CN102295651A - 一种银杏叶中总黄酮和总内酯的提取分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种银杏叶中总黄酮和总内酯类化合物的高效提取分离制备方法，其中所述提取分离物的主要成分为黄酮及其苷类、银杏二萜内酯类。所述制备方法包括以下步骤：提取、醇沉、水沉、大孔树脂分离和硅胶基质键合材料分离。采用所述方法制备的主要成分中目标物含量高、有机残留低，且所述方法重现性好、生产周期短并能够实现大规模工业生产。

Description

一种银杏叶中总黄酮和总内酯的提取分离方法

技术领域

本发明涉及一种天然植物中目标组分的提取分离方法，具体涉及一种银杏叶中总黄酮和总内酯的高效提取分离制备方法。更进一步地，本发明涉及一种从银杏叶中提取、分离制备黄酮及其苷类、银杏二萜内酯类和白果内酯的方法，所述黄酮及其苷类、银杏二萜内酯类和白果内酯在分离产物中总含量可以达到40％，甚至更高。

背景技术

银杏(拉丁学名为ginkgo，二名法为Ginkgo biloba)为落叶乔木，属银杏科裸子植物，又叫白果树、公孙树，是我国特有的珍贵树种，也是世界上最古老的树种，被称做“活化石”。银杏树在我国有着广泛的分布，例如著名的湖州长兴古银杏长廊(古银杏长廊位于小浦八都，为长兴县三大古生态奇观之一)，在整个长廊长约12.5公里、宽在500米到5公里的范围内，散落着3万多株原生野银杏，其中百年以上的老树有2700多株。

银杏在我国作为药用已有1000多年的历史，根据《本草纲目》记载，银杏具有“入肺经、益脾气、定喘咳、缩小便”等作用。清代张璐璐的《本经逢源》中记载，白果具有降痰、清毒、杀虫的功能，可治疗“疮疥疽瘤、乳痈溃烂、牙齿虫龋、小儿腹泻、赤白带下、慢性淋浊、遗精遗尿”等症。

现代医学研究发现，银杏叶中含有的类黄酮物质对动物的循环系统、脑功能有明显改善作用。近年来，银杏叶用作保健食品和植物药，广泛用于防治记忆力下降、痴呆及心脑血管等疾病。

孙保亮等(内皮素-1与脑血管痉挛缺血性脑损害的关系及银杏叶制剂的保护作用，孙保亮等，中国中西医结合杂志，1998年第11期)人探讨了内皮素1与蛛网膜下腔出血后缺血性脑损害的关系和银杏叶制剂的防治作用，其应用非开颅大鼠模型，对SAH组和GBE组测量基底动脉管径并观察24h内微区脑血流量和颅内血浆ET 1水平动态改变，3天后对海马CA1区行病理检查，结果发现，SAH后rCBF迅速而持续降低，血浆ET 1浓度显著增加，BA痉挛，海马CA1区神经元明显受损。GBE使上述改变均减轻，SAH时ET 1增加是导致缺血性脑损害的重要因素，GBE通过拮抗ET 1病理性增多而减轻缺血性脑损害。

李明华等(浓缩银杏叶口服液治疗支气管哮喘临床观察，李明华等，中国中西医结合杂志，1997年第4期)为探讨浓缩银杏叶口服液的气运抗炎作用，观察了浓缩银杏叶口服液对哮喘患者气道高反应性、临床症状和肺功能的影响。结果发现浓缩银杏叶口服液可以显著地降低哮喘患者的气道高反应性(P＜0.05)、改善临床症状(P＜0.05)和肺功能(P＜0.05)，浓缩银杏叶口服液是一种具有抗炎性质的药物。

由于银杏叶提取物具有独特的药用价值，国内外对银杏叶的化学成分进行了较多的研究。

池静端等人(银杏叶的化学成分研究，池静端等，中国中药杂志，1997年第2期)，从银杏叶的乙酸乙酯部分首次得到一二苯乙烯类化合物，经理化常数测定，其结构为3，3′-二甲氧基-4，4′-二羟基-1，2-二苯乙烯。

马欣等人(高效液相色谱-紫外-电喷雾-质谱法分析银杏叶中黄酮醇苷类化合物，马欣等，沈阳药科大学学报，2003年第4期)，用高效液相色谱-紫外-电喷雾-质谱(HPLC UV ESI MS)法对银杏叶中黄酮醇苷类化合物进行分析，结果得到了样品紫外色谱图、总离子流色谱图及相应色谱峰的电喷雾-质谱(ESI MS)一级和二级质谱图。对谱图进行解析，鉴别出12种黄酮醇苷类化合物。

唐于平等人(银杏叶中的黄酮醇苷类成分，唐于平等，药学学报，2000年第5期)，对银杏叶的化学成分进行了分离、鉴定，其采用各种色谱技术进行分离，用IR、UV、MS、1HNMR、13CNMR和2DNMR光谱技术确定化合物的结构，分得8个黄酮醇苷类成分：槲皮素-3-O-β-D-葡糖苷(1)，山奈酚-3-O-β-D-葡糖苷(2)；芦丁(3)，山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷(4)，异鼠李素-3-O-β-D芸香糖苷(5)，槲皮素-3-O-β-D葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷(6)，山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷(7)，异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷(8)。

楼凤昌等人(银杏萜内酯的分离、纯化和结构鉴定，楼凤昌等，中国天然药物，2004年第1期)，研究银杏叶中的萜内酯类成分，其采用95％乙醇提取，索氏提取分段，硅胶柱层析得到总内酯，再用制备型RP HPLC方法得到纯化合物，用IR、1HNMR、13CNMR，尤其是通过2DNMR光谱技术确定化合物结构，分得6个萜内酯类成分，分别为白果内酯(Ⅰ)、银杏内酯A(Ⅱ)、银杏内酯B(Ⅲ)、银杏内酯C(Ⅳ)、银杏内酯J(Ⅴ)和银杏内酯K(Ⅵ)。其中银杏内酯K在10^-6～10^-5mol/L的终浓度下，可对2×10^-7mol/LPAF刺激的中性粒细胞β葡萄糖酸苷酶的释放有明显的抑制作用。

银杏叶的化学成分较为复杂，经分析测定银杏叶提取物中含有160多种成分，主要成分为二萜内酯和黄酮苷及有机酸等。其中萜类化合物为强效血小板活化因子(PAF)拮抗剂，包括银杏苦内酯A、B、C、M、J、银杏新内酯和白果内酯，均具有二萜或半萜结构。银杏内酯分子具有独特的十二碳骨架结构，嵌有一个叔丁基和6个5元环，包括一个螺(44)壬烷，一个四氢呋喃环和3个内酯环，常见代号BN52020、BN52021、BN52022、BN52023、BN52024，分别代表银杏苦内酯A、B、C、M、J，其中BN52021在银杏中的含量为0.2％，选择性抗PAF的活性最强。银杏叶含35种黄酮类化合物，其中双黄酮6种，黄酮苷元、黄酮苷24种，包括白果黄素、槲皮素、异鼠李素、山柰酚、白果双黄酮、异白果双黄酮等。

银杏叶提取物是具有重大市场潜力的植物提取物，以其为原料制成的各种制剂，广泛应用于药物、保健食品、功能性饮料等，也是近年畅销的中成药品种，在心脑血管用药中处于比较重要的地位。在全球的天然药物中，银杏叶制剂是用量最大的品种之一。银杏叶提取物(Ginkgo Biloba Extract，GBE)被广泛运用于药品、食品补充剂、化妆品等。

世界市场上银杏叶制品的年销售额达50亿美元，已成为植物药制剂的全球冠军品种；我国银杏叶制剂年销售额从2000年的6亿元发展到2004年的17亿元，目前已成为心脑血管系统植物药领先品种。银杏制剂的质量主要取决于银杏黄酮和银杏内酯的含量，国际标准要求银杏制剂中的银杏黄酮的含量大于24％，银杏内酯含量大于6％(Kanows ki，S，et al.Phytomedicine，1997，4(1)：3-13)。

研究结果表明银杏黄酮具有抗氧化、抗癌和对脑心血管的保护作用。

覃仁辉等人(银杏叶中黄酮类化合物的提取及其医药学应用，覃仁辉等，长沙大学学报，2004年第6期)，应用银杏叶提取物及口服药物银可络治疗老年冠心病患者26例，发现治疗后左心室收缩期功能明显改善，银杏叶提取物及其主要有效成分黄酮苷和银杏内脂具有扩张动脉血管、降低血粘度、抑制血小板聚集、拮抗特异性血小板活化因子、改善周围血管循环等作用。

章家胜等人(银杏叶总黄酮对脑、心缺氧的保护作用，章家胜等，中医中药基础医学杂志，1999年第5期)，研究了银杏叶总黄酮对脑、心缺氧的保护作用，银杏叶总黄酮25、50、100mg/kg²显著延长夹闭气管后小鼠心电图时间和断头喘气时间，并呈量效关系，在25-100mg/kg²范围内，银杏叶总黄酮显著降低脑、心组织中MDA和NO含量，结果表明银杏叶总黄酮对脑、心缺氧有显著保护作用，其作用可能与抑制膜脂质过氧化及减少NO有关。

目前，针对银杏叶中的黄酮和内酯类化合物已经研发多种提取分离的方法。

杨荣华等人(银杏叶中有效成分提取最优化生产工艺研究，杨荣华等，中国现代医生，2007年第3期)，基于国内外已有的对银杏叶的提取方法，结合树脂吸附生产工艺的优点，运用乙醇-树脂吸附法，提取银杏叶萜类内酯及其黄酮，研究结果显示乙醇-树脂吸附法运用于银杏叶有成本低、回收率高、有机溶剂残留少等优点。

胡卫兵等人(银杏叶黄酮超临界二氧化碳萃取条件研究，胡卫兵等，湖北民族学院学报(自然科学版)，2004年第2期)，通过正交实验研究，对超临界流体萃取银杏叶黄酮类化合物的工艺进行了优化设计。实验结果表明影响萃取得率的各因素强烈程度的顺序由大到小为：夹带剂浓度、萃取压力、萃取温度；在流量为35kg/h，萃取时间为2h的条件下，最佳萃取实验工艺条件为：萃取压力15MPa，乙醇浓度为90％，萃取温度为55℃，此时，黄酮类化合物萃取得率较理想。

现有技术，包括上述引用文献列举的方法，能够制备出其所期望的目的产物，但是这些方法普遍存在产品纯度低、重现性差、耗时长、技术标准化难、无法大规模生产等缺点。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种银杏叶中总黄酮和总内酯类化合物的高效提取分离制备方法，其中所述提取分离物的主要成分为黄酮及其苷类、银杏二萜内酯类。用高效液相色谱对所述提取分离物进行定量分析检测，结果表明目标成分(黄酮及其苷类、银杏二萜内酯类)的总含量达到30％或以上，甚至40％。

为实现上述发明目的，本发明的银杏叶中总黄酮和总内酯的高效提取分离方法主要包括以下步骤：提取、醇沉、水沉、大孔树脂分离和硅胶基质键合材料分离。

1)提取

所述提取包括：称取银杏叶，加入占银杏叶重量8-12倍、体积浓度为10％-50％低碳醇，在20℃-50℃下浸泡提取2-5次，每次1-5天，将提取液合并，并将提取液浓缩得到相对密度为1.15-1.25的浸膏。

所述银杏叶优选含水量为1％-10％的银杏叶。

所述低碳醇的加入量优选占银杏叶重量9-11倍，更优选9-10倍。

所述低碳醇的体积浓度优选为20％-45％，更优选30％-40％。

所述浸泡温度优选为30℃-50℃，更优选30℃-40℃。

所述提取次数优选2-4次，更优选3-4次。

所述每次浸泡时间优选1-4天，更优选2-4天。

所述低碳醇优选甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或其混合物，更优选甲醇和乙醇，进一步优选乙醇。

2)醇沉

所述醇沉包括：在步骤1)获得的浸膏中加入低碳醇，使低碳醇体积浓度达到50-70％，并充分搅拌，0-4℃冷藏静置12-48小时，随后分离除去固体、胶体等，将获得的液体浓缩至相对密度为1.10-1.25的浸膏；再加入低碳醇使低碳醇体积浓度达到70％-90％，并充分搅拌，0-4℃冷藏静置12-48小时后再次分离除去固体、胶体等，将获得的液体浓缩挥发除去低碳醇，浓缩得到相对密度为1.15-1.25的浸膏。

所述分离除去固体、胶体等操作优选采用过滤操作。

所述冷藏静置时间优选15-36小时，更优选24-36小时。

所述低碳醇优选甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或其混合物，更优选甲醇和乙醇，进一步优选乙醇。

3)水沉

所述水沉包括：将醇沉后的浸膏按照1∶5-1∶10的体积比加入水，充分搅拌，0-4℃冷藏静置24-240小时，随后分离除去固体、胶体等，将获得的液体中的固体物质去除后，滤液浓缩至相对密度为1.10-1.20的浸膏。

所述体积比优选1∶6-1∶9，更优选1∶7-1∶8。

所述冷藏静置时间优选36-192小时，更优选72-120小时。

所述分离除去固体、胶体等操作优选采用过滤操作。

将获得的液体中的固体物质去除优选采用离心分离，所述离心分离优选采用离心机离心分离，所述离心机优选10000-25000转/分钟的高速离心机。

本领域的技术人员应该知悉，所述离心分离也可以使用过滤后进行微滤的技术替代，只要其能够去除水沉下来的固体物质就可。

4)大孔树脂分离

所述大孔树脂分离包括：将水沉完的浸膏上样于非极性大孔树脂柱，上样量与分离材料体积比为1∶5-1∶50，分别采用水、体积浓度10-30％的低碳醇、体积浓度30-60％低碳醇和60-90％低碳醇洗脱，每次洗脱的体积为3-6个柱体积，流速为1-3个柱体积/小时；收集10-30％低碳醇和60-90％低碳醇洗脱组分，合并洗脱液并浓缩至相对密度为1.10-1.20的浸膏。

所述上样量与分离材料体积比优选为1∶10-1∶40，更优选1∶15-1∶30。

所述低碳醇优选甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或其混合物，更优选甲醇和乙醇，进一步优选乙醇。

5)硅胶基质键合材料分离

所述硅胶基质键合材料分离包括：以粒径10-100微米的硅胶基质键合材料为填料，以不同体积浓度的低碳醇水溶液作为洗脱液，低碳醇的体积浓度从10-70％变化，收集目标洗脱组分，干燥处理即为银杏叶中总黄酮和总内酯类化合物。

所述硅胶基质键合材料的粒径优选40-100微米，更优选40-70微米。

所述低碳醇优选甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或其混合物，更优选甲醇和乙醇，进一步优选甲醇。

本发明采用特定的单元操作组合：提取、醇沉、水沉、大孔树脂分离和硅胶基质键合材料分离，以及采用大孔树脂和硅胶基质键合材料作为特定的分离介质，获得了银杏叶中的总黄酮和总内酯类化合物。用高效液相色谱对所述银杏叶中的总黄酮和总内酯类化合物进行定量分析检测，结果表明目标成分(黄酮及其苷类、银杏二萜内酯类)的总含量达到30％或以上，甚至40％。这远远高于现有技术的含量水平。

同时，本发明采用特定的单元操作组合：提取、醇沉、水沉、大孔树脂分离和硅胶基质键合材料分离，其能够大规模工业化使用，远远摆脱了现有技术中的低产量、实验室规模生产。

本发明所公开的上述方法均能够制备获得银杏叶中总黄酮和总内酯，但基于提高制备效率优化操作等目的，本发明优选的技术方案为：

一种银杏叶中总黄酮和总内酯的提取分离制备方法，所述方法包括：

1)提取：称取含水量为1％-10％的银杏叶，加入其重量8-12倍、浓度为10％-50％乙醇，20-50℃浸泡提取2-5次，每次1-5天，合并提取液，将提取液浓缩得到相对密度为1.15-1.25的浸膏；

2)醇沉：将浸膏中加入乙醇使乙醇体积浓度达到50-70％，并充分搅拌，0-4℃冷藏静置12-36小时，过滤，将滤液浓缩至相对密度为1.10-1.25的浸膏；再加入乙醇使乙醇体积浓度达到70-90％，并充分搅拌，0-4℃冷藏静置12-48小时过滤，将滤液浓缩挥发除去乙醇，浓缩得到相对密度为1.15-1.25的浸膏；

3)水沉：将醇沉完的浸膏按照1∶5-1∶10的体积比加入水，充分搅拌，0-4℃冷藏静置24-240小时，过滤，样品溶液经过10000-25000转/分钟的高速离心机离心，样品浓缩至相对密度为1.10-1.20的浸膏；

4)大孔树脂分离：将水沉完的浸膏上样于非极性大孔树脂柱，上样量与分离材料体积比为1∶5-1∶50，分别采用水、体积浓度10-30％乙醇、体积浓度30-60％乙醇和60-90％乙醇洗脱，每次洗脱的体积为3-6个柱体积，流速为1-3个柱体积/小时；收集10-30％乙醇和60-90％乙醇洗脱组分，合并洗脱液并浓缩至相对密度为1.10-1.20的浸膏；

5)硅胶基质键合材料分离：以粒径10-100微米的硅胶基质键合材料为填料，以不同体积浓度的甲醇水溶液作为洗脱液，对大孔树脂分离得到的浸膏进行洗涤，甲醇的体积浓度从10-70％变化，收集目标洗脱组分，干燥处理即为银杏叶中的总黄酮和总内酯类化合物。

本发明银杏叶中总黄酮和总内酯的提取分离制备方法的提取、醇沉和大孔树脂分离步骤中所用的低碳醇，可以是物理-化学性质相近的甲醇、乙醇、丙醇、丁醇及其混合物，但本发明优选采用乙醇。采用乙醇的有益技术效果是，能有效提高有效成分提取效率，而且杂质的提取率会大幅降低，给后续的分离制备减轻麻烦。

所属技术领域的技术人员应该知悉，本发明的工艺方法不仅仅限于从银杏叶中提取分离制备总黄酮和总内酯，其还可以应用于其他用途，比如用于银杏的果实，用于提取分离制备总黄酮和总内酯，以及用于其他植物的叶子、果实和根茎等，制备其他有效成分。

本发明所公开的制备方法具有如下优点：

1.主要成分的含量高。由于本发明针对目标化合物的结构特点，设计了系统的提取分离制备工艺流程，并使用了大孔树脂和新型硅胶基键合材料，通过工艺的整体系统性和高效新型分离材料的选择性，可以保证主要成分的含量达到30％以上。

2.重现性好。本发明利用提取分离工艺的标准化，特别是大孔树脂柱层析分离的标准化，以及新型硅胶基质键合材料化学性能的稳定性，可以保证分离制备的重现性和稳定性。

3.周期短。本发明从原药材的粉碎提取到制备得到目标组分的产品，只需要10天的时间。

4.有机残留低。由于本发明摒弃了传统工艺中溶剂萃取、硅胶柱层析等工艺，采用了有机溶剂使用量较少的大孔树脂分离和新型分离材料，而且最终产品采用干燥处理，所以最终产品的有机溶剂残留特别小。

5.能够实现大规模工业生产。本发明所采用工艺非常容易实现标准化，自动化，适于进行产业化大规模生产。

具体实施方式

下面结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例1：

将含水量为6％的银杏叶原药材粉碎，定量称取10千克，置于200升提取罐加入重量100千克40％乙醇溶液，30℃浸泡提取3次，每次2天，合并提取液，将提取液浓缩得到相对密度为1.21的浸膏3.6L。

将浸膏中加入乙醇使乙醇体积浓度达到60％，并搅拌30分钟，4℃冷藏静置24小时，过滤，将滤液浓缩至相对密度为1.15的浸膏；再加入乙醇使乙醇体积浓度达到80％，并充分搅拌30分钟，4℃冷藏静置48小时过滤，将滤液浓缩挥发除去乙醇，浓缩得到相对密度为1.17的浸膏2.8L。

将醇沉完的浸膏中按照1∶6的体积比加入水16.8L，充分搅拌30分钟，4℃冷藏静置72小时，过滤，样品溶液经过20000转/分钟的高速离心机离心，样品浓缩至相对密度为1.07的浸膏2.5L。

将水沉完的浸膏上样于XAD-4型非极性大孔树脂柱，大孔树脂分离材料体积为25L，分别采用150L水、120L体积浓度20％乙醇、90L体积浓度50％乙醇和90L 80％乙醇洗脱，流速为2个柱体积/小时；收集20％乙醇和80％乙醇洗脱组分，合并洗脱液并浓缩至相对密度为1.10的浸膏1.1L；

称取粒径40微米的新型硅胶基质键合材料3千克，装柱，柱径100mm，柱长380mm，分别用10L15％甲醇水溶液、16L55％甲醇水溶液洗脱，收集55％洗脱组分，加热浓缩，真空干燥处理即为银杏叶中总黄酮和总内酯类化合物，共计142克，通过高效液相分析检测，总黄酮及其苷类含量为25.5％，银杏内酯类含量为6.7％。

实施例2：

将含水量为2％的银杏叶原药材粉碎，定量称取2千克，置于50升提取罐加入重量18千克20％乙醇溶液，45℃浸泡提取5次，每次1天，合并提取液，将提取液浓缩得到相对密度为1.15的浸膏1.1L。

将浸膏中加入乙醇使乙醇体积浓度达到50％，并搅拌30分钟，4℃冷藏静置36小时，过滤，将滤液浓缩至相对密度为1.12的浸膏；再加入乙醇使乙醇体积浓度达到85％，并充分搅拌30分钟，4℃冷藏静置24小时过滤，将滤液浓缩挥发除去乙醇，浓缩得到相对密度为1.24的浸膏0.7L。

将醇沉完的浸膏中按照1∶10的体积比加入水7L，充分搅拌30分钟，4℃冷藏静置240小时，过滤，样品溶液经过25000转/分钟的高速离心机离心，样品浓缩至相对密度为1.09的浸膏0.35L。

将水沉完的浸膏上样于XAD-1600型非极性大孔树脂柱，大孔树脂分离材料体积为15L，分别采用60L水、50L体积浓度30％乙醇、60L体积浓度40％乙醇和80L 75％乙醇洗脱，流速为1.6个柱体积/小时；收集30％乙醇和75％乙醇洗脱组分，合并洗脱液并浓缩至相对密度为1.08的浸膏0.23L；

称取粒径70微米的新型硅胶基质键合材料0.7千克，装柱，柱径70mm，柱长210mm，分别用3.5L12％甲醇水溶液、4L50％甲醇水溶液洗脱，收集50％洗脱组分，加热浓缩，真空干燥处理即为银杏叶中总黄酮和总内酯类化合物，共计29克，通过高效液相分析检测，总黄酮及其苷类含量为26.2％，银杏内酯类含量为6.6％。

实施例3：

将含水量为9％的银杏叶原药材粉碎，定量称取25千克，置于500升提取罐加入重量300千克50％乙醇溶液，50℃浸泡提取2次，每次5天，合并提取液，将提取液浓缩得到相对密度为1.23的浸膏7.9L。

将浸膏中加入乙醇使乙醇体积浓度达到70％，并搅拌30分钟，4℃冷藏静置15小时，过滤，将滤液浓缩至相对密度为1.14的浸膏；再加入乙醇使乙醇体积浓度达到85％，并充分搅拌30分钟，4℃冷藏静置40小时过滤，将滤液浓缩挥发除去乙醇，浓缩得到相对密度为1.19的浸膏4.6L。

将醇沉完的浸膏中按照1∶8的体积比加入水36.8L，充分搅拌30分钟，4℃冷藏静置120小时，过滤，样品溶液经过20000转/分钟的高速离心机离心，样品浓缩至相对密度为1.06的浸膏7.4L。

将水沉完的浸膏上样于X-5型非极性大孔树脂柱，大孔树脂分离材料体积为200L，分别采用1000L水、700L体积浓度25％乙醇、1100L体积浓度40％乙醇和600L 90％乙醇洗脱，流速为2个柱体积/小时；收集25％乙醇和90％乙醇洗脱组分，合并洗脱液并浓缩至相对密度为1.12的浸膏3.3L；

称取粒径100微米的新型硅胶基质键合材料9千克，装柱，柱径200mm，柱长295mm，分别用30L16％甲醇水溶液、20L60％甲醇水溶液洗脱，收集60％洗脱组分，加热浓缩，真空干燥处理即为银杏叶中总黄酮和总内酯类化合物，共计339克，通过高效液相分析检测，总黄酮及其苷类含量为25.8％，银杏内酯类含量为7.0％。

实施例4：

将含水量为8％的银杏叶原药材粉碎，定量称取5千克，置于100升提取罐加入重量60千克30％乙醇溶液，30℃浸泡提取4次，每次5天，合并提取液，将提取液浓缩得到相对密度为1.17的浸膏2.3L。

将浸膏中加入乙醇使乙醇体积浓度达到60％，并搅拌30分钟，4℃冷藏静置48小时，过滤，将滤液浓缩至相对密度为1.18的浸膏；再加入乙醇使乙醇体积浓度达到80％，并充分搅拌30分钟，4℃冷藏静置24小时过滤，将滤液浓缩挥发除去乙醇，浓缩得到相对密度为1.16的浸膏1.51L。

将醇沉完的浸膏中按照1∶9的体积比加入水13.6L，充分搅拌30分钟，4℃冷藏静置72小时，过滤，样品溶液经过15000转/分钟的高速离心机离心，样品浓缩至相对密度为1.09的浸膏1.4L。

将水沉完的浸膏上样于HP-20型非极性大孔树脂柱，大孔树脂分离材料体积为50L，分别采用300L水、250L体积浓度15％乙醇、200L体积浓度55％乙醇和250L 75％乙醇洗脱，流速为1个柱体积/小时；收集15％乙醇和75％乙醇洗脱组分，合并洗脱液并浓缩至相对密度为1.11的浸膏0.57L；

称取粒径100微米的新型硅胶基质键合材料1.6千克，装柱，柱径100mm，柱长205mm，分别用6L14％甲醇水溶液、10L56％甲醇水溶液洗脱，收集56％洗脱组分，加热浓缩，真空干燥处理即为银杏叶中总黄酮和总内酯类化合物，共计69克，通过高效液相分析检测，总黄酮及其苷类含量为25.8％，银杏内酯类含量为6.8％。

实施例5：

银杏叶的含水量为3％，投料量和制备过程与实施例1相同，最终制备总黄酮和总内酯类化合物，共计146克，通过高效液相分析检测，总黄酮及其苷类含量为25.4％，银杏内酯类含量为6.5％。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (7)

1.一种银杏叶中总黄酮和总内酯的提取分离方法，其特征在于，所述方法主要包括以下步骤：

1)提取

所述提取包括：称取银杏叶，加入占银杏叶重量8-12倍、体积浓度为10％-50％低碳醇，在20℃-50℃下浸泡提取2-5次，每次1-5天，将提取液合并，并将提取液浓缩得到相对密度为1.15-1.25的浸膏；

2)醇沉

所述醇沉包括：在步骤1)获得的浸膏中加入低碳醇，使低碳醇体积浓度达到50-70％，并充分搅拌，0-4℃冷藏静置12-48小时，随后分离除去固体、胶体等，将获得的液体浓缩至相对密度为1.10-1.25的浸膏；再加入低碳醇使低碳醇体积浓度达到70％-90％，并充分搅拌，0-4℃冷藏静置12-48小时后再次分离除去固体、胶体等，将获得的液体浓缩挥发除去低碳醇，浓缩得到相对密度为1.15-1.25的浸膏；

3)水沉

所述水沉包括：将醇沉后的浸膏按照1∶5-1∶10的体积比加入水，充分搅拌，0-4℃冷藏静置24-240小时，随后分离除去固体、胶体等，将获得的液体中的固体物质去除后，滤液浓缩至相对密度为1.10-1.20的浸膏；

4)大孔树脂分离

所述大孔树脂分离包括：将水沉完的浸膏上样于非极性大孔树脂柱，上样量与分离材料体积比为1∶5-1∶50，分别采用水、体积浓度10-30％的低碳醇、体积浓度30-60％低碳醇和60-90％低碳醇洗脱，每次洗脱的体积为3-6个柱体积，流速为1-3个柱体积/小时；收集10-30％低碳醇和60-90％低碳醇洗脱组分，合并洗脱液并浓缩至相对密度为1.10-1.20的浸膏；

5)硅胶基质键合材料分离

所述硅胶基质键合材料分离包括：以粒径10-100微米的硅胶基质键合材料为填料，以不同体积浓度的低碳醇水溶液作为洗脱液，低碳醇的体积浓度从10-70％变化，收集目标洗脱组分，干燥处理即为银杏叶中总黄酮和总内酯类化合物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，

所述银杏叶优选含水量为1％-10％的银杏叶；

所述乙醇的加入量优选占银杏叶重量9-11倍，更优选9-10倍；

所述乙醇的体积浓度优选为20％-45％，更优选30％-40％；

所述浸泡温度优选为30℃-50℃，更优选30℃-40℃；

所述提取次数优选2-4次，更优选3-4次；

所述每次浸泡时间优选1-4天，更优选2-4天；

所述低碳醇优选甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或其混合物，更优选甲醇和乙醇，进一步优选乙醇。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤2)中，

所述分离除去固体、胶体等操作优选采用过滤操作；

所述冷藏静置时间优选15-36小时，更优选24-36小时；

所述低碳醇优选甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或其混合物，更优选甲醇和乙醇，进一步优选乙醇。

4.如权利要求1-3之一所述的方法，其特征在于，步骤3)中，

所述体积比优选1∶6-1∶9，更优选1∶7-1∶8；

所述冷藏静置时间优选36-192小时，更优选72-120小时；

所述分离除去固体、胶体等操作优选采用过滤操作；

所述将获得的液体中的固体物质去除优选采用离心分离，所述离心分离优选采用离心机离心分离，所述离心机优选10000-25000转/分钟的高速离心机；

或所述将获得的液体中的固体物质去除采用过滤后进行微滤。

5.如权利要求1-4之一所述的方法，其特征在于，步骤4)中，

所述上样量与分离材料体积比优选为1∶10-1∶40，更优选1∶15-1∶30；

所述低碳醇优选甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或其混合物，更优选甲醇和乙醇，进一步优选乙醇。

6.如权利要求1-5之一所述的方法，其特征在于，步骤5)中，

所述硅胶基质键合材料的粒径优选40-100微米，更优选40-70微米；

所述低碳醇优选甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或其混合物，更优选甲醇和乙醇，进一步优选甲醇。

7.一种银杏叶中总黄酮和总内酯的提取分离制备方法，所述方法包括：

1)提取：称取含水量为1％-10％的银杏叶，加入其重量8-12倍、浓度为10％-50％乙醇，20-50℃浸泡提取2-5次，每次1-5天，合并提取液，将提取液浓缩得到相对密度为1.15-1.25的浸膏；

2)醇沉：将浸膏中加入乙醇使乙醇体积浓度达到50-70％，并充分搅拌，0-4℃冷藏静置12-36小时，过滤，将滤液浓缩至相对密度为1.10-1.25的浸膏；再加入乙醇使乙醇体积浓度达到70-90％，并充分搅拌，0-4℃冷藏静置12-48小时过滤，将滤液浓缩挥发除去乙醇，浓缩得到相对密度为1.15-1.25的浸膏；

3)水沉：将醇沉完的浸膏中按照1∶5-1∶10的体积比加入水，充分搅拌，0-4℃冷藏静置24-240小时，过滤，样品溶液经过10000-25000转/分钟的高速离心机离心，样品浓缩至相对密度为1.10-1.20的浸膏；

4)大孔树脂分离：将水沉完的浸膏上样于非极性大孔树脂柱，上样量与分离材料体积比为1∶5-1∶50，分别采用水、体积浓度10-30％乙醇、体积浓度30-60％乙醇和60-90％乙醇洗脱，每次洗脱的体积为3-6个柱体积，流速为1-3个柱体积/小时；收集10-30％乙醇和60-90％乙醇洗脱组分，合并洗脱液并浓缩至相对密度为1.10-1.20的浸膏；

5)硅胶基质键合材料分离：以粒径10-100微米的硅胶基质键合材料为填料，以不同体积浓度的甲醇水溶液作为洗脱液，对大孔树脂分离得到的浸膏进行洗涤，甲醇的体积浓度从10-70％变化，收集目标洗脱组分，干燥处理即为银杏叶中的总黄酮和总内酯类化合物。