CN103641807A - 一种芹菜素的提取方法、用于治疗糖尿病的药物组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制药技术领域。本发明的芹菜素的提取方法，包括以下步骤：1）以芹菜为底物，用质量百分比浓度分别为33%-37%的果胶酶和43%-47%的葡萄糖苷酶的混合溶液在30-35℃下酶解10小时；2）将步骤1）所得酶解产物采用70%的乙醇溶液超声提取，将提取液浓缩，然后石油醚和乙酸乙酯分别萃取，将萃取液蒸干后，用70%的乙醇溶解，最后用高效液相色谱仪器分离提取。本发明的用于治疗糖尿病的药物组合物，包括芹菜素和拜唐苹，其质量比为1：（2-5）。本发明利用多酶法提取芹菜素，大大提高提取的产率。本发明的药物组合物，即可以有效控制血糖，同时又能避免单纯使用糖尿病药物治疗可能带来的低血糖以及病人体重下降过快的情况。

Description

一种芹菜素的提取方法、用于治疗糖尿病的药物组合物及其应用
技术领域
本发明涉及制药技术领域，具体地，涉及一种芹菜素的提取方法、以及添加芹菜素的用于治疗糖尿病的药物组合物及其应用。
背景技术
随着人民生活水平的提高，糖尿病已经成为全球性公共卫生问题，对我国人民的健康也产生了直接的问题。糖尿病不仅本身能导致人的死亡，它所产生的并发症如：足部腐烂、糖尿病肾病、高血压、心血管疾病使得糖尿病的危害已经扩大到人体部位的各个领域。目前，全球糖尿病的患病人数为2.46亿，其中2型糖尿病占90%。而中国目前估测出来的20岁以上糖尿病人群有9240万，居世界前列。因此，糖尿病的治疗和预防已经成为刻不容缓的问题。另外，中国还有大量的糖调节异常或者受损的人群，我们又称之为糖尿病前期患者1.48亿，每10个中国人中就有1位糖尿病前期患者，而糖尿病前期患者中有近80%为糖耐量减低（IGT）人群。众多国内外糖尿病协会指南（International Diabetes Federation,《2007年IDF2型糖尿病预防共识》；American Diabetes Association，《2012年ADA糖尿病治疗指南》；《2011年AACE糖尿病综合治疗方案指南》；《2007年中国2型糖尿病防治指南》）都推荐IGT患者应积极采取药物干预。
由于全球90%以上的糖尿病患者为2型糖尿病，并且相对于1型糖尿病，2型糖尿病的发病机制、临床表现也更复杂，胰岛素抵抗综合症是其突出的特征，高血压、高胰岛素血症、高血脂和中心性肥胖是其典型的临床表现，也是导致血管并发症发生发展的重要原因。
胰岛素一直是治疗糖尿病的主要药物。胰岛素治疗糖尿病虽然能有效控制糖尿病病人的血糖，但是这种治疗存在以下几个公认的缺陷：（1）血糖波动太大；（2）体重增加；（3）餐后血糖控制不佳；（4）出现严重的低血糖症状。因此，目前我国在治疗糖尿病方面都采用胰岛素和一些药物联合治疗的方法。其中胰岛素与拜唐苹联合用药方案得到了广泛的应用。大量报道表明拜唐苹不仅在治疗糖尿病方面能显著降低病人的体重，有数据表明，对163例2型糖尿病患者在早晚餐前注射预混胰岛素25/75或30/70的基础上，每天在接受拜唐苹（由50mg bid增加至100mg tid）治疗20周，病人的体重变化值（与基线相比平均变化值）能从10.79下降至-0.25；并且病人的低血糖的风险也有所降低。但是，这种联合用药也存在一定的问题：（1）由于糖类在小肠内吸收和分解缓慢，停留时间延长，病人常出现腹痛、腹泻等副作用，并且由于病人体重下降太多，虽然病人的血糖浓度得到了一定的控制，但病人的肠道部分的免疫力有所下降；（2）虽然拜唐苹能一定程度降低胰岛素单独用药产生低血糖的风险，但是联合用药并不能显著降低这种风险。
芹菜素属于天然黄酮类物质，广泛存在于我们日常生活所食用的蔬菜中，其中以芹菜中的含量最多。近年来，关于芹菜素在糖尿病的防治中的疗效经常被报道，相对于药物治疗糖尿病所产生的毒副作用，芹菜素对糖尿病以及糖尿病前期的预防和治疗越来越成为大家关注的焦点。虽然胰岛素和拜唐苹的联合用药能有效控制糖尿病患者的血糖水平，但是低血糖以及糖尿病患者出现的腹泻以及急剧的体重下降也给治疗带来了隐忧。此外，关于芹菜素的提取，过去基本都用一种破解植物细胞壁的酶来进行提取，但是酶都具有专一性，这样只用一种酶只能使得植物组织细胞壁破解不完全，比如果胶酶，它只能使得植物细胞壁里的果胶水解为半乳糖醛酸，而植物细胞壁中还存在大量的纤维素等其他物质，所以，要想高效提取芹菜素，就必须将芹菜这种植物的细胞壁破解完全。
发明内容
本发明的目的是为解决上述问题，提供一种芹菜素的提取方法。
本发明的另一目的是为解决上述问题，提供一种用于治疗糖尿病的药物组合物。
本发明的再一目的是提供上述治疗糖尿病的药物组合物在制备治疗糖尿病药物中的应用。
本发明的芹菜素的提取方法，包括以下步骤：
1）以芹菜为底物，用质量百分比浓度分别为33%-37%的果胶酶和43%-47%的葡萄糖苷酶的混合溶液在30-35℃下酶解10小时，酶混合溶液添加量为每5g芹菜15mL；
2）将步骤1）所得酶解产物采用70%的乙醇溶液超声提取3次，每次30分钟，超声波的功率为80W，温度为52-57℃，将提取液浓缩，然后用等体积的石油醚和乙酸乙酯分别萃取，将萃取液蒸干后，用70%的乙醇溶解，最后用高效液相色谱仪器分离提取，获得芹菜素。
根据本发明的提取方法，步骤1）所述酶解时间优选为10小时。
根据本发明的提取方法，步骤2）所述超声波功率优选为80W。
本发明用果胶酶加β-葡萄糖苷酶的优化组合方案，由于β-葡萄糖苷酶是纤维素酶的一种，这样两种酶一起使用，就大大提高了细胞壁的破解，提高了芹菜素的提取效率。
本发明的用于治疗糖尿病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括芹菜素和拜唐苹，所述芹菜素和拜唐苹的质量比为1：（2-5）。
本发明的上述药物组合物的制备方法，包括以下步骤：
1）提取芹菜素：以芹菜为底物，用质量百分比浓度分别为33%-37%的果胶酶和43%-47%的葡萄糖苷酶的混合溶液在30-35℃下酶解10小时，酶混合溶液添加量为每5g芹菜15mL，然后采用70%的乙醇溶液超声提取3次，每次30分钟，超声波的功率为80W，温度为52-57℃，将提取液浓缩，然后用等体积的石油醚和乙酸乙酯分别萃取，将萃取液蒸干后，用70%的乙醇溶解，最后用高效液相色谱仪器分离提取，制得芹菜素；
2）将步骤1）制得的芹菜素与拜唐苹按配方量混合，制得药物组合物。
本发明的药物组合物可以使用现有的芹菜素产品，例如市售的芹菜素原料，优选使用本发明所述的提取方法制得的芹菜素。
本发明制得的药物产品，可以按本领域常规的药物制备方法制成含组合物的固体药片、胶囊或口服液，或者其他药剂形式。
上述的制备方法，优选地，步骤1）所述酶解时间为10小时；步骤2）所述超声波功率为80W。
本发明还提供了上述药物组合物在制备治疗糖尿病药物中的应用。
本发明首先给出用联合酶制剂高效提取天然产物芹菜素的制备方法，并给出包括芹菜素与拜唐苹的药物组合物，这个药物组合物有以下几个优点:（1）由于芹菜素为天然产物,不会对糖尿病病人产生任何副作用；（2）拜唐苹联合胰岛素治疗糖尿病虽然能有效治疗糖尿病，但是容易产生低血糖，而芹菜素作为我们日常生活中天然的黄酮类产物，当把芹菜素结合拜唐苹作为复合制剂，它即能有效控制糖尿病病人的血糖功能，又不会使得病人的血糖浓度出现剧烈的下降；（3）由于芹菜素本身不是治疗糖尿病专门药物，虽然它在抑制糖尿病老鼠血糖浓度上有一定疗效，但是和糖尿病专属药物组成复合制剂，即能避免药物治疗的毒副作用，又能弥补天然食品中天然成分治疗糖尿病的弱治疗性。因此本发明采用芹菜素和拜唐苹组成复合制剂用于制备治疗糖尿病的药物，可以弥补拜唐苹在跟胰岛素联合用药的过程中所出现的病人体重急剧下降的情况，对于糖尿病并发症病人来说，体重下降过快反而会引起病人的免疫力的下降，出现病人病情恶化的情况，而要良好平衡病人的血糖、体重以及其他指标对于纯粹的药物治疗来说非常困难，采用芹菜素这种我们日常生活中蔬菜的主要天然化合物，即可以有效控制血糖，又能给病人一定的营养，可以一定程度上缓解药物治疗的危害。（4）我们的团队在以往的实验对已经研究出单个酶法（果胶酶、葡萄糖苷酶）分离提纯芹菜素的优化方案，这较其他提取方法：如有机溶剂提取方法相比，不仅能大大提高提取的产量，而且还能有效避免由于有机溶剂的毒性而造成产物的毒性，不利于芹菜素后续对小鼠的实验，同时，本发明在我们以往实验的基础上将分离效果最好的两种酶结合起来，这不仅能再次大大提高分离的产率，而且也为今后的分离纯化提供了一个高效的双酶法分离芹菜素的方案。另外，我们后续的超声波分离也首次摒弃了以往分离芹菜素所使用有毒的甲醇试剂，而采用一定浓度的乙醇溶剂高效分离提取，这也为后续的大规模工业化生产提供了质量保证。（5）关于芹菜素和拜唐苹以及混合胰岛素在制备治疗糖尿病药物中的应用，跟以往报道不同的是，我们没有在细胞水平上去验证它的作用效果，而是直接采用糖尿病老鼠的动物活体实验，所以在配方上有更强的可靠性。
附图说明
图1为本发明的芹菜素提取的产率。
图2为使用本发明药物组合物对试验组小鼠灌胃后小鼠体重变化示意图。
图3为使用本发明药物组合物对试验组小鼠灌胃后小鼠血糖变化示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明。
实施例1芹菜素的提取以及本发明芹菜素的提取方法与现有提取方法比较
（一）提取芹菜素：
1）以芹菜叶为底物，用质量百分比浓度分别为37%的果胶酶和47%的葡萄糖苷酶的混合溶液在35℃下酶解10小时，酶混合溶液添加量为每5g芹菜叶15mL；
2）将步骤1）所得酶解产物采用70%的乙醇溶液超声提取3次，每次30分钟，超声波的功率为80W，温度为57℃，用旋转蒸发仪将提取液浓缩至100mL，然后用等体积的石油醚和乙酸乙酯分别萃取，将萃取液蒸干后，用70%的乙醇溶解，最后用高效液相色谱仪器分离提取，获得芹菜素。
（二）提取芹菜素：
1）以芹菜叶为底物，用质量百分比浓度分别为33%的果胶酶和43%的葡萄糖苷酶的混合溶液在30℃下酶解10小时，酶混合溶液添加量为每5g芹菜叶15mL；
2）将步骤1）所得酶解产物采用70%的乙醇溶液超声提取3次，每次30分钟，超声波的功率为80W，温度为52℃，用旋转蒸发仪将提取液浓缩至100mL，然后用等体积的石油醚和乙酸乙酯分别萃取，将萃取液蒸干后，用70%的乙醇溶解，最后用高效液相色谱仪器分离提取，获得芹菜素。
（三）提取芹菜素：
1）以芹菜叶为底物，用质量百分比浓度分别为35%的果胶酶和45%的葡萄糖苷酶的混合溶液在34℃下酶解10小时，酶混合溶液添加量为每5g芹菜叶15mL；
2）将步骤1）所得酶解产物采用70%的乙醇溶液超声提取3次，每次30分钟，超声波的功率为80W，温度为55℃，用旋转蒸发仪将提取液浓缩至100mL，然后用等体积的石油醚和乙酸乙酯分别萃取，将萃取液蒸干后，用70%的乙醇溶解，最后用高效液相色谱仪器分离提取，获得芹菜素。
我们把这种双酶法在优化条件下提取芹菜素与单个酶在优化条件下芹菜素的产率进行了比较。
水提法：
将市售的芹菜叶子洗净，晾干，用水将芹菜叶研磨后（水添加量为每5g芹菜叶15mL），分别放入一定温度的水浴中（28，30，32，34，36，38，40℃）水解，记录不同的水解时间（0，3，6，10，14，18，22h），以便后续记录最佳的酶解方案。酶解结束后，将酶液过滤后，用70%乙醇溶液超声提取3次，每次30分钟，超声波的功率为80W，温度为55℃，分别过滤残渣，合并滤液后，用旋转蒸发仪将乙醇抽提液浓缩至100mL，然后用等体积的石油醚和乙酸乙酯分别对浓缩液进行萃取，萃取后的溶液蒸干后，即可看到黄色的芹菜素提取物，用70%乙醇溶液溶解后，用高效液相色谱对提取物进行最后的纯化。
单独使用果胶酶提取芹菜素：
将市售的芹菜叶子洗净，晾干，用配好的35%果胶酶溶液将芹菜叶研磨后（酶溶液添加量为每5g芹菜叶15mL），分别放入一定温度的水浴中（28，30，32，34，36，38，40℃）水解，记录不同的水解时间（0，3，6，10，14，18，22h），以便后续记录最佳的酶解方案。酶解结束后，将酶液过滤后，用70%乙醇溶液超声提取3次，每次30分钟，超声波的功率为80W，温度为55℃，分别过滤残渣，合并滤液后，用旋转蒸发仪将乙醇抽提液浓缩至100mL，然后用等体积的石油醚和乙酸乙酯分别对浓缩液进行萃取，萃取后的溶液蒸干后，即可看到黄色的芹菜素提取物，用70%乙醇溶液溶解后，用高效液相色谱对提取物进行最后的纯化。
单独使用葡萄糖苷酶提取芹菜素：
方法为：用45%葡萄糖苷酶溶液替换上述提取方法中的果胶酶溶液，其余同上述提取芹菜素方法。
将上述（三）所述的方法与单独使用果胶酶和葡萄糖苷酶提取芹菜素进行比较，如图1所示，在本发明的提取方法中，芹菜素的产率分别比果胶酶组高出60%，比葡萄糖苷酶组高出30%。其中，35%果胶酶和45%葡萄糖苷酶优化条件下所提取的芹菜素的产率比33%果胶酶和47%葡萄糖苷酶的所提取的芹菜素高出17%，而37%果胶酶和33%的葡萄糖苷酶所提取的芹菜素的产率比优化条件下要低23%。
实施例2制备药物组合物
药物组合物一：配方：芹菜素10g，拜唐苹20g。（芹菜素：拜唐苹=1:2）。
制备上述药物组合物，包括以下步骤：
1）提取芹菜素：以芹菜叶为底物，用35%的果胶酶和45%葡萄糖苷酶在34℃下酶解10小时，然后采用70%的乙醇溶液超声提取3次，每次30分钟，超声波的功率为80W，温度为52℃，用旋转蒸发仪将提取液浓缩至100mL，然后用等体积的石油醚和乙酸乙酯分别萃取，将萃取液蒸干后，用70%的乙醇溶解，最后用高效液相色谱仪器分离提取，制得芹菜素；
2）将步骤1）制得的芹菜素与拜唐苹按配方量混合，制得药物组合物。
将上述组合物按常规方法制得药物组合物片剂（规格为50mg/片，其中含芹菜素16.7mg，含拜唐苹33.3mg）。
药物组合物二：配方：芹菜素10g，拜唐苹30g（芹菜素：拜唐苹=1:3）。
制备上述药物组合物，包括以下步骤：
1）提取芹菜素：以芹菜叶为底物，用35%的果胶酶和45%葡萄糖苷酶在34℃下酶解10小时，然后采用70%的乙醇溶液超声提取3次，每次30分钟，超声波的功率为80W，温度为57℃，用旋转蒸发仪将提取液浓缩至100mL，然后用等体积的石油醚和乙酸乙酯分别萃取，将萃取液蒸干后，用70%的乙醇溶解，最后用高效液相色谱仪器分离提取，制得芹菜素；
2）将步骤1）制得的芹菜素与拜唐苹按配方量混合，制得药物组合物。
将上述组合物按常规方法制得药物组合物片剂（规格为50mg/片，其中含芹菜素12.5mg，含拜唐苹37.5mg）。
药物组合物三：配方：芹菜素10g，拜唐苹50g（芹菜素：拜唐苹=1:5）。
1）提取芹菜素：以芹菜叶为底物，用35%的果胶酶和45%葡萄糖苷酶在34℃下酶解10小时，然后采用70%的乙醇溶液超声提取3次，每次30分钟，超声波的功率为80W，温度为55℃，用旋转蒸发仪将提取液浓缩至100mL，然后用等体积的石油醚和乙酸乙酯分别萃取，将萃取液蒸干后，用70%的乙醇溶解，最后用高效液相色谱仪器分离提取，制得芹菜素；
2）将步骤1）制得的芹菜素与拜唐苹按配方量混合，制得药物组合物。
按常规方法制得药物组合物片剂（规格为50mg/片，其中含芹菜素8.3mg，含拜唐苹41.7mg）。
实施例3本发明药物组合物对糖尿病模型小鼠的降血糖试验效果
选取8到12周龄以C57Bl/6小鼠为背景具有雄性胰岛素抗性的db/db小鼠（由上海实验动物中心提供）作为实验小鼠。
我们先用精蛋白锌重组人胰岛素混合注射液给药2周后，
下面我们采用实施例2中的三组药物组合物对糖尿病小鼠进行实验。
我们先用精蛋白锌重组人胰岛素混合注射液给药2周后，将药物组合物一～三分别对实验组小鼠进行给药实验（每组采用3只），以考察本发明的药物组合物对糖尿病模型小鼠体重及血糖变化的影响。将三组药物分别粉碎按以下浓度稀释成溶液：
药物组合物一：芹菜素浓度为0.002g/100mL;拜唐苹含量为0.004g/100mL；
药物组合物二：芹菜素浓度为0.0015g/100mL;拜唐苹含量为0.0045g/100mL；
药物组合物三：芹菜素浓度为0.001/100mL;拜唐苹含量为0.005g/100mL；
将上述三组药物组合物按小鼠体重×3μL的体积灌胃。对小鼠的给药实验持续12周，期间分别对小鼠的实验组每周进行体重测量。小鼠血液则抽取小鼠尾部静脉血，采用血糖仪进行口服糖耐量(oral glucose tolerance test,OGTT)实验，以检测小鼠给药后的血糖浓度的变化。
本试验的对照为：在用精蛋白锌重组人胰岛素混合注射液给药2周后仅使用拜唐苹（稀释拜唐苹浓度为0.005g/100mL）按小鼠体重×3μL的体积对db/db小鼠给药（每组采用3只）。
本试验的试验结果如图2-3所示，我们可以从图2中看出三个月时间内由拜唐苹灌胃后，小鼠体重发生了显著的下降，这无疑增加了糖尿病小鼠免疫功能的下降从而增加了糖尿病的并发症发生的概率。而用本发明的药物组合物给小鼠灌胃后，我们从图中可以看出，虽然在第八周小鼠体重有所升高，但整个治疗过程中小鼠体重的波动幅度不大。从图3可以看到，本发明的药物组合物与一部分胰岛素给糖尿病小鼠灌胃后，小鼠血糖先呈现上升的趋势，然后随着时间的延长，小鼠的糖耐量出现了上升的趋势，血糖在逐渐下降，基本跟单独使用拜唐苹以及预混胰岛素所控制的血糖下降的变化趋势一致，但是下降的幅度趋于缓和，这成功避免了糖尿病小鼠在治疗的过程中可能出现的低血糖的概率。本发明制备简单，提取物对人体或动物无任何毒害影响，成本低，疗效显著，可连续化生产。

Claims (6)

1.一种芹菜素的提取方法，包括以下步骤：
1）以芹菜为底物，用质量百分比浓度分别为33%-37%的果胶酶和43%-47%的葡萄糖苷酶的混合溶液在30-35℃下酶解10小时，酶混合溶液添加量为每5g芹菜15mL；
2）将步骤1）所得酶解产物采用70%的乙醇溶液超声提取3次，每次25-35分钟，温度为52-57℃，将提取液浓缩，然后用等体积的石油醚和乙酸乙酯分别萃取，将萃取液蒸干后，用70%的乙醇溶解，最后用高效液相色谱仪器分离提取，获得芹菜素。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤2）所述超声波功率为80W。
3.一种用于治疗糖尿病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括芹菜素和拜唐苹，所述芹菜素和拜唐苹的质量比为1：（2-5）。
4.一种权利要求3所述药物组合物的制备方法，包括以下步骤：
1）提取芹菜素：以芹菜为底物，用质量百分比浓度分别为33%-37%和43%-47%的葡萄糖苷酶的混合溶液在30-35℃下酶解10小时，酶混合溶液添加量为每5g芹菜15mL，然后采用70%的乙醇溶液超声提取3次，每次30分钟，温度为52-57℃，将提取液浓缩，然后用等体积的石油醚和乙酸乙酯分别萃取，将萃取液蒸干后，用70%的乙醇溶解，最后用高效液相色谱仪器分离提取，制得芹菜素；
2）将步骤1）制得的芹菜素与拜唐苹混合，制得药物组合物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2）所述超声波功率为80W。
6.权利要求1所述药物组合物在制备治疗糖尿病药物中的应用。
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Denomination of invention: Apigenin extraction method, pharmaceutical composition for treating diabetes and its application

Granted publication date: 20151209

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