CN102757512A

CN102757512A - 山茱萸多糖的微波提取与纯化工艺

Info

Publication number: CN102757512A
Application number: CN2012102036850A
Authority: CN
Inventors: 屈俊峰; 徐峰; 赵永贤; 史晨晨; 昝攀攀
Original assignee: ANHUI KAIYING PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: ANHUI KAIYING PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2012-06-20
Filing date: 2012-06-20
Publication date: 2012-10-31

Abstract

山茱萸多糖的微波提取与纯化工艺，涉及中药提取技术领域，首先称取山茱萸药材适量，置于圆底烧瓶中，加水10-20倍量浸泡0.5-2小时，超声功率为600W，超声提取3次，每次10-30分钟，合并提取液，过滤，浓缩，加入95%乙醇，静置24小时，倾去上清液，减压抽滤，滤饼再用水加热至完全溶解，浓缩，加入95%乙醇，静置24小时，抽滤，50℃真空干燥，烘干即得山茱萸粗多糖；用Savag脱蛋白以及活性炭脱色等进一步纯化得山茱萸精多糖，用苯酚- 硫酸比色法测定山茱萸精多糖的含量，纯度可以达到80%以上。本发明提取时间短，能耗低，药材原料处理量大，成倍或数倍提高，且杂质少，有效成分易于分离、净化，成本低，综合经济效益显著。

Description

山茱萸多糖的微波提取与纯化工艺

技术领域

本发明涉及中药提取技术领域，具体涉及一种山茱萸多糖的微波提取与纯化工艺。

背景技术

随着科学技术的进步，对植物多糖的研究也不断的深入，现在药理研究表明，多糖具有多种药理作用，其作用主要包括：增强免疫、抗肿瘤、降血压、降血脂、降血糖、抗衰老、增强骨髓造血机能、抗辐射、对肝肾等主要脏器的保护作用等。正是由于多糖具有如此之多的功效，人们越来越关注多糖的研究，目前，中药多糖的化学研究范围主要涉及提取、分离、纯化、定量定性、结构分析、构效关系、分子量及单糖组成等方面。随着检测仪器和方法的不断进步，人们对于多糖的认识进一步增多，多糖的发展在进一步加快，多糖对于人类疾病的预防与治疗也将更加得到人们的重视。

山茱萸 ( Fructus Corni)为山茱萸科植物山茱萸的干燥果肉, 又名山萸肉、药枣、肉枣等, 临床上以除去种子的成熟果实入药, 其味酸、涩、微温, 归肝肾经, 有补益肝肾、涩精固脱的功效, 是我国传统的中药材。也是中医常用的名贵药材之一。中医药临床研究证明，山茱萸是治疗糖尿病、冠心病和高血压病的主要药材。现代研究表明，山茱萸具有增强免疫系统功能、抗炎抑菌、降血糖、抗休克、抗氧化、抗肿瘤等作用。山茱萸中含有丰富的多糖类成分，药理研究显示，山茱萸多糖是其中一类主要活性成分。果肉中主要成分有糖类、有机酸类及其酯类、鞣质类等。多糖类物质是生命代谢不可缺少的重要物质, 具有多种生物活性而成为当今生物医药研究和开发的一大热点。

传统的加热提取是以热传导、热辐射等方式由外向里进行，而微波提取是通过偶极子旋转和离子传导两种方式里外同时加热。和传统加热提取相比，微波提取具有以下特点：①质量高，可有效地保护食品、药品以及其他化工物料中的功能成分； ②产量大； ③对提取物具有高选择性； ④省时，可节省50％～90％的时间； ⑤溶剂用量少（可较常规方法少50％～90％）； ⑥低耗能。微波辐射技术在食品提取工业和化学工业上的应用研究虽然起步只有短短几年的时间，但已有的研究成果和应用成果已足以显示其以下优越性： ①反应或提取快；②产率高，产品质量好；③后处理方便；④安全；⑤无污染，属于绿色工程；⑥生产线组成简单，节省投资；微波提取效率高、纯度高、能耗小、产生废物少、操作费用少、符合环境保护要求。可广泛用于中草药、香料、保健食品、化妆食品、化妆品、茶饮料、调味料、果胶、高粘度壳聚糖等行业，目前在我国微波提取已经用于多项中草药的侵取生产线之中，如葛根、茶叶、银杏等。微波提取已列为我国二十一世纪食品加工和中药制药现代化推广技术之一。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提高一种提取效率高，纯度高的山茱萸多糖的微波提取与纯化工艺。

本发明所要解决的技术问题采用以下技术方案来实现：

山茱萸多糖的微波提取与纯化工艺，其特征在于：包括以下方法步骤，

一.山茱萸多糖的提取

称取山茱萸药材适量，置于圆底烧瓶中，加水10-20倍量浸泡0.5-2小时，超声功率为600W，超声提取3次，每次10-30分钟，合并提取液，过滤，浓缩，得到浓缩液，加入浓缩液体积的0.1-5倍的95%乙醇，静置24小时，倾去上清液，减压抽滤，滤饼再用水加热至完全溶解，浓缩，再加入浓缩液体积的0.1-5倍的95%乙醇，静置24小时，抽滤，50℃真空干燥，烘干即得山茱萸粗多糖；

二．山茱萸粗多糖的纯化

①．精密称取50mg山茱萸粗多糖，加蒸馏水溶解，并定容至100ml，配制成0.5mg/ml的粗多糖溶液，按照V_样品∶V_试剂为5:1的比例加入Sevag试剂（V_氯仿∶V_正丁醇=4:1）萃取3次，取上层液，即可脱去蛋白；

②．取步骤①中脱蛋白后的多糖溶液，浓缩（除尽氯仿、正丁醇），加入2%的活性炭，于80℃下水浴30min，抽滤，滤液浓缩至原体积，即可脱色。

所述的Sevag试剂由氯仿、正丁醇构成，其体积比为V_氯仿∶V_正丁醇=4:1。

本发明的有益效果是：本发明提取时间短，能耗低，药材原料处理量大，成倍或数倍提高，且杂质少，有效成分易于分离、净化，成本低，综合经济效益显著。

附图说明

图1为实施例中葡萄糖对照品扫描图；

图2为实施例中山茱萸多糖样品扫描图；

图3为实施例中葡萄糖标准曲线图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

1.准备仪器和试药

1.1 药材

山茱萸药材。

1.2 试剂

苯酚（上海中试化工总公司）；浓硫酸（上海中试化工总公司）；葡萄糖对照品（上海中试化工总公司）；95%乙醇（上海东懿化学试剂有限公司）；碳酸氢钠（上海苏懿化学有限公司）。

1.3 仪器

紫外可见分光光度计（上海精科，型号：UV757）；微电脑微波提取器（南京陵江科技开发有限责任公司，型号：LWMC-201）；真空干燥箱（上海浦东跃欣科学仪器厂，型号：DZF-200型）；电子天平（德国METTLER公司，型号： AG285型）；恒温水浴箱（常州国华电器有限公司）。

2.多糖的含量测定

2.1对照品溶液的制备

精密称取105℃真空干燥至恒重的无水葡萄糖对照品12.60mg，置于100ml量瓶中，加蒸馏水并稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液（浓度为0.1260mg/ml）。精密移取2.0ml，3.0ml，4.0ml，5.0ml，6.0ml，7.0ml，8.0ml对照品储备液，置于10ml量瓶中加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，配成系列葡萄糖标准溶液。

2.2 山茱萸多糖的提取

称取适量山茱萸，置于圆底烧瓶中，加15倍量水浸泡2小时，置微波提取器（微波功率600W）中提取3次，每次15分钟，合并提取液，过滤，浓缩，加入一定体积的95%乙醇，静置24h，倾去上清液，减压抽滤，滤饼再用水加热至完全溶解，浓缩，加入一定体积的95%乙醇，静置24h，抽滤，50℃真空干燥，烘干即得山茱萸粗多糖。

2.3 供试品溶液的制备

精确称取50℃干燥至恒重的山茱萸多糖5.0mg，置100ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。

2.4苯酚试液的配制

称取苯酚100 g，加铝片0.1 g，加碳酸氢钠0.05 g，油浴中常压蒸馏，收集182℃的馏分，取馏出液5g，置100ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，备用。

2.5吸收波长的选择

分别精密吸取1.0ml“2.3”项下多糖溶液和葡萄糖对照品液于具塞试管中，加5%苯酚1ml，浓硫酸5ml，摇匀，放置5min后水浴加热10min，流水放冷。同法用蒸馏水做空白，于紫外可见分光光度计上在370nm~600nm范围内扫描，确定最大吸收波长为486nm，扫描图见图1、图2。

2.6标准曲线的绘制

精确吸取2.1项下各葡萄糖标准溶液1.0 ml，按照“2.5”项下同法操作，于486nm处测吸收度。以吸收度(A)对葡萄糖浓度(C)作回归处理，得回归方程Y=0.015X-0.0811，相关系数r=0.9999，结果表明葡萄糖浓度为25.2μg/ml～100.8μg/ml时吸收度A与样品浓度C有良好的线性关系，见表1，图3。

表1葡萄糖线性关系试验数据

2.7精密度试验

精密吸取“2.1”项下对照品储备液，连续测定5次，结果为RSD=0.35%，表明本法精密度较好，见表2。

表2 精密度试验结果

2.8稳定性试验

分别精密吸取“2.3”项下多糖溶液1.0 ml，按“2.5”项下同法操作，分别在0、0.5、1、1.5、2 h测定，结果为RSD＝0.39%，可见多糖溶液在2 h内基本稳定，见表3。

表3 稳定性试验结果

2.9加样回收率试验

精密吸取0.5ml“2.3”项下多糖液，各精密加入葡萄糖对照品储备液0.2ml，加蒸馏水至1.0 ml，按“2.5”项下同法操作，得平均回收率97.63%，RSD为0.59%，见表4。

表4 加样回收率试验结果

2.10样品含量测定

分别精密吸取山茱萸供试品多糖溶液和葡萄糖对照品液于具塞试管中，各加5%苯酚1ml，浓硫酸5ml，摇匀，放置5min后水浴加热10min，流水放冷。同法用蒸馏水做空白，于紫外可见分光光度计上在486nm波长处测定吸光度，计算，即得。

3 山茱萸多糖的提取与纯化

在预试验的基础上采用正交试验设计，对山茱萸多糖的最佳微波水提取工艺进行研究。对山茱萸粗多糖脱色、脱蛋白过程进行考察，以多糖损失率、蛋白脱除率为指标，比较Sevag法和三氯乙酸法(TCA)对山茱萸多糖脱蛋白的效果；以脱色率、多糖保留率为指标，比较不同浓度的活性炭对山茱萸多糖脱色的效果；经脱色、脱蛋白得山茱萸精多糖。

3.1提取工艺研究

3.1.1正交试验设计

以山茱萸作为原料，在预试验的基础上，设计以料液比（为药材重量的倍数）、提取次数和提取时间和微波功率作为考察因素，以多糖含量作为考察指标，选择L₉（3⁴）正交表进行试验，因素水平表见表5。

表5 正交试验因素水平表

3.1.2正交试验方法与结果

称取山茱萸27份，每份15g，按照L₉（3⁴）正交试验表进行试验，每组试验平行三次。按 “2.3”项下同法制备多糖溶液，“2.5”项下同法操作，测定山茱萸多糖的含量，正交试验结果见表6，方差分析结果见表7。

表6 正交试验结果

表7 多糖含量方差分析结果

正交试验结果可知，从影响因素上看，各因素多糖含量的影响程度为D>B > A > C，其中因素D（微波功率）、因素B（提取次数）有显著性影响；从直观上分析，并根据成本和提取效果综合考虑，故优选出水提取的最佳方案为A₁B₃C₁D₃，即以15倍量水，提取3次，每次15分钟，微波功率为600W。

3.2分离纯化

3.2.1两种脱蛋白方法的比较

① Sevag法

精密称取50mg粗多糖，加蒸馏水溶解，并定容至100ml，配制成0.5mg/ml的粗多糖溶液，按照V_样品∶V_试剂为5:1的比例加入Sevag试剂（V_氯仿∶V_正丁醇=4:1）萃取3次，取上层液，浓缩，分别于260nm、280nm测定吸收度，计算蛋白质浓度，结果见表8。

②TCA法

精密称取50mg粗多糖，加蒸馏水溶解，并定容至100ml，配制成0.5mg/ml的粗多糖液，按照V_样品∶V_试剂为1:10的比例加入10%三氯乙酸，静置24h，离心(4000r/min，10min)，取上清液，用10％NaOH溶液调pH至7，分别于280nm、260nm测定吸收度，计算蛋白质浓度，结果见表8。

蛋白质浓度(mg/ml)=1.45A₂₈₀-0.74A₂₆₀；

蛋白质脱除率(%)=（蛋白质脱除前浓度-蛋白质脱除后浓度）÷蛋白质脱除前浓度×100%；

多糖的损失率(%)=（提取液中多糖的含量-脱蛋白液中多糖的含量）÷提取液中多糖的含量×100%；

表8 2种不同方法脱蛋白的效果比较（n=3）

由表8所示，Sevag法的蛋白质脱除率最大且多糖损失率最小，故Sevag

法作为白术多糖的脱蛋白方法。

3.2.2不同浓度活性炭脱色方法的比较

取Sevag法脱蛋白后的多糖溶液，浓缩（除尽氯仿、正丁醇），分别加入1%、2%、3%的活性炭，于80℃下水浴30min。抽滤，滤液浓缩至原体积，以蒸馏水为空白，在450nm和486nm检测波长测定其吸收度。

脱色率=（脱色前光密度-脱色后光密度）÷脱色前光密度×100%；

保留率=脱色后多糖浓度÷脱色前多糖浓度×100%（结果见表9）；

表9 3种不同浓度活性炭脱色的效果比较（n=3）

由表9可知，2%活性炭，80℃水浴脱色30min为白术多糖的最佳脱色工艺。

3.3验证实验

分别称取山茱萸药材200g三份，按照正交试验结果所确定的最佳条件A₁B₃C₁D₃进行试验，结果见表10。

总糖含量(%)=C×D÷W×100%

C———为样品溶液的葡萄糖重量，μg;

D———为样品溶液的稀释倍数；

W———称取的干燥精多糖的重量，μg。

表10 水提取工艺研究验证及纯化试验结果

结果表明本发明提取工艺切实可行。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims

1.山茱萸多糖的微波提取与纯化工艺，其特征在于：包括以下方法步骤，

A.山茱萸多糖的提取

B．山茱萸粗多糖的纯化

a．精密称取50mg白术粗多糖，加蒸馏水溶解，并定容至100ml，配制成0.5mg/ml的粗多糖溶液，按照V_样品∶V_试剂为5:1的比例加入Sevag试剂，萃取3次，取上层液，即可脱去蛋白；

b．取步骤a中脱蛋白后的多糖溶液，浓缩，除尽氯仿、正丁醇，加入2%的活性炭，于80℃下水浴30min，抽滤，滤液浓缩至原体积，即可脱色。

2.根据权利要求1所述的白术多糖的超声提取与纯化工艺，其特征在于：所述的Sevag试剂由氯仿、正丁醇构成，其体积比为V_氯仿∶V_正丁醇=4:1。