CN105037311A - 一种芹菜素在线二维复合液相提取纯化方法 - Google Patents

一种芹菜素在线二维复合液相提取纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种芹菜素在线二维复合液相提取纯化方法所述方法步骤如下：步骤1，取干燥的芹菜叶，用乙醇提取，提取液过滤，浓缩至干；步骤2，取步骤1的提取物与C4填料混合，加入甲醇，置40℃旋转蒸发仪中旋转蒸发除去甲醇，得到干燥粉末；步骤3，取步骤2得到的干燥粉末，装填制备色谱柱，连入在线二维液相色谱分离系统进行分离。

Description

一种芹菜素在线二维复合液相提取纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种蔬菜中的成分的提取分离方法，特别涉及一种芹菜素在线二维复合液相提取纯化方法。
背景技术：
伴随着畜牧兽医业的前进与发展，从某些方面来说，我们发现了更多的疾病，更多的细菌与病毒，已有的细菌与病毒更是发生了很多变异。畜禽大规模的集约化养殖加大了动物患病的可能，增加了传染病的发生，同时降低了动物对于一般病原体的抵抗力。为了对抗病原体的侵袭，治疗疾病，保证生产，减少利益损失，人们必须加大药物的使用量和种类，如抗生素类药物。然而大量的使用抗生素类药物也会带来许多严峻问题，这些问题在当今的生产生活中日益显著。首先，是滥用抗生素药物引起畜禽体内正常菌群紊乱，造成免疫力低下，增加了二次感染和继发感染发生的可能性，使治疗效果越来越差，形成恶性循环。其次，集约化养殖中大量的应用抗生素类的药物也会造成药物残留的超标，会严重影响动物性产品的进出口贸易，危害到人类的身体健康。
因此，在畜牧兽医产业中，我们应当采取相应的应对措施：一方面严格管理控制抗生素的使用，另一方面，我们应寻找能代替抗生素的新型理想药品。近年来，现代中兽医学飞速发展，现代的中兽医药有着优质，高效，稳定，安全，质量可靠，用药方便等几大特点。因为，中药多来自于天然植物，所以它具有着很多的天然属性，例如，化学成分组合的合理性，药物的功效的整体性以及双向性，并且毒副作用小，不容易导致病原微生物，病毒等产生耐药性，极少情况下在动物体内形成有害药物残留的优点。作为一种中药制剂，芹菜素，有着无毒，温和，无残留等优势。如何将芹菜素类产品大规模生产和推广应用，需要我们对其进行深入研究，开发和创新。这样，才能使芹菜素类产品在畜牧生产中发挥无限潜能。
芹菜素的研究概况：
中医认为芹菜，具有有平肝清热，祛风利湿，除烦消肿，凉血止血，解毒宣肺，健胃利血、清肠利便、润肺止咳、降低血压、健脑镇静的功效。
近5年来，有很多有关于芹菜素的药理作用方面的一些研究,经过归纳与总结，主要对以下几个方面有药理作用。对中枢神经系统有镇静作用和对皮质神经元的保护作用；有抗菌作用；对心血管有降压作用和对动脉粥样硬化的预防作用；对肿瘤有抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管形成、侵袭和转移和抗氧化作用；雌激素样作用；还有化疗增敏作用、放疗增敏作用、诱导分化、抗突变作用等。
本发明建立了一套芹菜素的提取与纯化方法和流程，为拓展芹菜素的应用范围及其药理作用的研究提供了实验基础，为进一步开发与利用芹菜资源打下了坚实的基础，芹菜素的抗菌作用十分显著，使得芹菜素在中国畜牧业上有着极大的发展潜力。
发明内容：
为了获得单一的芹菜素成分，去除芹菜中的其他成分及杂质，本发明采用二维液相色谱法对芹菜素粗体品进行分离纯化。将分离纯化后的芹菜素样品通过高效液相色谱检测，证明本发明方法可以得到高纯度的芹菜素，在纯度，收率和成本上由于现有技术。
为此，本发明提供一种从芹菜中提取分离芹菜素的方法，所述方法步骤如下：
步骤1，取干燥的芹菜叶，用乙醇提取，提取液过滤，浓缩至干；
步骤2，取步骤1的提取物与C4填料混合，加入甲醇，置40℃旋转蒸发仪中旋转蒸发除去甲醇，得到干燥粉末；
步骤3，取步骤2得到的干燥粉末，装填制备色谱柱，连入在线二维液相色谱分离系统。
其中的色谱分离条件如下：
表1.主分离色谱条件
表2.二步分离色谱条件
样品在在线二维液相色谱分离系统中的流程如下：
样品通过定量环，在分离柱I中运用低压梯度得到分离。在分离柱中洗脱液通过捕获柱时，由于捕获柱中水的加入使其极性增加，主分离柱中的馏分被富集在18根捕获柱中。被捕获的馏分通过分离柱II使达到二次分离，整个分离过程结束。
芹菜提取物经在线二维色谱分离后，收集的19号馏分经高效液相色谱色谱柱检测结果制备的芹菜素含量达95％以上。
本发明优选的方法如下：
步骤如下：
步骤1，称取香芹叶粉末8-12g，加入到400-600ml锥形瓶中，加入90-98％乙醇溶液80-120ml,将锥形瓶放入超声波清洗机中，设定超声功率240-260W,温度60-70℃提取0.5-1h；用孔径0.4-0.5μm微孔滤膜过滤，将提取液和滤渣分离，滤渣加入90-98％乙醇溶液60-80ml,超声提取0.5-1h，用孔径0.4-0.5μm微孔滤膜过滤，将提取液和滤渣分离，滤渣加入90-98％乙醇溶液60-80ml,超声提取0.5-1h，用孔径0.4-0.5μm微孔滤膜过滤，将提取液和滤渣分离，将3次提取液合并，旋转蒸发浓缩至干，得到香芹粗提样品；
步骤2.粗提芹菜素在线二维液相色谱的分离
称取0.3-0.5g香芹粗提样品，与1-1.5gC4混合至旋转蒸发瓶中，
加入10-20mL甲醇，超声使其溶解完全，置40-50℃旋转蒸发仪中旋转蒸发除去甲醇，得到干燥的均匀粉末状混合物，将样品装柱，然后将该柱连入在线二维液相色谱分离系统管路，分离条件如下：
表1.主分离色谱条件
表2.二步分离色谱条件
样品通过进样柱，在分离柱I中运用低压梯度分离，分离柱中的馏分被富集在18根捕获柱中，被捕获的馏分通过分离柱II达到二次分离，单一化合物的洗脱液由馏份收集器上的微孔板收集,收集的19号馏分为芹菜素。
名词术语的解释：
芹菜素:分子式：C15H10O5；分子量：270.25；属于黄酮类化合物：化学结构为4,5,7一三羟黄酮,其4,5,7位置的3个羟基和C2C3双键决定了其独特的药理学特性。芹菜素是一种黄色的结晶体，熔点为347～348℃、难溶于水，但是易溶于甲醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂，因其分子中含有酚羟基，故显酸性，可以溶于碱性水溶液中。
在线二维液相色谱分离系统：模式图见图20,该系统为现有技术，可以从市场上购买得到，如德国色谱公司生产的250型号的二维分离系统。
C4：为一种分离色谱柱所用的填料
本发明的筛选过程如下：
实验方法
1.芹菜素标准溶液的制备
称取芹菜素标准品5mg，用甲醇定容于10ml容量瓶中，摇匀备用。
2.香芹粗提样品溶液的制备
2.1新鲜香芹洗净后，将根茎叶分开，剪碎，在干燥烘干箱中65℃完全干燥，分装。
2.2准确称取香芹叶粉末10.0g，加入到500ml锥形瓶中，加入95％乙醇溶液100ml,将锥形瓶放入超声波清洗机中，设定超声功率250W,温度65℃提取0.5h。
2.3用孔径0.45μm微孔滤膜过滤，将提取液和滤渣分离，滤渣加入95％乙醇溶液70ml,超声提取0.5h。
2.4重复步骤2.32次。
2.5将3次提取液合并，旋转蒸发浓缩至干，用一定体积甲醇溶解，备用。
3.紫外最适吸收波长的选取
使用NanoDrop2000核酸蛋白检测仪的UV-VIS程序，检测粗提芹菜素最适吸收波长，选取经过滤的30％乙醇作为基点调零。
使用核酸蛋白检测仪的UV-VIS程序从200-800nm范围内自动扫描0.0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8ml标液，确定芹菜素最适吸收波长。
4.粗提芹菜素在线二维液相色谱的分离
4.1上样样品的准备
称取0.4g香芹粗提样品与1.2gC4混合至旋转蒸发瓶中，加入约15mL甲醇，超声使其溶解完全，置40℃旋转蒸发仪中旋转蒸发除去甲醇，得到干燥的均匀粉末状混合物。依照进样柱装填方法将样品装柱，然后将该柱连入在线二维液相色谱分离系统管路。
4.2样品在二维液相色谱柱中的流程
样品(固体)通过进样柱，在分离柱I中运用低压梯度得到分离。在分离柱中洗脱液通过捕获柱时，由于捕获柱中水的加入使其极性增加，主分离柱中的馏分被富集在18根捕获柱中。被捕获的馏分通过分离柱II使达到二次分离，整个分离过程结束。单一化合物的洗脱液由馏份收集器上的微孔板得到收集，可以进一步地得到分析。
通过选取不同的流动相体系，改变主分离流动相条件等因素，可以得到不同的主分离色谱图，通过寻找最佳条件，将主分离图上各峰分开，进而建立芹菜素样品的最佳二维液相分离方法。
4.3馏分收集
自动收集各馏分，将各个馏分别置于离心管中,标记好后放置于冰箱4℃保存。
5.高效液相色谱检测
5.1样品的准备
5.2.1取10mg芹菜素标准品溶于少量甲醇中，置于25mL容量瓶中，甲醇定容摇匀，0.22um有机膜过滤后备用；
5.2.2分别取4.3收集的各个样品分离馏分经0.22um有机膜过滤备用，
5.2检测用色谱条件
色谱柱：C18；柱温：室温；流动相:甲醇0.4％，磷酸水溶液(1：1)；流速：0.8ml/min；检测波长：346nm.将5.1制备的样品用高效液相色谱仪检测。
6.芹菜素含量的测定
芹菜素含量的测定采用高效液相色谱法。准确称取52.6mg的芹菜素对照品溶解于适量甲醇中，并准确定容于100mL作为母液，然后分别取0.25、0.5、1、2、3、5mL于6个10mL的容量瓶中，并用甲醇定容，作为不同浓度的标准液，取上述标准液过0.45μm的滤膜后，用色谱进行测定，色谱柱为C18柱(4.6x250mm，5μm)，流动相为甲醇0.4％，磷酸水溶液(1：1)，流速0.8mL/min，检测波长为346nm，进样量为10μL。以色谱峰面积为纵坐标，芹菜素对照品浓度为横坐标，得线性回归方程Y＝33783X-43787，R2＝0.9991，可知芹菜素在0.013-0.26mg/mL范围内峰面积与浓度呈良好的线性。
关系。
7结果与分析
7.1紫外最适吸收波长的选取
由图1可知，从800-200nm范围内自动扫描，芹菜素标准品在200—800nm全波长扫描的图谱中显示，芹菜素在200nm、270nm和346nm条件下有吸收峰的存在。而且2个波长下的峰形都较规则，都有利于检测波长的选择，但在346nm条件下，有较高的吸收值，干扰少，峰型更加规则和稳定，有利于芹菜素液相条件下的检测。故选择346nm作为紫外检测用波长。
图1紫外全波长扫描图
7.2二维液相色谱主分离结果
表1.主分离色谱条件
表2.二步分离色谱条件
在图2中，可以看出芹菜素粗提品的组成成分十分复杂，在选定的色谱条件下见表1,芹菜素粗提品各组分离效果较为理想，由于溶剂甲醇和乙腈对物质的选择性有所不同；所以如果用这两个色谱柱构建一个二维分离体系,有一定的正交性,非常适合植物材料复杂体系的分离
图2主分离色谱图
7.3二维液相色谱二次分离结果
在二次分离中，共采用15根捕获柱进行样品的捕获和洗脱，共收集了84个样品，通过对照二次分离色谱图，将同一个峰中收集的样品进行合并，保存并做好标记,准备进行高效液相色谱检测。
7.4高效液相色谱结果
7.4.1芹菜提取物经在线二维色谱分离后，共收集了84了个馏分，
其中收集的19号馏分经高效液相色谱色谱柱检测结果见图5，与芹菜素标品比较洗脱峰的保留时间和峰面积积分基本相同，制备的芹菜样品芹菜素含量达95％以上。
根据峰面积计算芹菜样品中芹菜素的含量。
X＝[S样×K/m样(1-水分)]×对照品含量％×100
X:芹菜素的含量(％)；
S样:样品的主峰面积；
K:单位面积标准品的质量
m样(1-水分):称取供样品折干后的质量(mg)；
X对:标准品的含量(％)；
7.4.2芹菜素标准品高效液相结果
通过紫外分光光度计，在800-200nm范围内扫描，芹菜素标准品在200nm、270nm和346nm条件下都有吸收峰，但在346nm条件下，吸收峰更加规则和稳定，故本文选择346nm为测定波。
选取甲醇和乙睛作为流动相，所得图像得到较好的分离所以证明所选择条件较为理想，其主分离所分得各组分可继续进行二次分离，单一成分从含量和纯度看均较高。
应用二维液相色谱系统分离纯化各组分，其步骤相比较其它方法得到简化。
本发明通过寻找最佳条件，将主分离图上各峰分开,自动收集各馏分。本发明有效地建立了芹菜素的在线二维液相纯化分离方法，将芹菜素粗提品上样萃取，进行二维液相分离纯化，获得较为单一的成分。该方法省力、省时、精密度高，为芹菜素研究提供了一个有效地途径和方法。
附图说明
图1紫外全波长扫描图
图2主分离色谱图
图3捕获柱1色谱图
图4捕获柱2色谱图
图5捕获柱3色谱图
图6捕获柱4色谱图
图7捕获柱5色谱图
图8捕获柱6色谱图
图9捕获柱7色谱图
图10捕获柱8色谱图
图11捕获柱9色谱图
图12捕获柱10色谱图
图13捕获柱11色谱图
图14捕获柱12色谱图
图15捕获柱13色谱图
图16捕获柱14色谱图
图17捕获柱15色谱图
图18标准品高效液相色谱图
图1919号馏分高效液相色谱图
图20在线二维液相色谱分离系统模式图
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
步骤1，准确称取香芹叶粉末10.0g，加入到500ml锥形瓶中，加入95％乙醇溶液100ml,将锥形瓶放入超声波清洗机中，设定超声功率250W,温度65℃提取0.5h。2.3用孔径0.45μm微孔滤膜过滤，将提取液和滤渣分离，滤渣加入95％乙醇溶液70ml,超声提取0.5h。重复2次。将3次提取液合并，旋转蒸发浓缩至干，用一定体积甲醇溶解，备用。
步骤2.粗提芹菜素在线二维液相色谱的分离
称取0.4g香芹粗提样品与1.2gC4混合至旋转蒸发瓶中，加入约15mL甲醇，超声使其溶解完全，置40℃旋转蒸发仪中旋转蒸发除去甲醇，得到干燥的均匀粉末状混合物。依照进样柱装填方法将样品装柱，然后将该柱连入在线二维液相色谱分离系统管路。分离条件如下：
表1.主分离色谱条件
表2.二步分离色谱条件
样品(固体)通过进样柱或液体样品通过定量环，在分离柱I中运用低压梯度得到分离。在分离柱中洗脱液通过捕获柱时，由于捕获柱中水的加入使其极性增加，主分离柱中的馏分被富集在18根捕获柱中。被捕获的馏分通过分离柱II使达到二次分离，整个分离过程结束。
单一化合物的洗脱液由馏份收集器上的微孔板得到收集。
芹菜提取物经在线二维色谱分离后，收集的19号馏分经高效液相色谱色谱柱检测结果制备的芹菜素含量达95％以上。
实施例2，芹菜素含量的检测方法
高效液相色谱检测
样品的准备
取10mg芹菜素标准品溶于少量甲醇中，置于25mL容量瓶中，甲醇定容摇匀，0.22um有机膜过滤后备用；
分别取4.3收集的各个样品分离馏分经0.22um有机膜过滤备用，
检测用色谱条件
色谱柱：C18；柱温：室温；流动相:甲醇0.4％，磷酸水溶液(1：1)；流速：0.8ml/min；检测波长：346nm.将5.1制备的样品用高效液相色谱仪检测。
芹菜素含量的测定
芹菜素含量的测定采用高效液相色谱法。准确称取52.6mg的芹菜素对照品溶解于适量甲醇中，并准确定容于100mL作为母液，然后分别取0.25、0.5、1、2、3、5mL于6个10mL的容量瓶中，并用甲醇定容，作为不同浓度的标准液，取上述标准液过0.45μm的滤膜后，用色谱进行测定，色谱柱为C18柱(4.6x250mm，5μm)，流动相为甲醇0.4％，磷酸水溶液(1：1)，流速0.8mL/min，检测波长为346nm，进样量为10μL。以色谱峰面积为纵坐标，芹菜素对照品浓度为横坐标，得线性回归方程Y＝33783X-43787，R2＝0.9991，可知芹菜素在0.013-0.26mg/mL范围内峰面积与浓度呈良好的线性。
关系。
检测波长的选择，但在346nm条件下，有较高的吸收值，干扰少，峰型更加规则和稳定，有利于芹菜素液相条件下的检测。故选择346nm作为紫外检测用波长。
根据峰面积计算芹菜样品中芹菜素的含量。
X＝[S样×K/m样(1-水分)]×对照品含量％×100
X:芹菜素的含量(％)；
S样:样品的主峰面积；
K:单位面积标准品的质量
m样(1-水分):称取供样品折干后的质量(mg)；
X对:标准品的含量(％)；

Claims (3)

1.一种芹菜素在线二维复合液相提取纯化方法，其特征在于，所述方法步骤如下：
步骤1，取干燥的芹菜叶，用乙醇提取，提取液过滤，浓缩至干；
步骤2，取步骤1的提取物与C4填料混合，加入甲醇，置40℃旋转蒸发仪中旋转蒸发除去甲醇，得到干燥粉末；
步骤3，取步骤2得到的干燥粉末，装填制备色谱柱，连入在线二维液相色谱分离系统进行分离，收集的19号馏分即芹菜素；
其中的色谱分离条件如下：
主分离色谱条件
二步分离色谱条件
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤如下：
步骤1，称取香芹叶粉末8-12g，加入到400-600ml锥形瓶中，加入90-98％乙醇溶液80-120ml,将锥形瓶放入超声波清洗机中，设定超声功率240-260W,温度60-70℃提取0.5-1h；用孔径0.4-0.5μm微孔滤膜过滤，将提取液和滤渣分离，滤渣加入90-98％乙醇溶液60-80ml,超声提取0.5-1h，用孔径0.4-0.5μm微孔滤膜过滤，将提取液和滤渣分离，滤渣加入90-98％乙醇溶液60-80ml,超声提取0.5-1h，用孔径0.4-0.5μm微孔滤膜过滤，将提取液和滤渣分离，将3次提取液合并，旋转蒸发浓缩至干，得到香芹粗提样品；
步骤2.粗提芹菜素在线二维液相色谱的分离
称取0.3-0.5g香芹粗提样品，与1-1.5gC4混合至旋转蒸发瓶中，加入10-20mL甲醇，超声使其溶解完全，置40-50℃旋转蒸发仪中旋转蒸发除去甲醇，得到干燥的均匀粉末状混合物，将样品装柱，然后将该柱连入在线二维液相色谱分离系统管路，分离条件如下：
主分离色谱条件
二步分离色谱条件
样品通过进样柱，在分离柱I中运用低压梯度分离，分离柱中的馏分被富集在18根捕获柱中，被捕获的馏分通过分离柱II达到二次分离，单一化合物的洗脱液由馏份收集器上的微孔板收集,收集的19号馏分为芹菜素。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤如下：
步骤1，称取香芹叶粉末10.0g，加入到500ml锥形瓶中，加入95％乙醇溶液100ml,将锥形瓶放入超声波清洗机中，设定超声功率250W,温度65℃提取0.5h；用孔径0.45μm微孔滤膜过滤，将提取液和滤渣分离，滤渣加入95％乙醇溶液70ml,超声提取0.5h，用孔径0.45μm微孔滤膜过滤，将提取液和滤渣分离，滤渣加入95％乙醇溶液70ml,超声提取0.5h，过滤，将3次提取液合并，旋转蒸发浓缩至干，得到香芹粗提样品；
步骤2.粗提芹菜素在线二维液相色谱的分离
称取0.4g香芹粗提样品，与1.2gC4混合至旋转蒸发瓶中，加入15mL甲醇，超声使其溶解完全，置40℃旋转蒸发仪中旋转蒸发除去甲醇，得到干燥的均匀粉末状混合物，将样品装柱，然后将该柱连入在线二维液相色谱分离系统管路，分离条件如下：
主分离色谱条件
二步分离色谱条件
样品通过进样柱，在分离柱I中运用低压梯度分离，分离柱中的馏分被富集在18根捕获柱中，被捕获的馏分通过分离柱II达到二次分离，单一化合物的洗脱液由馏份收集器上的微孔板收集,收集的19号馏分为芹菜素。
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