基化分析结果
甲基化糖残基 单糖 摩尔比
2,3-Me<sub>2</sub>-L-Ara 1,4-L-阿拉伯糖 5
2-Me-L-Ara 1,3,4-L-阿拉伯糖 10
2,3,4-Me<sub>3</sub>-D-GalA 端基D-半乳糖醛酸 1
2,4-Me<sub>2</sub>-D-GalA 1,3-D半乳糖醛酸 2
2,3,4-Me<sub>3</sub>-D-Man 1,6-D-甘露糖 5
2,3,6-Me<sub>3</sub>-D-Glc 1,4-D-葡萄糖 4
2,4-Me<sub>2</sub>-D-Glc 1,3,6-D-葡萄糖 2
2,3,6-Me<sub>3</sub>-D-Gal 1,4-D-半乳糖 6
表9实施例6所得防风多糖的甲基化分析结果
甲基化糖残基 单糖 摩尔比
2,3-Me<sub>2</sub>-L-Ara 1,4-L-阿拉伯糖 3
2-Me-L-Ara 1,3,4-L-阿拉伯糖 10
2,3,4-Me<sub>3</sub>-D-GalA 端基D-半乳糖醛酸 2
2,4-Me<sub>2</sub>-D-GalA 1,3-D半乳糖醛酸 1
2,3,4-Me<sub>3</sub>-D-Man 1,6-D-甘露糖 4
2,3,6-Me<sub>3</sub>-D-Glc 1,4-D-葡萄糖 5
2,4-Me<sub>2</sub>-D-Glc 1,3,6-D-葡萄糖 3
2,3,6-Me<sub>3</sub>-D-Gal 1,4-D-半乳糖 5
表10实施例7所得防风多糖的甲基化分析结果
甲基化糖残基 单糖 摩尔比
2,3-Me<sub>2</sub>-L-Ara 1,4-L-阿拉伯糖 5
2-Me-L-Ara 1,3,4-L-阿拉伯糖 9
2,3,4-Me<sub>3</sub>-D-GalA 端基D-半乳糖醛酸 1
2,4-Me<sub>2</sub>-D-GalA 1,3-D半乳糖醛酸 2
2,3,4-Me<sub>3</sub>-D-Man 1,6-D-甘露糖 4
2,3,6-Me<sub>3</sub>-D-Glc 1,4-D-葡萄糖 4
2,4-Me<sub>2</sub>-D-Glc 1,3,6-D-葡萄糖 5
2,3,6-Me<sub>3</sub>-D-Gal 1,4-D-半乳糖 6
表11实施例8所得防风多糖的甲基化分析结果
甲基化糖残基 单糖 摩尔比
2,3-Me<sub>2</sub>-L-Ara 1,4-L-阿拉伯糖 4
2-Me-L-Ara 1,3,4-L-阿拉伯糖 7
2,3,4-Me<sub>3</sub>-D-GalA 端基D-半乳糖醛酸 1
2,4-Me<sub>2</sub>-D-GalA 1,3-D半乳糖醛酸 1
2,3,4-Me<sub>3</sub>-D-Man 1,6-D-甘露糖 2
2,3,6-Me<sub>3</sub>-D-Glc 1,4-D-葡萄糖 5
2,4-Me<sub>2</sub>-D-Glc 1,3,6-D-葡萄糖 3
2,3,6-Me<sub>3</sub>-D-Gal 1,4-D-半乳糖 7
表12实施例9获得的防风多糖的甲基化分析结果
甲基化糖残基 单糖 摩尔比
2,3-Me<sub>2</sub>-L-Ara 1,4-L-阿拉伯糖 5
2-Me-L-Ara 1,3,4-L-阿拉伯糖 7
2,3,4-Me<sub>3</sub>-D-GalA 端基D-半乳糖醛酸 1
2,4-Me<sub>2</sub>-D-GalA 1,3-D半乳糖醛酸 1
2,3,4-Me<sub>3</sub>-D-Man 1,6-D-甘露糖 3
2,3,6-Me<sub>3</sub>-D-Glc 1,4-D-葡萄糖 4
2,4-Me<sub>2</sub>-D-Glc 1,3,6-D-葡萄糖 1
2,3,6-Me<sub>3</sub>-D-Gal 1,4-D-半乳糖 6
实施例11：降血糖作用实验
实验药物：实施例9制备的分离的防风多糖，分别以50mg/kg(低剂量)和200mg/kg(高剂量)的剂量施用。
实验试剂：葡萄糖测定试剂盒，由上海荣盛生物药业有限公司提供；胰岛素ELISA测定试剂盒，由上海西唐实业有限公司提供；TC、TG、HDL-C、SOD、MDA和考马斯亮兰蛋白测定试剂盒，均由南京建成生物工程研究所提供。
实验动物：健康清洁级的雄性昆明小鼠(体重18-22g，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供)。
实验仪器：高速冷冻离心机，由德国Eppendorf公司生产；电子天平，由Mettler-Toledo公司生产；多功能酶标仪，由美国伯腾仪器有限公司生产。
实验方法：将小鼠在20±2℃的温度下和在50±5％的湿度下在12小时光照和12小时黑暗的条件下饲养3天，其间小鼠可自由进食摄水。选取10只健康小鼠作为正常对照组(Control)。以0.2ml/10g体重向剩余小鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)溶液。72小时后测定小鼠的空腹血糖(fast blood glucose，FBG)。选取FBG值高于11.1mmol/L并且小于25mmol/L的小鼠为作为糖尿病模型小鼠。将糖尿病模型小鼠随机分成模型组(STZ 120mg/kg)、低剂量防风多糖组(SDP 50mg/kg)、高剂量防风多糖(SDP 200mg/kg)组以及阳性药物(格列本脲，GLI 25mg/kg)对照组，每组10只小鼠。对于各给药组，在每天上午8:00，按0.2ml/10g体重灌胃给药。正常对照组和模型组小鼠给予等体积蒸馏水。在实验期间，各组小鼠自由饮水，每10天测定FBG和称体重一次。给药30天后处理小鼠，测定下列指标。
(1)糖耐受量：于实验结束前一天8:00禁食，从小鼠眼眶取血并测定FBG作为给予葡萄糖前(0h)的血糖值，然后以0.2ml/10g体重向所有小鼠腹腔注射10％葡萄糖溶液。在腹腔注射葡萄糖0.5小时(0.5h)和2小时(2h)后从小鼠眼眶取血并测定血糖值，按下列公式计算血糖曲线下面积(AUC)。
Figure BDA0001570195260000241
(2)于实验结束前一天22:00禁食不禁水，实验于当日8：00开始处理。从小鼠眼眶取血，并通过离心从血中获得血清。测定血清中的胰岛素、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，以及SOD活性和MDA含量。取部分小鼠肝脏组织，匀浆，测定肝SOD活性和MDA含量。取部分小鼠的胰腺组织，用10％甲醛固定并进行形态学检查。
实验结果：
(1)防风多糖对STZ诱导的糖尿病模型小鼠空腹血糖和糖耐受量的影响
如表13所示：与正常对照组比较，模型组小鼠的血糖水平显著升高(P<0.01)。与模型组相比，防风多糖能够显著降低糖尿病小鼠血糖水平(P<0.05)。
表13防风多糖降低链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病小鼠空腹血糖(FBG)的作用(
Figure BDA0001570195260000242
n＝10)
Figure BDA0001570195260000243
注：与正常对照组比较，##P<0.01(LSD法检验)；与模型组组比较，*P<0.05(LSD法检验)。GLI：格列苯脲；SDP：防风多糖；STZ：链脲佐菌素。
如表14所示：与正常对照组比较，模型组小鼠的糖耐受量明显下降，血糖曲线下面积显著增加(P<0.01)。与模型组相比，防风多糖能够显著改善糖耐受量(P<0.05或P<0.01)，显著减少血糖曲线下面积(P<0.01)。
表14.防风多糖改善链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病小鼠糖耐受量的作用(
Figure BDA0001570195260000251
n＝10)
Figure BDA0001570195260000252
注：与正常对照组比较，##P<0.01(LSD法检验)；与STZ(120mg/kg)组比较，*P<0.05(LSD法检验)。GLI：格列苯脲；SDP：防风多糖；STZ：链脲佐菌素。
(2)防风多糖对链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠胰岛组织和血清胰岛素水平的影响
如图1所示：与正常对照组比较，STZ诱导的糖尿病小鼠胰岛组织中细胞发生核固缩、玻璃样病变、炎性细胞浸润，胰岛形态不完整(图1B)。给予防风多糖后，与STZ组比较，低倍镜下，防风多糖组胰岛数量没有明显减少；高倍镜下，防风多糖组小鼠胰岛的损伤明显减轻，形态比较完整(图1D，1E)。
同时测定小鼠血清胰岛素水平。实验结果如图2所示。与正常对照组比较，STZ组(模型组)小鼠的血清胰岛素水平显著降低(P<0.01)。而给予防风多糖后，与STZ组相比，防风多糖(200mg/kg)高剂量组的血清胰岛素水平显著升高(P<0.01)。
(3)防风多糖对STZ诱导的糖尿病小鼠血清脂质的影响
脂毒性是2型糖尿病发病机制的一个重要因素。如图3所示：与正常对照比较，STZ组(模型组)小鼠血清TC和TG水平均显著升高(P<0.01)。而给予防风多糖后，与模型组相比，高剂量防风多糖能够显著降低糖尿病小鼠血清TC和TG水平，并呈剂量依赖性(*P<0.05或*P<0.01)。另外，血清HDL-C水平在各组之间未见有明显影响。
(4)防风多糖对链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠血清和肝MDA含量和SOD活性的影响
在STZ诱导的糖尿病大鼠模型中，会产生大量的氧自由基。脂质在氧自由基的作用下发生过氧化作用，从而产生大量的醛类、醇类等物质，其中丙二醛(MDA)是一种代表性性质。丙二醇含量反映过氧化作用的程度。而SOD的活性则反映机体清除氧自由基的能力。实验结果图4显示：与正常对照比较，模型组小鼠血清和肝中MDA的含量均显著升高(P<0.01)，同时肝中SOD的活性显著降低(P<0.01)。而给予防风多糖后，与模型组相比，高剂量防风多糖能够明显降低糖尿病小鼠血清和肝中MDA含量(P<0.05)。与模型组相比，高剂量防风多糖都能够升高小鼠血清和肝中SOD活性(P<0.05)。
实验结论：防风多糖可明显降低STZ诱导的糖尿病小鼠空腹血糖水平并显著增加糖尿病小鼠糖耐受量。而且，防风多糖还可以减轻小鼠胰岛的损伤，增加胰岛素的释放，并且明显降低高血糖小鼠血清中TC和TG水平。防风多糖还能增加血清和肝中SOD活性而降低MDA的含量。
实施例12防风多糖降血脂作用实验
实验药物：实施例9制备的分离的防风多糖，分别以50mg/kg(低剂量)和200mg/kg(高剂量)的剂量施用。
实验试剂：TC、TG、LDL-C、HDL-C、SOD、GSH-px、MDA和考马斯亮兰蛋白测定试剂盒，均由南京建成生物工程研究所提供。
实验动物：健康清洁级的雄性昆明小鼠(体重18-22g，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供)。
实验仪器：高速冷冻离心机，由德国Eppendorf公司生产；电子天平，由Mettler-Toledo公司生产；多功能酶标仪，由美国伯腾仪器有限公司生产
参照文献方法(孙立彦，刘振亮，孙金霞，等.白茅根多糖对小鼠耐缺氧作用的影响，中国医院药学杂志，2008,28(2):96-99；冷斌，白茅根多糖对IgA肾病大鼠免疫调节及肾纤维化的干预，桂林医学院学位论文，2013；吕世静，龙启才，何德袁等，白茅根多糖对乙肝患者淋巴细胞增殖及T细胞亚群的调节作用，[会议论文]2001-第二届全国中医药免疫学术研讨)，建立高脂血症模型。实验方法：将小鼠在20±2℃的温度下和在50±5％的湿度下在12小时光照和12小时黑暗的条件下饲养3天，其间小鼠可自由进食摄水。将小鼠随机分为5组：正常对照组(正常组)、高脂模型组、阳性药力平之(非诺贝特，40mg/kg)组、低剂量防风多糖组(SDP 50mg/kg)和高剂量防风多糖组(SDP 200mg/kg)，每组10只。对于各给药组，在每天8:00-9:00按0.2ml/10g体重给予不同剂量的药物。向正常对照组与高脂饮食组给予等体积的蒸馏水。除正常对照组外，各组小鼠于每天14:00-15:00按0.2ml/10g体重灌胃给予高脂饮食(含有20％猪油、10％胆固醇、0.2％丙基硫氧嘧啶、20％丙二醇和20％吐温-80)，连续3周，以考察防风多糖预防高血脂症的作用。实验结束时，小鼠禁食不禁水8小时后处理。从小鼠眼眶取血，并通过离心从血中获得血清。测定血清TC、TG、LDL-C和HDL-C。取小鼠部分肝脏组织，匀浆，测定肝TC和TG含量，以及SOD、GSH-px活性和MDA含量。另取小鼠部分肝脏组织，用10％甲醛固定并进行形态学检查。
实验结果：
(1)防风多糖对高脂血症小鼠血脂水平的影响
如图5所示：与正常对照组比较，高脂模型组中小鼠的血清TC和LDL-C水平均显著升高(P<0.01)。与高脂模型组相比，高剂量防风多糖能够降低血清TC、TG和LDL-C水平(P<0.05)。防风多糖对血清HDL-C水平未见有明显影响。
(2)防风多糖对高脂血症小鼠肝TC、TG以及肝重系数的影响
如图6所示：与正常对照组比较，高脂模型组中小鼠肝TC和TG含量(P<0.01)、以及肝重系数(P<0.01)均显著升高。与高脂模型组相比，高剂量防风多糖能够降低肝TC、TG含量和肝重系数(P<0.05或P<0.01)，低剂量防风多糖能够降低肝TC(P<0.05)。阳性药非诺贝特虽然也能显著降低肝TC含量(P<0.01)，但对肝重系数却明显升高。因此，高剂量防风多糖在降低肝重系数方面的作用明显优于阳性药力平之。
(3)防风多糖对高脂血症小鼠肝形态学的影响
如图7所示，正常对照组小鼠肝结构完整，肝索清晰可见，未见有明显的脂质空泡(图7A)。当给予小鼠高脂饮食3周后，高脂饮食组小鼠肝中可见有大量的脂质空泡(图7B)。防风多糖能明显改善肝脏的脂质空泡(图7D、7E)。
(4)防风多糖对高脂血症小鼠肝SOD、GSH-px活性和MDA含量的影响
SOD和GSH-px是肝中的抗氧化酶，可以减少活性氧的量，减轻脂质过氧化作用对肝细胞的损伤。实验结果图8显示：与正常对照比较，高脂模型组小鼠肝中SOD和GSH-px活性均显著降低(P<0.01)，同时MDA含量明显升高(P<0.05)。而给予防风多糖后，与高脂模型组相比，高剂量防风多糖明显升高小鼠肝SOD和GSH-px活性(P<0.05)，显著降低MDA含量(P<0.05)。
实验结论：防风多糖可明显降低高脂饮食诱导的高脂血症小鼠血清TC、TG和LDL-C水平，同时亦可降低肝重系数以及肝TC和TG含量，明显减少肝中的脂质空泡。而且，防风多糖可以增加肝中SOD和GSH-px活性，而降低MDA的含量。

Claims (33)

1.一种分离的防风多糖，包含L-阿拉伯糖、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖，其特征在于，所述L-阿拉伯糖、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖的摩尔比为12：2：3：8：6，其特征在于：
所述L-阿拉伯糖包括1,4-连接的L-阿拉伯糖和1,3,4-连接的L-阿拉伯糖；
所述D-半乳糖醛酸包括端基D-半乳糖醛酸和1,3-连接的D半乳糖醛酸；
所述D-甘露糖包括1,6-连接的D-甘露糖；
所述D-葡萄糖包括1,4-连接的D-葡萄糖和1,3,6-连接的D-葡萄糖；
所述D-半乳糖包括1,4-连接的D-半乳糖；
其特征还在于，所述1,4-连接的L-阿拉伯糖：1,3,4-连接的L-阿拉伯糖：端基D-半乳糖醛酸：1,3-连接的D半乳糖醛酸：1,6-连接的D-甘露糖：1,4-连接的D-葡萄糖：1,3,6-连接的D-葡萄糖：1,4-连接的D-半乳糖的摩尔比为5：7：1：1：3：4：1：6，以及所述分离的防风多糖的重均分子量为3.5×105Da。
2.一种制备如权利要求1所述的分离的防风多糖的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）用碱性溶液一次或多次提取防风，得到防风碱性提取液；
（2）向所述防风碱性提取液加入酸以调节pH至7.0，以得到中性提取液，任选浓缩所述中性提取液；
（3）向所述中性提取液加入有机溶剂以得到有机溶剂浓度为15-30%的混合物，离心处理所述混合物以得到上清液；
（4）向所述上清液中加入有机溶剂以得到有机溶剂浓度为70-90%的混合物，离心处理所述混合物以得到沉淀；
（5）干燥所述沉淀，以得到所述的分离的防风多糖。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）所述碱性溶液选自氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液、碳酸钠水溶液、碳酸氢钠水溶液、碳酸钾水溶液或碳酸氢钾水溶液中的一种或多种。
4.如权利要求2-3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）所述碱性溶液的浓度为0.01-5 mol/L。
5.如权利要求2-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中碱性溶液与防风的以升/千克计算的体积重量比为8：1至30：1。
6.如权利要求2-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中提取温度为40-100℃。
7.如权利要求2-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中提取时间为1-4小时。
8.如权利要求2-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中用碱性溶液提取防风1-4次。
9.如权利要求2-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）和（5）之间还存在步骤（4’）：用水溶解步骤（4）所得沉淀以得到水溶液，向所述水溶液加入有机溶剂以得到有机溶剂浓度为70-90%的混合物，离心处理所述混合物以得到沉淀；步骤（4’）重复一次或多次。
10.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（3）的所述混合物为有机溶剂浓度17-28%的混合物。
11.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（3）的所述混合物为有机溶剂浓度20-25%的混合物。
12.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（4）的所述混合物为有机溶剂浓度75-85%的混合物。
13.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（4）的所述混合物为有机溶剂浓度80-85%的混合物。
14.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）所述碱性溶液为氢氧化钠水溶液。
15.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）所述碱性溶液的浓度为0.1-1mol/L。
16.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中碱性溶液与防风的以升/千克计算的体积重量比为20：1至30：1。
17.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中提取温度为60-100℃。
18.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中提取温度为90-95℃。
19.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中提取时间为1-2小时。
20.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中用碱性溶液提取防风2-3次。
21.如权利要求9所述的方法，其特征在于，在所述步骤（4’）中用水溶解步骤（4）所得沉淀以得到水溶液，向所述水溶液加入有机溶剂以得到有机溶剂浓度为75-85%的混合物。
22.如权利要求9所述的方法，其特征在于，在所述步骤（4’）中用水溶解步骤（4）所得沉淀以得到水溶液，向所述水溶液加入有机溶剂以得到有机溶剂浓度为80-85%的混合物。
23.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤（4’）重复1、2或3次。
24.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）和/或（4）中所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、或其混合物。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙醇。
26.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤（4’）所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、或其混合物。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙醇。
28.如权利要求2-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中所述防风是防风饮片。
29.如权利要求2-3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）所述的酸选自盐酸、磷酸、硝酸、甲酸、乙酸中的一种或多种。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述的酸为盐酸。
31.如权利要求1所述的分离的防风多糖在制备治疗糖尿病或高脂血症药物中的用途。
32.一种药物组合物，包含如权利要求1所述的分离的防风多糖，以及药学上可接受的载体。
33.如权利要求32所述的药物组合物在制备用于治疗糖尿病或高脂血症的药物中的用途。
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