CN101348817A - 一种酶解提取山茱萸多糖的方法 - Google Patents

一种酶解提取山茱萸多糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种酶解提取山茱萸多糖的方法，所述方法包括：取山茱萸干燥果肉粉碎制得山茱萸干粉，加入质量为山茱萸干粉质量15～60倍的蒸馏水，加入酶于35～60℃、pH3.5～7.0下酶解0.5h～4h，酶解结束后灭酶，提取液分离纯化得到山茱萸多糖提取物；所述酶为下列之一或其中两种以上的混合物：①纤维素酶、②木瓜蛋白酶、③果胶酶、④淀粉水解酶，酶质量用量为山茱萸干粉质量的0.1～24％。本发明方法相对于传统的热水浸提法可使山茱萸多糖提取率提高10～50％，并可使山茱萸多糖含量提高15～80％。由于避免了传统的热水浸提或酸、碱提取对多糖结构的影响，采用酶解处理提取山茱萸多糖具有条件温和、易除去杂质、最大限度地保持多糖活性等优点。

Description

一种酶解提取山茱萸多糖的方法
(一)技术领域
本发明涉及一种酶解提取山茱萸多糖的方法。
(二)背景技术
中药山茱萸为山茱萸科植物山茱萸(Cornus officinalis Sieb et Zu cc)的干燥果肉，其味酸、涩、微温，归肝肾经，有补益肝肾、涩精固脱的功效，是我国传统名贵的中药材。中医药临床研究证明山茱萸是治疗糖尿病、冠心病和高血压病的主要药材。
目前国内外对山茱萸的研究主要集中在化学成分及药理作用方面，其主要成分为环烯醚萜苷类、五环三萜酸及其酯类、鞣质类、挥发油类及多糖类等，具有免疫调节、降低血糖、抗休克、抗心律失常、抗菌、抗炎、抗衰老、抗癌、抗艾滋病和治疗不育症等药理活性。
多糖类物质是生命代谢不可缺少的重要物质，具有多种生物活性而成为当今生物医药研究和开发的一大热点。传统的山茱萸多糖提取方法主要是采用热水浸提法、酸浸提法、碱浸提法提取。热水浸提法时间长、耗能高、杂质含量高、收率低；酸或碱浸提法虽能提高提取率，但极易破坏多糖的结构。另外，酸、碱浸提对设备有一定的影响，且需经中和反应，操作程序较为繁琐，难以在工业化生产中得以广泛应用。
现有中国专利CN1511539“山茱萸提取物及其制备方法和用途”中提及了一种山茱萸提取物及其制备方法和用途，该提取物中含有莫诺苷25～50％、马钱素25～40％。目前还未有采用酶法处理提取山茱萸多糖的报道。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种酶解提取山茱萸多糖的方法，该方法可提高山茱萸多糖的提取率及其多糖含量。由于避免了传统的热水浸提或酸、碱提取对多糖结构的影响，可最大限度地保持多糖的活性。
本发明采用的技术方案是：
一种酶解提取山茱萸多糖的方法，所述方法包括：取山茱萸干燥果肉粉碎制得山茱萸干粉，加入质量为山茱萸干粉质量15～60倍的蒸馏水，加入酶于35～60℃、pH3.5～7.0下酶解0.5h～4h，酶解结束后灭酶，提取液分离纯化得到山茱萸多糖提取物；所述酶为下列之一或其中两种以上的混合物：①纤维素酶、②木瓜蛋白酶、③果胶酶、④淀粉水解酶，酶质量用量为山茱萸干粉质量的0.1～24％。所用酶均采用市购商品酶，通常的，纤维素酶酶活为10000U/g～30000U/g，木瓜蛋白酶酶活为600000U/g～800000U/g，果胶酶酶活为20000U/g～40000U/g，淀粉水解酶酶活为1500U/g～3000U/g。
所述分离纯化方法可按照常规方法进行，本发明中所述提取液的分离纯化方法可如下：提取液离心取上清液，浓缩至体积为上清液体积的1/2～1/6得到浓缩液，加入体积为浓缩液体积2～5倍的70％～100％(v/v)乙醇，静置3h～15h，离心、冷冻干燥，得到山茱萸多糖。
通常的，所述山茱萸干燥果肉粉碎至30～150目。
优选的，所用酶为果胶酶和木瓜蛋白酶组成的复合酶，果胶酶质量用量为山茱萸干粉质量的4％、木瓜蛋白酶质量用量为山茱萸干粉质量的3.5％。
优选的，所用酶为果胶酶、纤维素酶和淀粉酶组成的复合酶，果胶酶质量用量为山茱萸干粉质量的3％、纤维素酶质量用量为山茱萸干粉质量的3％、淀粉酶质量用量为山茱萸干粉质量的3％。
具体所述方法如下：取山茱萸干燥果肉，粉碎至60～150目得山茱萸干粉，加入质量为山茱萸干粉质量30～50倍的蒸馏水，加入质量为山茱萸干粉质量的4％的果胶酶和质量为山茱萸干粉质量的3.5％的木瓜蛋白酶，于45～55℃、pH5.0～7.0下酶解0.5h～2.0h，酶解结束后升温至80～100℃灭酶0.5h～2.0h，提取液离心取上清液，浓缩至体积为上清液体积的1/2～1/6得到浓缩液，加入体积为浓缩液体积2～5倍的70％～100％乙醇，静置6h～15h，离心(3000～6000r/min，10min～30min)、冷冻干燥，得到山茱萸多糖提取物。
本发明方法相对于传统的热水浸提法可使山茱萸多糖提取率提高10～50％，并可使山茱萸多糖含量提高15～80％。由于避免了传统的热水浸提或酸、碱提取对多糖结构的影响，采用酶解处理提取山茱萸多糖具有条件温和、易除去杂质、最大限度地保持多糖活性等优点。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
(1)干燥粉碎：取烘干的山茱萸干燥果肉，研磨粉碎成30目的山茱萸干粉。
(2)酶处理：取10.0g山茱萸干粉，加入蒸馏水150g混合，加入木瓜蛋白酶(酶活800000U/g，广西南宁庞博生物工程有限公司)0.6g，用1.0mol/LNaOH和1.0mol/L HCl调节溶液的pH值为6.0。在温度为45℃下酶解提取1.5h。
(3)高温灭酶：酶解完成后升温至100℃灭酶0.5h。
(4)醇沉：提取液离心后上清液浓缩至原体积的1/6，向浓缩液中加入2倍体积的100％乙醇，搅拌均匀后静止12h后离心，沉淀物经冷冻干燥后得到山茱萸多糖0.785g，山茱萸多糖含量为48.6％。
实施例2：
(1)干燥粉碎：取烘干的山茱萸干燥果肉，研磨粉碎成30目的山茱萸干粉。
(2)酶处理：取10.0g山茱萸干粉，加入蒸馏水150g混合，再加入果胶酶(酶活20000U/g，天津市利华酶制剂厂)0.6g、木瓜蛋白酶(酶活800000U/g，广西南宁庞博生物工程有限公司)0.6g，用1.0mol/L NaOH和1.0mol/LHCl调节溶液的pH值为5.0。在温度为35℃下酶解提取2.0h。
(3)高温灭酶：酶解完成后升温至100℃灭酶0.5h。
(4)醇沉：提取液离心后上清液浓缩至原体积的1/2，向浓缩液中加入5倍体积的70％乙醇，搅拌均匀后静止12h后离心，沉淀物经冷冻干燥后得到山茱萸多糖0.798g，山茱萸多糖含量为51.3％。
实施例3：
(1)干燥粉碎：取烘干的山茱萸干燥果肉，研磨粉碎成100目的山茱萸干粉。
(2)酶处理：取10.0g山茱萸干粉，加入蒸馏水300g混合，再加入果胶酶(酶活20000U/g，天津市利华酶制剂厂)0.3g、木瓜蛋白酶(酶活800000U/g，广西南宁庞博生物工程有限公司)0.3g、纤维素酶(酶活15000U/g，无锡市雪梅酶制剂科技有限公司)0.3g、淀粉水解酶(酶活2000U/g，北京东华强盛生物技术有限公司)0.3g，用1.0mol/LNaOH和1.0mol/LHCl调节溶液的pH值为7.0。在温度为60℃下酶解提取0.5h。
(3)高温灭酶：酶解完成后升温至90℃灭酶1.5h。
(4)醇沉：提取液离心后上清液浓缩至原体积的1/4，向浓缩液中加入4倍体积的90％乙醇，搅拌均匀后静止12h后离心，沉淀物经冷冻干燥后得到山茱萸多糖0.766g，山茱萸多糖含量为59.6％。
实施例4：
(1)干燥粉碎：取烘干的山茱萸干燥果肉，研磨粉碎成150目的山茱萸干粉。
(2)酶处理：取10.0g山茱萸干粉，将山茱萸干粉和600g蒸馏水混合，再加入纤维素酶(酶活15000U/g，无锡市雪梅酶制剂科技有限公司)0.6g、淀粉水解酶(酶活2000U/g，北京东华强盛生物技术有限公司)0.6g，用1.0mol/L NaOH和1.0mol/L HCl调节溶液的pH值为3.5。在温度为45℃下酶解提取4.0h。
(3)高温灭酶：酶解完成后升温至80℃灭酶1.0h。
(4)醇沉：提取液离心后上清液浓缩至原体积的1/6，向浓缩液中加入3倍体积的95％乙醇，搅拌均匀后静止12h后离心，沉淀物经冷冻干燥后得到山茱萸多糖0.813g，山茱萸多糖含量为47.7％。
实施例5：
取粉碎至60目的山茱萸药材粉末100.00克放入提取罐内，加入4000ml蒸馏水，并加入木瓜蛋白酶(酶活800000U/g，广西南宁庞博生物工程有限公司)1.5g、纤维素酶(酶活15000U/g，无锡市雪梅酶制剂科技有限公司)4.0g组成的复合酶，用1.0mol/L NaOH和1.0mol/L HCl调节pH值为7.0，在酶解温度为40℃下进行酶解1.0h。酶解完成后迅速升温至80℃，保持1.0h，提取液离心后上清液浓缩至原体积的1/2，向浓缩液中加入4倍体积的80％乙醇，静置15h后，在转速为3000r/min下离心30min，沉淀物经冷冻干燥后得到山茱萸多糖0.903g，山茱萸多糖含量为42.3％。
实施例6：
取粉碎至100目的山茱萸药材粉末100.00克放入提取罐内，加入3000ml蒸馏水，并加入果胶酶(酶活20000U/g，天津市利华酶制剂厂)1g，木瓜蛋白酶(酶活800000U/g，广西南宁庞博生物工程有限公司)1.5g、纤维素酶(酶活15000U/g，无锡市雪梅酶制剂科技有限公司)0.5g组成的复合酶，用1.0mol/L NaOH和1.0mol/L HCl调节溶液的pH值为6.5，在温度为45℃下进行酶解0.5h。酶解完成后迅速升温至100℃，保持0.5h，提取液离心后上清液浓缩至原体积的1/6，向浓缩液中加入3倍体积的75％乙醇，静置15h后，在转速为6000r/min下离心10min，沉淀物经冷冻干燥后得到山茱萸活性多糖0.931g，山茱萸多糖含量为39.1％。
实施例7：
取粉碎至150目的山茱萸药材粉末100.00克放入提取罐内，加入5000ml蒸馏水，并加入果胶酶(酶活20000U/g，天津市利华酶制剂厂)4g，木瓜蛋白酶(酶活800000U/g，广西南宁庞博生物工程有限公司)1.0g组成的复合酶，，用1.0mol/L NaOH和1.0mol/L HCl调节溶液的pH值为5.0，在温度为55℃下进行酶解2.0h。酶解完成后迅速升温至90℃，保持2.0h，提取液离心后上清液浓缩至原体积的1/3，向浓缩液中加入3倍体积的90％乙醇，静置6h后，在转速为5000r/min下离心15min，沉淀物经冷冻干燥后得到山茱萸活性多糖1.053g，山茱萸多糖含量为37.5％。

Claims (6)

1.一种酶解提取山茱萸多糖的方法，所述方法包括：取山茱萸干燥果肉粉碎制得的山茱萸干粉，加入质量为山茱萸干粉质量15～60倍的蒸馏水，加入酶于35～60℃、pH3.5～7.0下酶解0.5h～4h，酶解结束后灭酶，提取液分离纯化得到山茱萸多糖提取物；所述酶为下列之一或其中两种以上的混合物：①纤维素酶、②木瓜蛋白酶、③果胶酶、④淀粉水解酶，酶质量用量为山茱萸干粉质量的0.1～24％。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述分离纯化方法如下：提取液离心取上清液，浓缩至体积为上清液体积的1/2～1/6得到浓缩液，加入体积为浓缩液体积2～5倍的70％～100％乙醇，静置3h～15h，离心、冷冻干燥，得到山茱萸多糖提取物。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述山茱萸干燥果肉粉碎至30～150目。
4.如权利要求1～3之一所述的方法，其特征在于所用酶为果胶酶和木瓜蛋白酶组成的复合酶，果胶酶质量用量为山茱萸干粉质量的4.0％、蛋白酶质量用量为山茱萸干粉质量的3.5％。
5.如权利要求1～3之一所述的方法，其特征在于所用酶为果胶酶、纤维素酶和淀粉水解酶组成的复合酶，果胶酶质量用量为山茱萸干粉质量的3％、纤维素酶质量用量为山茱萸干粉质量的3％、淀粉酶质量用量为山茱萸干粉质量的3％。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下：取山茱萸干燥果肉，粉碎至60～150目得山茱萸干粉，加入质量为山茱萸干粉质量30～50倍的蒸馏水，加入质量为山茱萸干粉质量的3％的果胶酶、质量为山茱萸干粉质量的3％的纤维素酶和质量为山茱萸干粉质量的3％的木瓜蛋白酶，于45～55℃、pH5.0～7.0下酶解0.5h～2.0h，酶解结束后升温至80～100℃灭酶0.5h～2.0h，提取液离心取上清液，浓缩至体积为上清液体积的1/2～1/6得到浓缩液，加入体积为浓缩液体积3～5倍的95％乙醇，静置6h～15h，离心、冷冻干燥，得到山茱萸多糖。
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