CN101486745A - 一种富含黄酮类活性成分的木豆叶提取物的诱导提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中草药木豆叶活性成分的提取技术，目的在于提供一种经济快速的获得富含牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素、芹菜素和异鼠李素五种黄酮类活性成分的木豆叶提取物的高效酶诱导提取方法。本发明针对传统提取方法提取时间长、提取温度高、提取率低等缺点，采用匀浆破碎酶解、恒温酶解、负压空化提取、溶剂除杂和富集等技术，获得富含五种黄酮类活性成分的木豆叶提取物，结果表明：提取物中五种黄酮类活性成分的含量分别可达0.223～0.296、0.145～0.187、0.194～0.264、0.108～0.150、0.074～0.102mg/g，比传统热回流方法提高了9～65％。该方法提取率高，无需高温加热，设备简单，操作安全，适于产业化生产，为中药提取现代化提供了一种新的方法和手段。

Description

一种富含黄酮类活性成分的木豆叶提取物的诱导提取方法

技术领域

本发明涉及一种高效诱导提高中草药中有效成分的含量、并对其进行高效提取的方法，即获得木豆叶中富含牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素、芹菜素和异鼠李素提取物的酶诱导-负压空化提取方法。

背景技术

木豆[Cajanus cajan(L.)Millsp.]，英文常用名为pigeonpea，为豆科木豆属一年生或多年生热带或亚热带木本植物，常绿灌木。又名鸽子豆、豆蓉树、树豆等，是一种民间用药。木豆叶具有抗菌消炎，解毒消肿，活血化瘀，止血止痛，补肾健骨，祛腐生肌，抗感染的功效，可用于治疗瘀血肿痛、股骨头缺血性坏死、骨质疏松症。外治小儿水痘，痈肿、褥疮及外伤、烧伤等各种感染创面(钟小荣，2001)。此外，在印度、巴西、古巴、墨西哥、南非等国木豆提取物制剂用于治疗感冒、支气管炎、麻疹、痢疾、肝炎、皮肤病、烧伤、溃疡、肿瘤等疾病(AbbiwD.K.，1990；Duke J.A.et al，1994；Milliken W.，1997；Grover J.K.，2002)，疗效显著。

在木豆叶中，黄酮类化合物是含量较高的组分，其中牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素、芹菜素和异鼠李素有较好的药理作用，可抗氧化、抗肿瘤、抗菌、消炎镇定、解痉、祛痰、止咳、抗胃溃疡、利尿利胆，还有降血压、降血脂和胆固醇的作用，对预防动脉硬化和血栓症有一定作用(孙斌等，2004；张伟敏等，2005；Prabhakar M.C.et al，1981；Agnese A.M.et al，2001；Picerno P.et al，2003；BramatiL.et al，2003；Hien T.V.et al，2002；Wang S.P.，2004)。

传统的提取方法如煎煮法、浸渍法、渗漉法、回流提取及索式提取过程都是在完整植物细胞的情况下，通过浸润与渗透、使溶剂进入组织细胞、溶解细胞内物质并使其扩散至溶剂主体，这使溶剂提取细胞内生物活性成分成为可能。但由于细胞壁的屏障作用，决定了中药材有效成分的提取效率有一定限度(刘增琪等，2003；贾立革等，2004；冯青然等，2003)。所以传统提取方法存在提取温度过高，提取率低，成本高，不安全等问题。

酶诱导是在提取的基础上，一方面利用酶(如半纤维素酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等)将细胞壁的成分水解或降解，破坏细胞壁结构，使有效成分充分暴露出来，溶解、混悬或胶溶于提取溶剂中，加速有效成分的释放，从而提高提取效率；另一方面利用酶(如β-葡萄糖苷酶等)将细胞内的苷水解成相应的苷元，从而提高细胞内目标物的含量。

所谓空化(cavitation)，一般是指液体内部局部压力降低时，液体内部或液固交界面上蒸汽或气体的空穴(空泡)的形成、发展和溃灭的过程。当溃灭发生在固体表面附近时，由于空泡瞬间(微秒级)溃灭产生极高的瞬时压强，极高压强的反复作用，从而破坏固体表面。因此，负压空化提取技术是利用负压空化气泡产生强烈的空化效应和机械振动(李根生等，1997；高秋生，1999)，造成样品颗粒细胞壁快速破裂，加速了胞内物质向介质释放、扩散和溶解，从而促进提取。

现在有许多关于酶预处理来提取油和蛋白质以及负压空化提取化合物的报道，但将酶诱导技术和负压空化提取技术相结合提取木豆叶中的有效成分还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以木豆叶为原料，高效地获得富含五种黄酮类活性成分提取物的酶诱导-负压空化提取方法。在确定提取技术路线的基础上，对工艺进行优化，获得富含牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素、芹菜素和异鼠李素五种黄酮类活性成分的木豆叶提取物，从而提高木豆叶的资源利用度。

本发明的技术方案：将新鲜的木豆叶与配制好的酶溶液混合，匀浆，匀浆液放入恒温摇床中振荡酶解，酶解后将酶解液抽滤，得到的固形物加入提取溶剂进行负压空化提取，抽滤后的酶解液和提取液合并，浓缩，溶剂抽提除杂，乙酸乙酯萃取富集精制，合并乙酸乙酯层，浓缩至干，即得富含牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素、芹菜素和异鼠李素五种活性成分的木豆叶提取物。具体方案如下：

(1)匀浆破碎酶解：将新鲜的木豆叶和配制好的酶溶液按固液比1:5～15(g:mL)混合，调节PH值，匀浆0.5～2min。

(2)恒温酶解：将匀浆液放入恒温摇床中，在25～50℃酶解12～42h，转速100～120rpm。

(3)负压空化提取：将酶解液抽滤，固形物加入提取溶剂，固液比为1:8～25(g:mL)，室温提取2～4次，每次60～90min，将抽滤后的酶解液和提取液合并，浓缩，得到浓缩物。

(4)溶剂抽提除杂：将浓缩物用水溶解，以等体积的石油醚为溶剂，逆向抽提3～5次。

(5)富集精制：将经过除杂的剩余溶液用等体积的乙酸乙酯逆向抽提3～5次，使目标成分富集。合并乙酸乙酯抽提液，浓缩至干，得到精制的富含五种黄酮类活性成分的木豆叶提取物。

本发明步骤(1)采用的匀浆粉碎技术与干法粉碎相比，可将木豆叶在酶液中粉碎成细胞组织，并有破坏细胞壁、使植物组织细胞与酶充分接触以及瞬时刺激诱发内源性酶活性的作用，从而提高目标成分的游离，增加目标成分的含量；而且匀浆粉碎时不产生粉尘，不污染环境。

由于植物细胞壁是以纤维素为骨架，并与半纤维素、果胶及蛋白质等大分子结合，单一的酶无法使细胞壁彻底崩溃、对提高有效成分的提取率作用有限，因此，本发明使用的酶为纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和果胶酶，其中的一种或两种以上的组合。根据所加酶组成与比例，调节pH值为3.5～6.0，使酶的活性保持最佳。原料与酶溶液以固液比为1:7～10。

本发明所述步骤(2)恒温酶解过程，酶液浓度为0.3～1.5mg/mL，酶解温度25～50℃，酶解时间为12～42h。

本发明所述步骤(3)负压空化提取过程，所述提取溶剂为醇-水(醇包括甲醇、乙醇和丙醇)、丙酮-水体系。将酶解液抽滤，固形物加入提取溶剂，固液比为1:8～25(g:mL)，室温提取2～4次，每次60～90min。

本发明所述步骤(4)溶剂抽提除杂过程，所述溶剂除石油醚外，还包括乙醚、正己烷。

本发明所述步骤(5)富集精制过程，所述溶剂除乙酸乙酯外，还包括乙酸甲酯、三氯甲烷、二氯甲烷、正丁醇。

按照本发明所述优选的酶诱导负压空化提取条件对木豆叶中牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素、芹菜素和异鼠李素五种黄酮类活性成分进行高效诱导提取，所得提取物中五种黄酮类活性成分的含量分别可达：0.223～0.296、0.145～0.187、0.194～0.264、0.108～0.150、0.074～0.102mg/g，比传统热回流方法提高了9％～65％。

本发明的优点：

(1)该方法具有经济、快速、高效、操作安全的特点。

(2)与传统提取方法相比，操作条件温和、提取温度低、提取率高、耗能低，降低了生产成本。

(3)设备简单，方法易行，可实现大规模的产业化生产。

附图说明

图1为牡荆苷的结构，Glu：葡萄糖

图2为异牡荆苷的结构，Glu：葡萄糖

图3为木犀草素的结构

图4为芹菜素的结构

图5为异鼠李素的结构

具体实施方案

实施例1

配制β-葡萄糖苷酶浓度为0.5mg/mL、果胶酶浓度为0.4mg/mL的酶溶液，调节pH在3.6～4.0之间。称取新鲜木豆叶20g，以固液比1:8的比例加入酶液，匀浆2min，匀浆液放入35℃的恒温摇床中振荡酶解36h，抽滤，固形物中以固液比1:10加入70％乙醇溶液负压空化提取3次，每次80min，合并提取液，浓缩，分别用石油醚和乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯层，浓缩至干，得到固形物0.75g，甲醇定容，LC-MS/MS检测，所得固形物中牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素、芹菜素和异鼠李素的含量分别为0.246、0.153、0.213、0.117、0.083mg/g，分别比传统的热回流方法提高了27.5％、14.2％、30.6％、28.6％和33.9％。

实施例2

配制纤维素酶浓度为0.3mg/mL酶溶液，调节pH在5.0～6.0之间。称取新鲜木豆叶20g，以固液比1:5的比例加入酶液，匀浆1min，匀浆液放入45℃的恒温摇床中振荡酶解24h，抽滤，固形物中以固液比1:10加入50％乙醇溶液负压空化提取2次，每次85min，合并提取液，浓缩，分别用石油醚和乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯层，浓缩至干，得到固形物0.76g，甲醇定容，LC-MS/MS检测，所得固形物中牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素、芹菜素和异鼠李素的含量分别为0.223、0.145、0.194、0.108、0.074mg/g，分别比传统的热回流方法提高了15.5％、8.2％、19.1％、18.7％和19.3％。

实施例3

配制纤维素酶浓度为0.5mg/mL、β-葡萄糖苷酶浓度为0.5mg/mL的酶溶液，调节pH在4.5～5.5之间。称取新鲜木豆叶20g，以固液比1:8的比例加入酶液，匀浆1.5min，匀浆液放入30℃的恒温摇床中振荡酶解18h，抽滤，固形物中以固液比1:15加入乙醇负压空化提取3次，每次70min，合并提取液，浓缩，分别用石油醚和乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯层，浓缩至干，得到固形物0.8g，甲醇定容，LC-MS/MS检测，所得固形物中牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素、芹菜素和异鼠李素的含量分别为0.296、0.187、0.264、0.150、0.102mg/g，分别比传统的热回流方法提高了53.4％、39.6％、62.0％、64.8％和64.5％。

实施例4

配制果胶酶浓度为0.3mg/mL的酶溶液，调节pH在3.5～4.0之间。称取新鲜木豆叶20g，以固液比1:15的比例加入酶液，匀浆2min，匀浆液放入25℃的恒温摇床中振荡酶解42h，抽滤，固形物中以固液比1:8加入甲醇溶液负压空化提取4次，每次70min，合并提取液，浓缩，分别用石油醚和乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯层，浓缩至干，得到固形物0.77g，甲醇定容，LC-MS/MS检测，所得固形物中牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素、芹菜素和异鼠李素的含量分别为0.271、0.161、0.241、0.123、0.087mg/g，分别比热回流方法提高了40.4％、20.1％、47.9％、35.2％和40.3％。

实施例5

配制纤维素酶浓度为0.4mg/mL、β-葡萄糖苷酶浓度为0.3mg/mL、果胶酶浓度为0.2mg/mL的酶溶液，调节pH在3.6～5.0之间。称取新鲜木豆叶20g，以固液比1:8的比例加入酶液，匀浆0.5min，匀浆液放入35℃的恒温摇床中振荡酶解24h，抽滤，固形物中以固液比1:8加入80％甲醇溶液负压空化提取3次，每次90min，合并提取液，浓缩，分别用石油醚和乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯层，浓缩至干，得到固形物0.78g，甲醇定容，LC-MS/MS检测，所得固形物中牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素、芹菜素和异鼠李素的含量分别为0.280、0.168、0.252、0.131、0.094mg/g，分别比热回流方法提高了45.1％、25.4％、54.6％、44.0％和51.6％。

对照组

称取新鲜木豆叶20.0g，以固液比1:20加入70％乙醇溶液，匀浆粉碎2min，80℃热回流提取8h，将提取液浓缩，分别用石油醚和乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯层，浓缩至干，得到固形物0.73g，甲醇定容，LC-MS/MS检测，所得固形物中牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素、芹菜素和异鼠李素的含量分别为0.193、0.134、0.163、0.091、0.062mg/g。

本发明中，结果定量检测分析采用下表条件：

 

仪器	Agilent 1100高效液相色谱仪；API3000四级杆质谱仪
		检测器	MS检测器
色谱柱	Agilent Eclipse XDB8柱(5μm，150mm×4.6mm I.D.)
		柱温	25℃
流动相	A：甲醇-水-乙酸(40:59.94:0.06，v/v/v)；B：乙腈-水-乙酸(40:59.94:0.06，v/v/v)
		洗脱时间	0-6min，100％A；6-6.1min，0-100％B；6.1-14min，100％B；重新平衡1min
流速	1mL/min
		进样体积	10μL

Claims (6)

1.一种富含黄酮类活性成分的木豆叶提取物的诱导提取方法，包括如下操作步骤：

(1)匀浆破碎酶解：将新鲜的木豆叶和配制好的酶溶液按固液比1∶5～15(g∶mL)混合，调节PH值，匀浆0.5～2min。

(2)恒温酶解：将匀浆液放入恒温摇床中，在25～50℃酶解12～42h，转速100～120rpm。

(3)负压空化提取：将酶解液抽滤，固形物加入提取溶剂，固液比为1∶8～25(g∶mL)，室温提取2～4次，每次60～90min，将抽滤后的酶解液和提取液合并，浓缩，得到浓缩物。

(4)溶剂抽提除杂：将浓缩物用水溶解，以等体积的石油醚为溶剂，逆向抽提3～5次。

(5)富集精制：将经过除杂的剩余溶液用等体积的乙酸乙酯逆向抽提3～5次，使目标成分富集。合并乙酸乙酯抽提液，浓缩至干，得到富含五种黄酮类活性成分的木豆叶提取物。

2.按照权利要求1所述步骤(1)匀浆破碎酶解过程，其特征在于：匀浆粉碎，兼具打破细胞壁、使植物组织细胞与酶充分接触以及瞬时刺激诱发内源性酶活性的作用，从而提高目标成分的游离，增加目标成分的含量。使用的酶为纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和果胶酶，其中的一种或两种以上的组合。酶溶液的浓度为0.3～1.5mg/mL、酶溶液体积是固体质量的5～15倍。所述的pH值为3.5～6.0。

3.按照权利要求1所述步骤(2)恒温酶解过程，其特征在于：酶解温度为25～50℃，酶解时间12～42h。使用摇床可使酶液与植物细胞充分作用，促进黄酮加合物的解离，显著增加目标成分的含量。

4.按照权利要求1所述步骤(3)负压空化提取过程，其特征在于：将酶解后固形物进行负压空化提取，所述提取溶剂为醇-水(醇包括甲醇、乙醇和丙醇)、丙酮-水体系。

5.按照权利要求1所述步骤(4)溶剂抽提除杂过程，其特征在于：所用溶剂除石油醚外，还包括乙醚、正己烷。

6.按照权利要求1所述步骤(5)富集精制过程，其特征在于：所述溶剂除乙酸乙酯外，还包括乙酸甲酯、三氯甲烷、二氯甲烷、正丁醇。

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