CN113861302B - 一种山茱萸多糖组分及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种山茱萸多糖组分及其制备方法和应用，该山茱萸多糖组分的重均分子量为40‑60kDa，包括以下单糖成分：木糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸和鼠李糖；木糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸和鼠李糖摩尔比为12.25‑33.95:12.19‑27.81:9.35‑26.72:9.51‑24.10:1.00。本发明还包括上述山茱萸多糖的制备方法和应用。本发明的山茱萸多糖组分呈现更高的降血糖活性，具有明显的降血糖、治疗或预防糖尿病及其并发症的作用，将该山茱萸多糖组分用于糖尿病及糖尿病相关疾病的治疗，效果更加显著。

Description

一种山茱萸多糖组分及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及中药现代化技术领域，具体涉及一种山茱萸多糖组分及其制备方法和应用。
背景技术
糖尿病是一种慢性全身性的内分泌代谢疾病，持续的高血糖不仅会导致一些组织器官代谢异常，而且可引起其功能障碍及形态改变。这些改变引起的症状有微血管并发症，如微循环障碍、微血管瘤形成和微血管基底膜增厚等，而对于糖尿病患者来说最为可怕的正是并发症。糖尿病常见的并发症为糖尿病肾病和糖尿病视网膜病变，严重时可导致尿毒症和失明。我国是全球糖尿病患者最多的国家，随着患者数量的不断增加，糖尿病受到了越来越多的关注。但是针对糖尿病这一疾病目前并未有彻底治愈的药物。目前糖尿病有效的治疗药物主要为西药类，其中包括二甲双胍、格列美脲、格列本脲、格列齐特等。但西药类药物不良反应较多，如低血糖，胃肠道不良反应，肝毒性等。此外，西药类药物的降糖效果随治疗时间增加而下降。相比之下，中药具有副作用小，疗效持久，减缓并发症，增强体质等优点，可以提供研发降糖药的新思路。
中药山茱萸是山茱萸科植物山茱萸(Cornus Officinalis Sieb.et Zucc.)干燥成熟的果肉，俗名山萸肉﹑枣皮﹑药枣等；是临床常用中药，具有补益肝肾、收涩固脱之功效，主治眩晕耳鸣、腰膝酸痛、阳萎遗精、遗尿尿频、崩漏带下、大汗虚脱、内热消渴等[国家药典委员会.中华人民共和国药典(2015版)，一部]。现代研究表明，山茱萸果肉中主要含环烯醚萜类、苷类、鞣质、多糖、有机酸、酯类等成分，具有增强机体免疫力、抗氧化损伤、镇痛、抗糖尿病等作用[于淼,王晓先.山茱萸的药理作用研究进展.东南国防医药,2010,12(3):240-243.]。如赵晨翔等报道了山茱萸总苷对小鼠免疫性肝损伤的治疗作用[赵晨翔,张雅敏,刘宏胜,等.山茱萸总苷对小鼠免疫性肝损伤治疗作用的初步研究.天津中医药,2017,34(2):120-124.]；刘薇等报道了山茱萸总萜对KKay糖尿病小鼠的治疗作用[刘薇,朱晶晶,徐志猛,等.山茱萸总萜对KKay糖尿病小鼠的治疗作用研究.药物评价研究,2016,39(6):947-952]。
自日本学者山原条二等在20世纪80年代发现山茱萸的乙醚和乙酸乙酯提取物对实验性糖尿病大鼠有明显的降糖作用，并进一步发现这种有效成分是熊果酸后[药学杂志,1981,101(1):86]，关于山茱萸的研究开始增多。
近年来，针对山茱萸果肉活性成分的新药研究主要集中在糖尿病的治疗领域：例如，从山茱萸果肉中发现的以齐墩果酸和熊果酸为母体的蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B抑制剂[2002胡立宏]，山茱萸果肉提取的总苷和多酚类成分具有显著的α-糖苷酶抑制作用[中国专利03135217.0]，均可用于各型糖尿病的治疗；具有治疗糖尿病肾病和糖尿病视网膜病变作用的环烯醚萜苷也在山茱萸果肉中存在[中国专利200410014770.8；Xu HQ,HaoHP.Biol.Pharm.Bull,2004,27(7):1014-1018]；研究同时制备山茱萸环烯醚萜总苷和总三萜酸的这一制备工艺后发现其具有防治糖尿病和血管病变的作用[中国专利200410014769.5]。中国专利96109637.7公开了具有免疫抑制作用的山茱萸水煎液提取物及其制备工艺，中国专利02159502.X公开了具有防治缺血性血管病作用的山茱萸水煎提取物及其制备方法。
山茱萸水溶性成分复杂，简单的水煎提取物所含成分较多，难以判断真正的有效成分。多糖作为一类水溶性大分子成分，由于组成的单糖残基种类多、分子量差异大，多糖种类也十分复杂，不同的多糖组分药理活性差异很大，不同的制备工艺治疗效果也有所不同，所以对于山茱萸不同结构的多糖组分的分离变得十分重要，对于药物开发具有重要意义。目前关于山茱萸多糖的研究虽多，但是对于分离山茱萸多糖组分和结构的研究少之又少，因此本发明从分离山茱萸的多个多糖组分入手，在筛选降血糖活性的基础上，发现了一种活性最高的降血糖山茱萸多糖组分，并研究获得了该多糖组分的制备工艺。本发明的山茱萸多糖组分相对于以往研究报道的山茱萸总多糖和其它组分在体内外活性实验中呈现了更高的降血糖活性，并且在预防和治疗糖尿病及其代谢相关疾病和并发症的效果更加显著。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种山茱萸多糖组分及其制备方法和应用，该山茱萸多糖组分呈现更高的降血糖活性，具有明显的降血糖、治疗或预防糖尿病及其并发症的作用，将该山茱萸多糖组分用于糖尿病及糖尿病相关疾病的治疗，效果更加显著。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种重均分子量为40-60kDa的山茱萸多糖组分，包括以下单糖组分：木糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸和鼠李糖；木糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸和鼠李糖摩尔比为12.25-33.95:12.19-27.81:9.35-26.72:9.51-24.10:1.00。
进一步，半乳糖醛酸的糖残基为1,6-吡喃型半乳糖醛酸、和/或1,3-吡喃型半乳糖醛酸。
进一步，木糖的糖残基为1,2,4-吡喃型木糖和/或1,2-吡喃型木糖。
进一步，半乳糖的糖残基为1,6-吡喃型半乳糖、1,4-吡喃型半乳糖、1,3-吡喃型半乳糖、1,3,6-吡喃型半乳糖、和1,2,3,6-吡喃型半乳糖中的至少一种。
进一步，葡萄糖的糖残基为1,6-吡喃型葡萄糖和/或端基葡萄糖；鼠李糖的糖残基为1,2-吡喃型鼠李糖。
上述的山茱萸多糖组分具有明确的分子量分布范围、单糖组成和糖残基类型组成，其具备显著的治疗和预防糖尿病及其代谢相关疾病的用途。
上述的山茱萸多糖组分的制备方法，包括以下步骤：
(1)脱脂：将山茱萸果实粉碎，然后加入3-8倍体积的有机溶剂，在50-80℃温度下加热回流2-3h，提取1-3次，弃去提取液，干燥，得山茱萸药渣；
(2)水提取：向步骤(1)所得山茱萸药渣中加入2-10倍体积的蒸馏水，在80-100℃温度下回流2-3h，过滤，提取2-3次，合并滤液后减压浓缩至原体积的1/4-1/30，冷却至室温，得提取浓缩液；
(3)沉淀析出：向步骤(2)所得提取浓缩液中加入2-5倍体积的无水乙醇，在0-30℃温度下静置6-48h，析出沉淀后离心10-30min，沉淀备用；
(4)除蛋白：向步骤(3)所得沉淀加入2-10倍体积的水溶解，用反复冻融法、Sevag法和酶法中的一种或两种方法联用除去沉淀中的蛋白，离心去除沉淀，保留水相并减压浓缩为原体积的1/4-1/10，得浓缩液一；
(5)除色素：向步骤(4)所得浓缩液一中加入3-10倍体积的浓度为30vt％的过氧化氢溶液，在60-80℃温度下回流1-2h，减压浓缩至原体积的1/2-1/10，得浓缩液二；
(6)分级：取步骤(5)所得浓缩液二离心后的上清液，上DEAE-sephadex A-25柱或DEAE-纤维素柱，用水溶液洗脱至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，然后用0.5mol/L的氯化钠溶液洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，再收集0.5mol/L氯化钠水溶液洗脱液，减压浓缩至原体积的1/25-1/100，得洗脱浓缩液；
(7)纯化：将步骤(6)所得洗脱浓缩液上葡聚糖凝胶柱或交联琼脂糖凝胶柱，用水洗脱，收集分子量为40-60kDa的组分洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，得山茱萸多糖组分。
进一步，步骤(1)中，有机溶剂为甲醇、乙酸乙酯、50-100vt％的乙醇、乙醚或石油醚。
进一步，步骤(4)中，反复冻融法3-10次，然后采用Sevag法除蛋白2-5次。
进一步，步骤(5)中，除色素还可将上述浓缩液用双氧水法、大孔吸附树脂法或活性炭法一种或多种方法合用除色素；大孔树脂为用D101，HPD-500，LSA-700B或LSA-10大孔树脂，将预处理后的大孔树脂加入多糖溶液，按多糖溶液计算料液比2-8g:1mL，于25℃-30℃吸附12-24h后，过滤，取水溶液，减圧浓缩即可。
山茱萸果实粉碎醇沉脱脂的沉淀物，用水提取、醇液沉淀的方法提取粗多糖；粗多糖经反复冻融法-sevag法联用脱蛋白、过氧化氢法除色素，使用DEAE-sephadex A-25柱洗脱，弃去水洗脱部分，收集0.5mol/L NaCl溶液洗脱部分；Sephadex G-100凝胶柱分离，收集分子量40-60kDa部分，干燥即得。本发明得到的山茱萸多糖组分具有明显的降血糖、治疗或预防糖尿病肾病、糖尿病眼部并发症和糖尿病神经病变的作用。
上述的山茱萸多糖组分在制备治疗或预防糖尿病或糖尿病相关疾病的药物及保健品中的应用。
进一步，糖尿病为I型糖尿病、II型糖尿病或妊娠糖尿病，糖尿病相关疾病为糖尿病肾病、糖尿病肝损伤、糖尿病眼部并发症、糖尿病神经病变、糖尿病足或糖尿病并发症。
进一步，糖尿病并发症为极度乏力、浮肿、糖尿病白内障、便秘、低血糖症、乳酸性酸中毒、酮症酸中毒、胃轻瘫或皮肤病变。
一种药物或保健品，包括上述的山茱萸多糖组分。
上述的山茱萸多糖组分制备药物是指以山茱萸多糖组分为有效成分与药学上可接受添加的辅助性成分混合后，按相应的常规药物制剂方法，可以制备的药物。例如，与在口服制剂中可以被接受的如崩解剂、赋形剂、润滑剂、粘合剂、填充剂等常用的辅助添加成份混合后，按常规的操作方法和过程，可以制成为片剂、丸剂、胶囊剂或多种相应的缓释剂、控释剂等固体口服制剂形式的药物；与常规的增溶剂、乳化剂、润湿剂、起泡或消泡剂等表面活性剂、稀释剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂、增稠剂等混合后，按相应的常规方法，可以制成为如水剂、糖浆等液体制剂形式的口服药物。以及其他剂型，例如舌下含片或其他口含给药剂型、静脉、皮下、透皮或肌内给药剂型。
本发明将山茱萸多糖组分具有明确的分子量分布范围、单糖组成和糖残基类型组成，将其用于糖尿病及相关疾病，具备显著的治疗和预防作用。
具体实施方式
实施例1
一种山茱萸多糖组分，其制备方法包括以下步骤：
称取10kg干燥山茱萸药材，用50L无水乙醇于80℃下回流提取3小时脱脂，过滤，弃去乙醇提取液，把山茱萸药渣按上述方法再处理1次，过滤，弃去乙醇提取液，收集药渣，将乙醇挥干，在40℃下将药渣干燥后，用60L水溶液回流提取3次，每次3h，过滤，合并滤液，于60℃减压浓缩至6000mL，冷却至室温后，向浓缩液加入18L无水乙醇，于4℃静置24小时后，使多糖成分沉淀析出，3000r/min离心20min，收集沉淀。沉淀用5L水溶解，反复冻融10次，再采用Sevag法除蛋白，Sevag试剂与多糖水溶液体积比为1:6，重复Sevag法2次，离心，弃去沉淀，保留水相，减压浓缩至500mL得浓缩液一。将浓缩液一，用3倍体积的30vt％过氧化氢水溶液进行脱色，脱色温度80℃，回流2h，水溶液60℃减压浓缩至500mL，得到浓缩液二，即总多糖浓缩液。将总多糖浓缩液离心，弃去沉淀，取上清液上DEAE-sephadex A-25(150cm×5cm，i.d.)柱分离纯化，用30000mL水洗脱，至洗脱液苯酚-硫酸法显色无黄色出现，弃去水洗脱的多糖组分；再用30000mL 0.5mol/L NaCl洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，收集0.5mol/L NaCl洗脱液，于60℃减压浓缩至400mL。浓缩液离心后平均分为2份，分别用Sephadex G-100(150cm×5cm，i.d.)凝胶柱分离纯化，用3000mL水洗脱，弃去前750mL其他多糖组分和后750mL其他多糖组分，收集中间1500mL分子量为40-60kDa组分的洗脱液，减压浓缩至400mL，合并2次浓缩液，冷冻干燥，一共得到山茱萸多糖组分58.2g。
实施例2
一种山茱萸多糖组分，其制备方法包括以下步骤：
称取1kg干燥山茱萸药材，粉碎为粗粉；用5L 95％乙醇回流提取2h，过滤，弃去提取液，收集药渣，将乙醇挥干，在40℃干燥，得到干燥药渣备用。干燥药渣用8L水回流提取3次，每次3h。过滤，合并滤液，65℃浓缩至500mL，冷却至室温后，加入95％乙醇，使混合溶剂的极性减小，8℃静置24小时后，多糖成分沉淀析出，3000r/min离心20min，收集沉淀备用；沉淀用500mL水溶解，反复冻融10次后，离心，弃去沉淀，将水溶液浓缩至100mL，然后用300mL30vt％过氧化氢水溶液进行脱色，脱色温度80℃，回流2h，将溶液减压浓缩至80mL，得到总多糖浓缩液。将总多糖浓缩液离心20分钟后，上DEAE-sephadex A-25(80cm×3.5cm，i.d.)柱，用水洗脱4000mL至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，弃去水洗脱的多糖组分；再换用相同体积0.5mol/L NaCl洗脱，收集0.5mol/L NaCl洗脱液，在60℃减压浓缩至100mL。将浓缩液离心20min后，取上清液上Sephadex G-100(100cm×4cm，i.d.)凝胶柱，用2400mL水洗脱，弃去前600mL其它多糖组分洗脱液和后600mL其它多糖组分洗脱液，收集中间1200mL分子量为40-60kDa组分，减压浓缩至100mL，冷冻干燥，得到山茱萸多糖组分5.62g。
实施例3
一种山茱萸多糖组分，其制备方法包括以下步骤：
称取干燥粉碎的山茱萸药材500g，加入1500mL石油醚，置于索氏提取器中，于60℃回流提取3小时，过滤，弃去滤液，收集药渣，将药渣上残余的石油醚挥发干，40℃干燥后，再用5000mL水80℃回流提取3次，每次2h，过滤，合并滤液，65℃减压浓缩至200mL，冷却至室温后加入600mL丙酮，于25℃静置12h，使多糖成分沉淀析出，离心10min，收集沉淀。将沉淀用200mL水溶解，反复冻融2次，离心，弃去沉淀。采用Sevag法除蛋白，Sevag试剂与水溶液体积比为1:5，反复5次，离心弃去沉淀，保留水相，减压浓缩至80mL，用300mL 30vt％过氧化氢水溶液进行脱色，脱色温度80℃，回流2h，水溶液于65℃减压浓缩至50mL，得到总多糖浓缩液。将总多糖浓缩液离心10min后，弃去沉淀，取上清液上DEAE-sephadex A-25(60cm×3.5cm，i.d.)柱，用2500mL水洗脱至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，弃去水洗脱的多糖组分；再用0.5mol/L NaCl洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，收集0.5mol/L NaCl洗脱液，于60℃减压浓缩至80mL。将浓缩液离心15min后，弃去沉淀，取清液上Sephadex G-100(80cm×3.5cm，i.d.)凝胶柱，用1500mL水洗脱，弃去前300mL其它多糖组分的洗脱液和后300mL其它多糖组分洗脱液，收集中间600mL分子量为40-60kDa组分的洗脱液，减压浓缩至50mL喷雾干燥，得到山茱萸多糖2.38g。
实施例4
一种山茱萸多糖组分，其制备方法包括以下步骤：
称取1kg山茱萸，粉碎为粗粉，用3L乙醇润湿，3L乙醇进行渗漉3h，将药渣残余的乙醇挥干，40℃干燥后，用6L水回流提取2次，每次3h,过滤，合并滤液，60℃减压浓缩至500mL，冷却至室温后加入1500mL丙酮，使混合溶剂的极性减小，于4℃静置8h后，使多糖成分沉淀析出，离心10分钟，收集所有沉淀。将沉淀用300mL水溶解，用反复冻融法除蛋白，重复反复冻融8次，离心，弃去沉淀，收集上清液，减压浓缩至60mL。将浓缩液用D101大孔吸附树脂除色素，向浓缩液中加入300g大孔树脂，于30℃恒温水浴中吸附12小时后，过滤，收集多糖水溶液，即总多糖溶液。将多糖水溶液离心10min后，弃去沉淀，取上清液上DEAE-sephadex A-25(100cm×3.5cm，i.d.)柱，用水洗脱3000mL至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，弃去水洗脱的多糖组分；再3000mL 0.5mol/L NaCl洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，收集3000mL0.5mol/L NaCl洗脱液，60℃减压浓缩至100mL，得浓缩液。将浓缩液离心10分钟后，弃去沉淀，取上清液上Sephadex G-100(100cm×5cm，i.d.)凝胶柱，用2000mL水洗脱，弃去前600mL其它多糖组分洗脱液和后600mL其它多糖组分洗脱液，收集中间600mL分子量为40-80kDa组分的洗脱液，减压浓缩至80mL；将浓缩液冷冻干燥，得到山茱萸多糖组分3.64g。
实施例5
一种山茱萸多糖组分，其制备方法包括以下步骤：
称取1kg干燥山茱萸药材，粉碎为中粉，用5000mL石油醚于60℃回流提取2h，共提取2次，过滤，收集药渣，将药渣上残余石油醚挥发干，30℃干燥后，再用8000mL水回流提取，共3次，每次2h，合并滤液，于65℃减压浓缩至600mL，冷却至室温后加入1800mL无水乙醇，于4℃静置16h后，使多糖成分沉淀析出，离心15min，收集沉淀。沉淀用300mL水溶解，反复冻融8次后，离心，弃去沉淀；再采用Sevag法除蛋白，Sevag试剂与水溶液体积比为1:6，重复2次，离心弃去沉淀，保留水相。将水溶液减压浓缩至100mL，用活性炭法进行脱色，向多糖浓缩水溶液中加入200g活性炭，置于恒温50℃下震荡脱色30min后，过滤，收集溶液，于65℃旋转蒸发仪减压浓缩至80mL。将浓缩液离心10分钟后，弃去沉淀，取上清液上DEAE-sephadex A-25(80cm×3.5cm，i.d.)柱，用水洗脱4000mL至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，弃去水洗脱的多糖组分；换用4000mL 0.5mol/L NaCl洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，收集4000mL0.5mol/L NaCl洗脱液，60℃减压浓缩至100mL，得到浓缩液。将浓缩液离心15分钟后，弃去沉淀，取上清液上Sephadex G-100(100cm×5cm，i.d.)凝胶柱，用2000mL水洗脱，弃去前500mL其它多糖组分洗脱液和后500mL其它多糖组分洗脱液，收集中间分子量为40-60kDa组分的洗脱液，共1000mL，减压浓缩至200mL后，冷冻干燥，得到山茱萸多糖组分5.39g。
实施例6
一种山茱萸多糖组分，其制备方法包括以下步骤：
称取5kg干燥山茱萸药材，粉碎为粗粉，用15L乙酸乙酯回流提取2小时，共提取2次，过滤，将药渣残余的乙醇挥干，50℃干燥后，再用30L蒸馏水回流提取3次，每次3h，过滤，合并滤液，60℃旋转蒸发仪减压浓缩至3000mL，冷却至室温后加入15000mL无水乙醇于4℃静置12小时，使多糖成分沉淀析出，离心15分钟，收集沉淀。沉淀用800mL水溶解，反复冻融8次，离心，弃去沉淀；再采用Sevag法除蛋白，Sevag试剂与水溶液体积比为1:5，离心弃去沉淀，保留水相，重复Sevag法2次，将水溶液减压浓缩至250mL，然后用1000mL 30vt％过氧化氢水溶液进行脱色，脱色温度80℃，回流2h，将溶液于60℃减压浓缩至200mL，得到总多糖浓缩液。将总多糖浓缩液离心10分钟后，弃去沉淀，将上清液上DEAE-sephadex A-25柱，用10000mL水洗脱至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，弃去水洗脱的多糖组分；再用相同体积0.5mol/L NaCl洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现；收集0.5mol/L NaCl洗脱液，60℃减压浓缩至200mL。将浓缩液离心10分钟后，弃去沉淀，上清液上Sephadex G-100(150cm×10cm，i.d.)凝胶柱，用6400mL水洗脱，弃去前1600mL其他多糖组分的洗脱液和后1600mL其他多糖组分洗脱液，收集中间3200mL分子量为40-60kDa组分的洗脱液减压浓缩至800mL，减压干燥，得到山茱萸多糖组分26.1g。
实验例1山茱萸多糖组分的纯度及重均分子量的测定
采用DIONEX UltiMate色谱系统。色谱柱：AccliamTM 120C18(4.6mm i.d.×250mm，5μm，Thermo Fisher)；流动相：以pH为5.0的100mmol乙酸铵水溶液：四氢呋喃：乙腈＝81:2:17；进样量：10μL；流速：1mL/min；柱温：25℃；检测波长为：250nm。
标准葡聚糖Dextran T-410、T-150、T-50、T-12和T-5分别用蒸馏水配制成10mg/mL的溶液，高速离心，上清液用0.45μm滤膜过滤，进样量为10μL，分别求得洗脱体积Ve；蓝色葡聚糖2000000及葡萄糖同法上样，分别求得柱的空体积V0和总体积Vt。根据公式Kav＝(Ve-Vo)/(Vt-Vo)计算各标准葡聚糖的分配系数(Kav)值，以Kav为横坐标，lg M为纵坐标，得到分子量测定标准曲线。
分别称取10mg本发明实施例1-6得到的多糖组分同上法制备，进样，计算分别得到重均分子量平均为5.9×104Da，4.8×104Da，5.5×104Da，4.1×104Da，4.0×104Da和6.0×104Da。
实验例2山茱萸多糖组分的总中性糖、总糖醛酸含量的测定
总中性糖含量测定：以浓度为0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.0mg/mL的葡萄糖为标准制作标准曲线。分别称取本发明实施例1-6山茱萸多糖组分，配制成100mg/L的水溶液。吸取样品液2.0mL于试管中，分别加入1.0mL 6％苯酚溶液和6.0mL浓硫酸，混匀，放置于室温20min后，于波长490nm处测吸光度值，以标准曲线计算总中性糖含量分别为92.99％、89.32％、87.12％、75.77％、84.65％和73.19％。
总糖醛酸含量测定：采用硫酸-咔唑法测定糖醛酸含量，以浓度为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.125mg/mL的半乳糖醛酸为标准制作标准曲线。分别称取本发明实施例1-6得到的山茱萸多糖组分，配制500mg/L的水溶液。吸取1.0mL样品液于试管中，将试管置于冰浴，向各试管加入6mL浓硫酸，摇匀后，在沸水浴中加热10min后，取出试管，将其冷却至室温。向各试管中加入0.5mL 0.15％咔唑试剂，充分混合，在室温下放置30min，以0mg/L半乳糖醛酸标准溶液管为空白，在530nm波长下测定吸光度，以标准曲线计算总糖醛酸含量，实施例1-6的总糖醛酸含量分别为9.55％、11.86％、18.09％、26.32％、16.55％和27.98％。
注：以上百分比为重量百分比。
实验例3山茱萸多糖组分的单糖组成分析
多糖水解：分别称取本发明实施例1-6山茱萸多糖组分5.0mg于6个安瓿瓶中，加入2.5mL 2mol/L的三氟乙酸，充氮气5min，密封，于110℃水浴6h。将反应液冷却至室温，3000r/min离心15min，取上清液，再以1mol/L的NaOH溶液调节pH至7.0。
多糖组分水解样品衍生物的制备：向上述本发明实施例1-6山茱萸多糖组分水解的样品中分别加入200μL 0.3mol/L NaOH溶液和400μL 0.5mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液，混匀后置于70℃水浴30min，取出，冷却到室温后，用0.3mol/L的HCl溶液中和至pH＝7.0。向衍生后的溶液中分别加入2mL蒸馏水和4mL氯仿涡旋萃取，离心，静置分层，弃去下层有机层，上层水相再重复萃取2次，保留水相，分别得到本发明实施例1-6山茱萸多糖组分的PMP衍生化样品。
标准单糖衍生物的制备：分别称取各个标准单糖10.0mg(L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-葡萄糖醛酸、D-(+)-半乳糖醛酸、L-岩藻糖、D-(+)-氨基葡萄糖、D-(+)-氨基半乳糖)，分别用1mL蒸馏水溶解配置成10.0mg/mL溶液；取400μL各个单糖溶液分别置于不同试管中，等同多糖水解样品衍生物的制备法处理。
HPLC分析方法：采用DIONEX UltiMate色谱系统；色谱柱为AccliamTM 120C18(4.6mm i.d.×250mm，5μm，Thermo Fisher)柱；流动相为pH＝5.0的100mmol/L的乙酸铵水溶液，四氢呋喃，乙腈体积比为81∶2∶17组成混合溶液；进样量为10μL；流速为1mL/min；柱温为25℃；检测波长为250nm。
根据单糖的保留时间及峰面积得到的本发明实施例1-6山茱萸多糖组分的单糖组成及摩尔比。实施例1山茱萸多糖组分的单糖组成和摩尔比为木糖∶葡萄糖∶半乳糖∶半乳糖醛酸∶鼠李糖＝31.03∶21.13∶20.01∶9.51∶1.00；实施例2山茱萸多糖组分的单糖组成和摩尔比为木糖∶葡萄糖：半乳糖∶半乳糖醛酸∶鼠李糖＝33.95∶20.08∶19.64∶12.71∶1.00；实施例3山茱萸多糖组分的单糖组成和摩尔比为葡萄糖：半乳糖∶木糖∶半乳糖醛酸∶鼠李糖＝26.41∶25.33∶20.37∶19.17∶1.00；实施例4山茱萸多糖组分的单糖组成和摩尔比为半乳糖∶半乳糖醛酸∶木糖∶葡萄糖：鼠李糖＝21.61∶21.32∶12.25∶9.35∶1.00；实施例5山茱萸多糖组分的单糖组成和摩尔比为半乳糖∶木糖∶半乳糖醛酸∶葡萄糖：鼠李糖＝27.81∶15.05∶12.41∶11.41∶1.00；实施例6山茱萸多糖组分的单糖组成和摩尔比为葡萄糖：半乳糖醛酸∶木糖∶半乳糖∶鼠李糖＝26.72∶24.10∶15.43∶12.19∶1.00。
实验例4山茱萸多糖组分的糖残基组成分析
甲基化反应：分别称取20mg本发明实施例1-6山茱萸多糖组分于6个50mL圆底烧瓶中，分别加入6mL无水的二氯亚砜(DMSO)中，吹氮气5min后密封，置于40℃恒温磁力搅拌过夜直至糖样完全溶解。称取200mg干燥的NaOH粉末溶于20mL无水DMSO中，置于室温磁力搅拌NaOH过夜，至NaOH完全溶解得NaOH-DMSO混悬液。将此混悬液加入到上述搅拌过夜的多糖组分溶液中，吹氮气5min后密封，置于25℃恒温磁力搅拌，搅拌2h后，充氮气5min，避光，逐滴加入1mL碘甲烷，再吹氮气2min，密封后，置冰浴上反应5min，超声溶解，室温避光反应12h，再加入蒸馏水6mL终止反应，所得产物对蒸馏水透析48h。将透析液浓缩至10mL，用等体积的氯仿萃取甲基化多糖，保留氯仿层，重复5次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥，干燥24h后，过滤，减压蒸发至干。以上步骤重复2次，最终得到山茱萸多糖组分的甲基化样品。
水解反应：将甲基化多糖组分真空干燥后，加入1mL 90％的甲酸，吹氮气5min，密封，于100℃恒温水浴下水解4h，然后加入甲醇以除去多余的甲酸，重复5次。将产物真空干燥后，加入2mL 2mol/L的三氟乙酸(TFA)溶液，吹氮气5min，密封后，置于100℃恒温水浴下水解6h，加入无水乙醇，以蒸干多余的TFA，再加入蒸馏水，以蒸干乙醇，得到本发明实施例1-6山茱萸多糖组分的水解样品。
还原反应：将上述多糖水解样品用2mL氨水溶解，再加入60mg NaBH4于室温下还原24h，直至滴加冰醋酸无气泡产生，减压浓缩至干后，重复多次加入0.1％的盐酸甲醇，以蒸干多余的硼酸根，产物置于110℃烘箱干燥10min，即得到本发明实施例1-6山茱萸多糖组分的还原样品。
乙酰化反应：将上述山茱萸多糖组分的还原样品用4ml醋酸酐溶解，充氮气封管，100℃乙酰化反应3h，多次加无水乙醇除去多余的乙酸酐，减压蒸干，即得到本发明实施例1-6山茱萸多糖组分的乙酰化产物。
将上述山茱萸多糖组分的乙酰化产物溶于少量氯仿中，过0.45μm有机系滤膜过滤，进行GC-MS分析。色谱条件：采用GC-MS-QP2010 Ultra(Shimadzu，Japan)色谱系统，RXI-5sil毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)柱；采用程序升温，起始温度为45℃，并在这个温度保持5min后，再以10℃/min的速率升温至140℃，于140℃保持5min后，以0.5℃/min的速率升温至170℃，保持1min，最后以15℃/min的速率升温至280℃，保持5min；分流比为50∶1；氦气流速为1mL/min；进样口温度为220℃；EI温度为280℃；电子轰击能量为70eV。
根据GC-MS分析得到的GC谱图的各个峰峰保留时间及峰面积、MS图谱结合化合物库进行匹配分析，得到的本发明实施例1-6的山茱萸多糖组分的糖残基组成及摩尔比。实施例1山茱萸多糖组分的糖残基组成和摩尔比为1,3-吡喃型半乳糖醛酸∶1,6-吡喃型半乳糖醛酸∶1,2-吡喃型木糖∶1,2,4-吡喃型木糖∶1,3-吡喃型半乳糖∶1,6-吡喃型半乳糖∶1,2,6-吡喃型半乳糖∶1,3,6-吡喃型半乳糖∶1,2,3,6-吡喃型半乳糖∶1,6-吡喃型葡萄糖∶吡喃型端基葡萄糖∶1,2-吡喃型鼠李糖＝7.17∶9.03∶20.58∶33.01∶10.54∶15.04∶4.21∶2.36∶1.90∶20.16∶16.04∶1.00；实施例2山茱萸多糖组分的糖残基组成和摩尔比为1,3-吡喃型半乳糖醛酸∶1,6-吡喃型半乳糖醛酸∶1,2-吡喃型木糖∶1,2,4-吡喃型木糖∶1,3-吡喃型半乳糖∶1,6-吡喃型半乳糖∶1,2,6-吡喃型半乳糖∶1,3,6-吡喃型半乳糖∶1,2,3,6-吡喃型半乳糖∶1,6-吡喃型葡萄糖∶吡喃型端基葡萄糖∶1,2-吡喃型鼠李糖＝10.30∶12.12∶38.07∶20.83∶10.74∶10.33∶5.01∶2.21∶6.99∶23.26∶13.91∶1.00；实施例3山茱萸多糖组分的糖残基组成和摩尔比为1,3-吡喃型半乳糖醛酸∶1,6-吡喃型半乳糖醛酸∶1,2-吡喃型木糖∶1,2,4-吡喃型木糖∶1,3-吡喃型半乳糖∶1,6-吡喃型半乳糖∶1,2,6-吡喃型半乳糖∶1,3,6-吡喃型半乳糖∶1,2,3,6-吡喃型半乳糖∶1,6-吡喃型葡萄糖∶吡喃型端基葡萄糖∶1,2-吡喃型鼠李糖＝10.71∶25.62∶35.07∶4.69∶23.04∶18.53∶2.01∶1.61∶2.47∶27.16∶23.66∶32.13；实施例4山茱萸多糖组分的糖残基组成和摩尔比为1,3-吡喃型半乳糖醛酸∶1,6-吡喃型半乳糖醛酸∶1,2-吡喃型木糖∶1,2,4-吡喃型木糖∶1,3-吡喃型半乳糖∶1,6-吡喃型半乳糖∶1,2,6-吡喃型半乳糖∶1,3,6-吡喃型半乳糖∶1,2,3,6-吡喃型半乳糖∶1,6-吡喃型葡萄糖∶吡喃型端基葡萄糖∶1,2-吡喃型鼠李糖＝11.41∶29.22∶8.11∶15.39∶25.66∶9.43∶0.98∶2.31∶1.82∶5.65∶13.06∶1.00；实施例5山茱萸多糖组分的糖残基组成和摩尔比为1,3-吡喃型半乳糖醛酸∶1,6-吡喃型半乳糖醛酸∶1,2-吡喃型木糖∶1,2,4-吡喃型木糖∶1,3-吡喃型半乳糖∶1,6-吡喃型半乳糖∶1,2,6-吡喃型半乳糖∶1,3,6-吡喃型半乳糖∶1,2,3,6-吡喃型半乳糖∶1,6-吡喃型葡萄糖∶吡喃型端基葡萄糖∶1,2-吡喃型鼠李糖＝12.53∶4.27∶6.07∶14.03∶20.44∶11.13∶1.03∶2.91∶1.11∶11.06∶3.76∶1.00；实施例6山茱萸多糖组分的糖残基组成和摩尔比为1,3-吡喃型半乳糖醛酸∶1,6-吡喃型半乳糖醛酸∶1,2-吡喃型木糖∶1,2,4-吡喃型木糖∶1,3-吡喃型半乳糖∶1,6-吡喃型半乳糖∶1,2,6-吡喃型半乳糖∶1,3,6-吡喃型半乳糖∶1,2,3,6-吡喃型半乳糖∶1,6-吡喃型葡萄糖∶吡喃型端基葡萄糖∶1,2-吡喃型鼠李糖＝16.31∶19.89∶18.08∶6.78∶10.34∶11.54∶1.01∶0.23∶0.26∶18.09∶24.35∶1.00。
实验例5山茱萸多糖组分对HepG2细胞增殖的影响
实验细胞：人肝癌细胞HepG2。
实验方法：MTT比色法测定本发明实施例1山茱萸多糖组分对HepG2细胞增殖的影响。将HepG2细胞用无血清培养基调整细胞浓度，以2-4×103/孔的密度接种于96孔板中，细胞贴壁并达到50-70％左右融合时，加入含不同浓度梯度的山茱萸多糖培养液共孵育。多糖梯度浓度为0，0.01，0.03，0.1，0.3，1，3，10，30，100mg/L。分别共孵育12h，24h，于上述三个时间点，取出相应的培养板，加入10μl 5mg/ml的MTT检测液，孵育4h后甩掉旧的培养基并向每孔加入150μl DMSO，摇床混匀10min，于490nm测定吸光度。
结果：本发明实施例1山茱萸多糖组分对HepG2细胞的增殖抑制作用见表1。本发明实施例1山茱萸多糖组分在低浓度且药物作用12h，24h时，对HepG2细胞无毒性作用。
表1山茱萸多糖组分对HepG2细胞的增殖抑制作用
Figure BDA0003303566590000171
实验例6山茱萸多糖组分对HepG2细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖消耗和摄取的影响
实验细胞：人肝癌细胞HepG2。
实验方法：用葡萄糖过氧化物酶(GOD-POD)法测定生理状态下HepG2细胞和胰岛素抵抗模型HepG2细胞葡萄糖消耗量；用荧光D-葡萄糖类似物(2-NBDG)示踪法测定生理状态下HepG2细胞和胰岛素抵抗模型HepG2细胞葡萄糖摄取量。
葡萄糖消耗量测定：HepG2细胞用含2％FBS的低糖DMEM培养基调整细胞浓度，以5×104个/ml的密度接种于96孔板中，培养贴壁后，PBS清洗两次，空白组加入无血清高糖DMEM培养液，模型组加入含有500nM胰岛素的高糖DMEM培养液，继续培养48h。将模型组分为9组，即10mg/L本发明实施例1-6山茱萸多糖组分给药组，10mg/L山茱萸总多糖给药组，10mg/L已报道的山茱萸1,6-吡喃型葡聚糖给药组，以及罗格列酮阳性对照组。将空白组和模型组细胞用PBS洗涤2次，分别加入含上述浓度的各类多糖或罗格列酮的无血清低糖DMEM培养液，孵育24h。取细胞培养液用GOD-POD法测定培养液中葡萄糖含量，计算每孔中葡萄糖的消耗量。
葡萄糖摄取量测定：在黑壁透明底96孔板中构建上述正常生理条件下的HepG2细胞和胰岛素抵抗模型HepG2细胞，然后除去培养基，用PBS清洗细胞。加入无血清无糖培养基，细胞饥饿处理3h。将模型组分为9组，即10mg/L本发明实施例1-6山茱萸多糖组分给药组，10mg/L山茱萸总多糖给药组，10mg/L已报道的山茱萸1,6-吡喃型葡聚糖给药组，以及罗格列酮为阳性对照组然后用含有上述浓度的各类多糖或罗格列酮，和100μM 2-NBDG的无血清无糖的DMEM与细胞共孵育，摄取30min。用荧光分光光度计在485nm激发光，544nm发射光下测定荧光强度。
统计学处理：实验数据以平均数±标准差表示，组间采用方差分析进行比较，P<0.05表示有显著性差异。
结果：葡萄糖摄取反应的是糖的瞬时消耗量，能够更加直观的反应细胞表面胰岛素受体的敏感性，结果见表2。本发明实施例1-6山茱萸多糖组分在生理状态下和胰岛素抵抗状态下对HepG2细胞的葡萄糖摄取活性有极显著的促进作用(P<0.05)。对比而言，山茱萸总多糖和山茱萸1,6-吡喃型葡聚糖对正常组和模型组细胞的葡萄糖摄取均无明显促进作用。在生理状态下和在病理状态下，与对照组相比，浓度为10mg/L的本发明实施例1-6山茱萸多糖组分给药组摄取2-NBDG的荧光强度显著升高(P<0.05)，各组间的差异无显著性；且作用效果与10μM的罗格列酮相当。
药物对HepG2细胞葡萄糖消耗的影响结果，见表3。生理状态下实施例1-6的10mg/L山茱萸多糖组分均可促进HepG2细胞葡萄糖的消耗。在胰岛素抵抗状态下，本发明实施例1-6山茱萸多糖组分极其显著地促进了HepG2细胞对葡萄糖的消耗(P<0.05)，且作用效果比罗格列酮好，但无显著性。在生理状态下和在胰岛素抵抗状态下10mg/L本发明实施例1-6山茱萸多糖组分给药促进了HepG2细胞对葡萄糖的消耗，并且各组间差异无显著性；山茱萸总多糖和山茱萸1,6-吡喃型葡聚糖对正常组和模型组细胞的葡萄糖摄取均无明显促进作用。
以上实验结果表明本发明山茱萸多糖组分具有显著的体外降血糖活性，且其降血糖作用效果比山茱萸总多糖和已报道的山茱萸1,6-吡喃型葡聚糖的效果更加显著。
表2药物对正常生理状态HepG2细胞和胰岛素抵抗状态HepG2细胞摄取2-NBDG活性的影响(平均数±标准差，n＝4)
Figure BDA0003303566590000191
Figure BDA0003303566590000201
注：与正常组进行对比*P<0.05；与模型组对比#P<0.05。
表3药物对正常生理状态HepG2细胞和胰岛素抵抗状态HepG2细胞葡萄糖消耗的影响(平均数±标准差，n＝4)
Figure BDA0003303566590000202
注：与正常组进行对比*P<0.05；与模型组对比#P<0.05。
实验例7山茱萸多糖组分对高脂饮食(HFD)/链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病模型大鼠的降血糖及肾脏的保护作用
实验动物：SD大鼠，雄性，体重170-220g。
实验方法：大鼠以HFD喂食4周后，禁食(不禁水)12h后，模型组和治疗组动物尾静脉注射链脲佐菌素35mg/kg(用pH＝4.5的柠檬酸钠溶液配制)，正常对照组注射相同体积柠檬酸钠溶液。1周后(禁食12h)，尾静脉取血测定血糖，血糖大于16.7mmol/L认为造模成功。将造膜成功后的大鼠40只，随机分5组，即模型组、50mg/kg和100mg/kg本发明实施例1山茱萸多糖组分给药组，100mg/kg山茱萸总多糖给药组，胰岛素给药的阳性对照组；另设正常对照组(8只大鼠)。试验中采用给受试动物灌胃的给药方法，每天给药一次。正常组和模型组给予生理盐水作对照。自由进食、饮水。给药周期6周，每2周尾静脉采血，测空腹血糖和尿微量白蛋白等。观察山茱萸多糖对糖尿病及糖尿病并发肾病的治疗作用。
统计学处理：实验数据以平均数±标准差表示，组间采用方差分析进行比较，P<0.05表示有显著性差异。
结果：药物对糖尿病大鼠血糖的影响见表4，对尿微量白蛋白影响结果见表5。造模后大鼠的血糖和尿微量白蛋白含量明显高于正常大鼠，同时出现多饮、多尿和消瘦的体征。本发明实施例1山茱萸多糖组分给药后，各剂量组的大鼠血糖和尿微量白蛋白均有不同程度的降低，且降糖效果呈剂量依赖性。与山茱萸总多糖给药组相比，本发明实施例1山茱萸多糖组分的降糖效果和降低尿微量白蛋白含量的作用更为显著。说明本发明实施例1山茱萸多糖组分对肾脏有显著的保护作用，并且作用效果比山茱萸总多糖给药组好。本发明实施例1山茱萸多糖组分对肾脏的保护作用优于山茱萸总多糖，与胰岛素作用效果接近，说明其对糖尿病肾病也具有保护作用，能够有效地预防或治疗糖尿病及糖尿病肾病这一常见的糖尿病并发症。
表4药物对糖尿病大鼠血糖含量的影响(平均数±标准差，n＝8)
Figure BDA0003303566590000221
注：与模型组进行对比*P<0.05。
表5药物对糖尿病大鼠尿微量白蛋白的影响(平均数±标准差，n＝8)
Figure BDA0003303566590000222
注：*与模型组进行对比，存在显著性差异(P<0.05)。
实验例8山茱萸多糖组分对四氧嘧啶诱导I型糖尿病模型小鼠的降血糖作用
实验动物：Balb/c雄性小鼠，体重17-25g。
实验方法：对小鼠进行一周的适应喂养，注射前一天，禁食(不禁水)12h后，模型组和治疗组动物尾静脉注射四氧嘧啶80mg/kg(四氧嘧啶溶液由生理盐水配制)，正常对照组注射等量生理盐水。注射四氧嘧啶溶液72h后，从小鼠尾静脉取血测定血糖，用葡萄糖试剂盒测定小鼠空腹血糖，若小鼠空腹血糖大于11.1mmol/L认为造模成功。将造膜成功的小鼠40只，随机分5组给药，即模型组、本发明实施例1得到的50mg/kg和100mg/kg山茱萸多糖组分给药组，100mg/kg山茱萸总多糖给药组；胰岛素给药阳性对照组；另设正常对照组(8只小鼠)。试验中利用给受试动物灌胃的给药方法，于正常组和模型组给予等量生理盐水作对照。在给药之后，各组灌胃淀粉5g/kg，分别于0、2、4、6h后尾静脉采血，测血糖值。
统计学处理：实验数据采用平均数±标准差表示，各不同组间采用方差分析进行比较，P<0.05表示有显著性差异。
结果：药物对四氧嘧啶诱导I型糖尿病小鼠的血糖影响结果见表6。造模后小鼠血糖含量明显高于正常组(P<0.05)。经过药物治疗后，小鼠血糖含量不同程度的降低了。本发明实施例1山茱萸多糖组分对模型小鼠的降血糖效果呈剂量依赖性；与山茱萸总多糖给药组相比，本发明实施例1山茱萸多糖组分对模型小鼠的降糖效果显著(P<0.05)；与阳性对照组相比，本发明实施例1山茱萸多糖组分对模型小鼠的降糖效果较好，但无显著性差异。本发明实施例1山茱萸多糖组分对四氧嘧啶诱导Ⅰ型糖尿病小鼠具有降低血糖的治疗作用，且其降糖作用效果比山茱萸总多糖更显著，与胰岛素相比治疗效果相当。
表6药物对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖的影响(平均数±标准差，n＝8)
Figure BDA0003303566590000231
Figure BDA0003303566590000241
注：*与模型组进行对比，存在显著性差异(P<0.05)。
实验例9山茱萸多糖组分具有改善糖尿病模型小鼠的糖尿病肝损伤的作用
实验动物：4周龄db/m小鼠和4周龄db/db小鼠)，体重18-27g。
实验方法：以8只db/m小鼠为正常对照组，db/db小鼠为实验组，小鼠适应喂养5天，以高糖高脂饲料喂养，持续喂养4周；db/db小鼠是先天性Ⅱ型糖尿病模型，在高糖高脂饲料诱导后体重和血糖显著性上升，而同样的饲喂条件下db/m小鼠的体重与血糖值变化较小。空腹血糖水平>300mg/dL的小鼠造模成功，选取造膜成功的，db/db小鼠40只，随机分5组，即模型组、本发明实施例1得到的20mg/kg、50mg/kg山茱萸多糖治疗组、50mg/kg山茱萸总多糖给药组，阳性药对照组。试验中采用给受试动物灌胃的给药方法，正常组和模型组给予生理盐水作对照。给药4周后，各组灌胃淀粉5g/kg，各组小鼠禁食6小时后取血浆，测体重、FBG、HbA1c和Amylase水平，用检测试剂盒测定血浆谷丙转氨酶(ALT)水平和天门冬氨酸转氨酶(AST)水平；分离肝脏测体重肝重比。
统计学处理：实验数据以平均数±标准差表示，组间采用方差分析进行比较，P<0.05表示有显著性差异。
结果：药物干预4周后对糖尿病小鼠FBG、HbA1c和Amylase水平的影响见表7。模型组中小鼠FBG水平相比正常组显著升高(P<0.05)，本发明实施例1山茱萸多糖组分给药治疗后，小鼠FBG水平下降，FBG水平下降与山茱萸多糖组分给药呈现剂量依赖性关系；与山茱萸总多糖给药组相比，本发明实施例1山茱萸多糖组分降低小鼠的FBG效果更好，与胰岛素治疗效果接近。血清中的HbA1c水平能够反映患病小鼠2-3周内的平均血糖水平，不受临时血糖浓度波动的干扰，而Amylase负责糖及淀粉的分解，二者更能反映血液中真正的血糖水平。由表7可知，与空白组相比，模型组中大鼠HbA1c和Amylase水平明显升高，在给药4周治疗后，本发明实施例1山茱萸多糖组分低剂量组和高剂量组均能降低小鼠的HbA1c和Amylase值(P<0.05)且呈剂量依赖关系。与山茱萸总多糖组相比，本发明实施例1山茱萸多糖组分高剂量组的降低小鼠HbA1c和Amylase水平更明显，与胰岛素给药组的作用效果接近。以上结果说明本发明实施例1山茱萸多糖组分能显著降低患病小鼠的血糖水平。与模型组相比，本发明实施例1山茱萸多糖组分治疗后小鼠的肝重/体重和血浆中ALT、AST水平降低，见表8。，在高糖高脂饲料诱导下的db/db小鼠先天性Ⅱ型糖尿病模型中，本发明实施例1山茱萸多糖组分不仅改善了II型糖尿病的相关症状，还降低了血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平，故对糖尿病伴随的肝损伤也具有治疗效果。
表7药物干预4周后对糖尿病小鼠FBG、HbA1c和Amylase水平的影响(平均数±标准差，n＝8)
Figure BDA0003303566590000251
Figure BDA0003303566590000261
注：*与模型组相比，存在显著性差异(P<0.05)。
表8药物对小鼠的肝重/体重和血浆中ALT、AST水平的影响(平均数±标准差，n＝8)
组别 肝重/体重 ALT/(％) AST/(％)
正常对照组 0.061±0.0051 63.22±5.09 79.32±4.67
模型组 0.127±0.011* 1047.55±92.34* 428.17±30.59*
20mg/kg山茱萸多糖组分 0.092±0.0082 781.71±67.24 224.68±20.42
50mg/kg山茱萸多糖组分 0.074±0.0067<sup>#</sup> 631.31±42.72<sup>#</sup> 208.68±16.05<sup>#</sup>
50mg/kg山茱萸总多糖 0.086±0.064 736.82±52.63 216.82±12.74
胰岛素给药组 0.072±0.036<sup>#</sup> 583.35±30.07<sup>#</sup> 164.21±17.25<sup>#</sup>
注：*与正常对照组比较，存在显著性差异(P<0.05)；#与模型组比较，存在显著性差异(P<0.05)。
虽然本发明的具体实施方式对本发明进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。

Claims (4)

1.一种山茱萸多糖组分，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：
称取10 kg干燥山茱萸药材，用50 L无水乙醇于80℃下回流提取3小时脱脂，过滤，弃去乙醇提取液，把山茱萸药渣按上述方法再处理1次，过滤，弃去乙醇提取液，收集药渣，将乙醇挥干，在40℃下将药渣干燥后，用60 L水溶液回流提取3次，每次3 h，过滤，合并滤液，于60℃减压浓缩至6000 mL，冷却至室温后，向浓缩液加入18 L无水乙醇，于4℃静置24小时后，使多糖成分沉淀析出，3000 r/min离心20 min，收集沉淀；沉淀用5 L水溶解，反复冻融10次，再采用Sevag法除蛋白，Sevag试剂与多糖水溶液体积比为1:6，重复Sevag法2次，离心，弃去沉淀，保留水相，减压浓缩至500 mL得浓缩液一；将浓缩液一，用3倍体积的30vt%过氧化氢水溶液进行脱色，脱色温度80℃，回流2 h，水溶液60℃减压浓缩至500 mL，得到浓缩液二，即总多糖浓缩液；将总多糖浓缩液离心，弃去沉淀，取上清液上DEAE-sephadex A-25柱分离纯化，用30000 mL水洗脱，至洗脱液苯酚-硫酸法显色无黄色出现，弃去水洗脱的多糖组分；再用30000 mL 0.5 mol/L NaCl洗脱，至苯酚-硫酸法显色无黄色出现，收集0.5mol/L NaCl洗脱液，于60℃减压浓缩至400 mL；浓缩液离心后平均分为2份，分别用Sephadex G-100凝胶柱分离纯化，用3000 mL水洗脱，弃去前750 mL其他多糖组分和后750mL其他多糖组分，收集中间1500 mL的洗脱液，减压浓缩至400 mL，合并2次浓缩液，冷冻干燥，一共得到山茱萸多糖组分58.2 g；
山茱萸多糖组分重均分子量平均为5.9×104 Da，山茱萸多糖组分的单糖组成和摩尔比为木糖∶葡萄糖∶半乳糖∶半乳糖醛酸∶鼠李糖=31.03∶21.13∶20.01∶9.51∶1.00。
2.权利要求1所述的山茱萸多糖组分在制备治疗或预防糖尿病或糖尿病相关疾病的药物及保健品中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述糖尿病为I型糖尿病或II型糖尿病，糖尿病相关疾病为糖尿病肾病或糖尿病肝损伤。
4.一种药物或保健品，其特征在于，包括权利要求1所述的山茱萸多糖组分。
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