CN102133256B - 大花红景天提取物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种大花红景天提取物，其特征在于：该提取物中含有红景天苷的重量百分含量不得少于10％，含有红景天多糖的重量百分含量不得低于30％，含有红景天多酚的重量百分含量不低于34.0％；rosavin含量为0％。本发明还提供了制备该提取物的方法。本发明大花红景天的药效明确，质量稳定，可控性强。

Description

大花红景天提取物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种大花红景天提取物及其制备方法。

背景技术

红景天(RhodioLarosea)系景天科(CrassuLaceae)景天属(RhodioLa)植物的根及根茎。我国是红景天的分布中心，全世界90余种红景天属植物中有70多种在我国有分布。而四川、西藏、云南等西南地区是大花红景天RhodioLacrenuata(Hook.f.et Thomx.)H.Ohba的主产区，西藏地区的产量最大。大花红景天又名宽瓣红景天、圆齿红景天，生于海拔2800～5600米的山坡草地、灌丛、石缝中。大花红景天植物资源丰富，分布于四川、云南、西藏、青海等广大西部地区，而且蕴藏量很大，熊先荣、贺俊生等仅对西藏红景天资源做了研究统计，结果都显示大花红景天的蕴藏量最大。

关于大花红景天中化学成分的报道较多，如：包文芳，吴维春，李葆华.抗疲劳药用植物红景天[M].人民军医出版社，2003：1～2，报道了大花红景天主要含有醇及其苷类、黄酮类、酚及其苷类、生氰苷类、内酯类以及挥发油。专利申请号：03128415.9，发明名称：大花红景天有效成份制剂及制备方法，该发明涉及大花红景天有效成份的提取分离及制剂。该发明公开的大花红景天有效成份制剂由含小分子化合物的活性成分总黄酮、红景天甙或大分子化合物的活性成分多糖30～70％和70～30％药用辅料组成的医学上可接受的各类制剂。申请号：200610021639.3，发明名称：藏药大花红景天多糖降糖肠溶微丸及制备方法，藏药大花红景天多糖降糖肠溶微丸是由以西藏产大花红景天为原料，采用水提醇沉法从中提取多糖部位。经酶法脱蛋白、透析、醇沉、洗涤、真空干燥等操作后制得红景天粗多糖，再经Sephadex G-100凝胶树脂柱层析得到红景天精制多糖。经动物试验证实这种产品具有较为明显的降糖活性。申请号：03116051.4，发明名称：一种红景天有效成分提取物的制备方法，该发明中，对红景天醇提物采用正丁醇萃取，正丁醇部位再用D-101型大孔树脂分离纯化，最终得到含有红景天苷5-95％，洛塞维95-5％的红景天提取物，该发明的说明书还指出，洛塞维rosavin(β-(E)-肉桂醇基-0-(6′-0-α-L-吡喃阿拉伯糖基)-D-吡喃葡萄糖苷)的药理活性远强于红景天苷和酪醇。这一观点也可以从目前市售的红景天提取物中看出：市售红景天提取物均要求其中含有的红景天苷和rosavin均大于1％，而且目前欧盟也要求红景天提取物中必须含有有效剂量的rosavin。本领域技术人员所知，并非所有的红景天药材都含有Rosavin，将rosavin进行含量限定，限制了红景天药材基源物质的开发；目前也没有文献报道rosavin的含量的高低决定了红景天药材或提取物的质量。

发明内容

本发明的技术方案是提供了一种大花红景天提取物，本发明的另一技术方案是提供了大花红景天的制备方法。

本发明提供了一种大花红景天提取物，该提取物中含有红景天苷的重量百分含量不得少于10％，含有红景天多糖的重量百分含量不得低于30％，含有红景天多酚的重量百分含量不低于34％，rosavin含量为0％。

进一步地，含有红景天苷的重量百分含量为11％～13％；含有红景天多糖的重量百分含量为30～35％；含有红景天多酚的重量百分含量35～40％，rosavin含量为0％。

更近一步地，含有红景天苷的重量百分含量为11.9％～12.2％；含有红景天多糖的重量百分含量为33.5～33.9％；含有红景天多酚的重量百分含量37.1～37.6％，rosavin含量为0％。

本发明还提供了一种制备上述的大花红景天提取物的方法，它包括如下步骤：

a、取大花红景天，加30-95％乙醇回流提取，得大花红景天醇提取物；

b、选用HPD₆₀₀、D₁₀₁、HPD₇₂₂、D₁₆₀、DM₁₃₀或IHPD₈₂₆大孔吸附树脂，取a步骤制得的大花红景天醇提取物上样至树脂达饱和吸附，停止上样，以蒸馏水0.5-5BV、10-95％乙醇1-10BV依次洗脱，洗脱速率为2ml/min，收集乙醇洗脱部位，回收乙醇，干燥，即得本发明大花红景天提取物。

其中，a步骤的具体操作为：取大花红景天，加入10倍量70％乙醇，回流提取2次，每次回流提取1小时。

其中，b步骤中，所述的大孔吸附树脂为HPD₈₂₆，蒸馏水用量为0.5BV，乙醇浓度为30-90％、用量为5-10BV。

进一步地，b步骤中，所述的乙醇浓度为30％，用量为6BV。

其中，b步骤中，上样具体操作如下：上样液生药浓度为0.05～0.25g/ml，吸附柱的径高比为1.5∶7.1～13，上样量以红景天苷不泄漏为准，吸附速率为1～6ml/min。

进一步地，所述的上样液生药浓度为0.10～0.15g/ml，吸附柱的径高比为1.5∶7.1～13，上样量为每g树脂0.25～1.0g生药，吸附速率为1～3ml/min。

进一步优选地，所述的上样液生药浓度为0.10g/ml，吸附柱的径高比为1.5∶10，上样量为每g树脂1.0g生药，吸附速率为2ml/min。

本发明提取物的制备方法，与03116051.4公开的一种红景天有效成分提取物的制备方法相比，省去了有机试剂进行萃取的过程，更适合工业化生产，减少环境污染；本发明大花红景天提取物虽然不含有指标成分rosavin，但仍然能够起到良好药效作用，并且显著优于含有rosavin的市售红景天提取物，为临床提供了一种新的用药选择。

本发明说明书中实施例的内容，不应理解为是对本发明保护范围的限制，凡基于上述技术思想，利用本领域普通技术知识和惯用手段所做的修改、替换、变更均属于本发明的范围。

附图说明

图1各型树脂吸附后药液浓度曲线

图2泄漏曲线

图3损失曲线

图4洗脱率与收集份数曲线图

图5不同提取物对菜籽油抗氧化作用

图6不同提取物对猪油抗氧化作用

具体实施方式

实施例1  本发明大花红景天提取物的制备方法

取大花红景天粗粉适量，以70％乙醇为提取溶媒，10倍量，回流提取2次，每次回流提取1小时。提取液以HPD₈₂₆大孔吸附树脂纯化红景天苷，上样液生药浓度为0.1g/ml(红景天苷浓度约1.28mg/ml)，径高比为1.5/10，上样量为每g树脂1.0g生药，吸附速率为2ml/min，吸附平衡后，以蒸馏水0.5BV、30％乙醇6BV依次洗脱，洗脱速率为2ml/min，回收乙醇，干燥，即得本发明大花红景天提取物。

实施例2  本发明大花红景天提取物有效成分含量测定

大花红景天提取物中红景天苷是其主要功效成分，此外，红景天多糖、多酚含量较高，而且有确切的药理作用，故选择红景天苷、红景天多糖、多酚作为含量测定的指标成分，以便更好的控制大花红景天提取物的质量。以下测定供试品均为实施例1制备得到。

红景天苷含量测定

①色谱条件色谱柱：HypersiL ODS(4.6mm×200mm，5μm)；流动相：乙腈-水(8∶92)；流速：1.0ml/min；检测波长：275nm；柱温：30℃。

②供试品溶液的制备  取本品粉末约50mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加70％乙醇溶解并定容，摇匀，即得。

③标准曲线的制备

分别精密量取对照品贮备液溶液(0.560mg/ml)2.5μl、5μl、7.5μl、10μl、12.5μl注入液相色谱仪，按前述色谱条件分别测定其峰面积。以对照品含量(X)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标，绘制标准曲线。计算，得直线回归方程：Y＝352528X-7079.6，相关系数r＝0.9999。以上结果表明红景天苷含量在1.40μg～7.00μg范围内与峰面积积分值有良好的线性关系。测定数据见表1。

表1  标准曲线的制备

④精密度试验

精密吸取上述对照品溶液7.5μl，重复进样测定5次，结果红景天苷峰面积积分值见表2。

表2  精密度试验

由上表结果可知RSD＜2％，结果显示仪器精密度良好。

⑤重现性试验

精密称取本品粉末5份，每份50mg，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，测定结果见表3。

表3  重现性试验结果

由上表结果可知，RSD＜2％，表明本法重现性较好，方法可行。

⑥提取物含量测定

称取本品粉末10份，每份50mg，精密称定，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，计算红景天苷含量。10批大花红景天提取物景天苷含量见表4。

表4  10批提取物中红景天苷含量(n＝3)

结果表明，该10批提取物红景天苷含量在11.93～12.18之间，平均含量均为12.07％，由此，暂定大花红景天按干燥品计算，含红景天苷不得少于10％。

(4)多糖含量测定

①5％苯酚试剂的配制取苯酚100g，加铝片0.1g和NaHCO₃0.05g，蒸馏，收集182℃馏份，称取7.5g，加水150ml溶解，置棕色瓶内放冰箱备用。

②对照品溶液和样品溶液的制备  精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品25.58mg，置250ml容量瓶中加适量蒸馏水溶解，稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，备用(每1ml含葡萄糖102.32ug)。

取大花红景天提取物粉末约12mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加70％乙醇溶解并定容，摇匀，即得。

③最大吸收波长的选择  分别精密称吸取对照品溶液0.6ml、供试品溶液0.6ml分别置具塞试管中，加水至1.0ml，再分别加人5％苯酚溶液1.6ml，摇匀，然后加浓H₂SO₄7.0ml，充分摇匀，室温放置25min。另取1.0ml水作同上平行操作，作为空白对照，在400～650nm之间扫描。结果表明，对照品溶液和供试品溶液在486nm处有最大吸收峰，故选择486nm作为测定波长。

④标准曲线的制备  精密移取对照品溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml分别置具塞试管中，按照“最大吸收波长选择”项下方法，自“加水至1ml”起操作，另取1.0ml水为空白，在486nm处测定吸光度。以吸光度(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线，得葡萄糖的浓度C与吸光度A之间的回归方程为：A＝0.0743C+0.0005，r＝0.9998(线性范围2.13～10.66μg/ml)，结果见表5。

表5  标准曲线的制备

⑤精密度试验

取同一份对照品溶液，重复测定6次，其RSD为0.17％。结果见表6，表明仪器设备精密度良好。

表6  精密度实验结果

⑥稳定性试验

取葡萄糖标准溶液0.6ml，按“最大吸收波长的选择”项下操作显色，在不同时间测定其吸光度。结果见表7，表明在4小时内吸光度基本保持恒定，稳定性良好。

表7  稳定性试验结果

⑦重复性试验

取同一大花红景天提取物粉末5份，每份12mg，分别精密称定，按照“供试品溶液制备”方法操作，测定，结果见表8。所测样品平均含量为33.77％，RSD为0.17％，表明供试品重复性良好。

表8  重复性试验结果

⑧测定方法

(一)红景天多糖的精制  取大花红景天药材粉末100g，依次用250ml石油醚(60～90℃)、乙醚回流1.5h，取过滤后的残渣，挥干溶剂；加入250ml 80％的乙醇回流1.5h，取过滤后的残渣，挥干溶剂；加5倍量蒸馏水回流提取2次，每次1.5h，抽滤，合并滤液，减压浓缩至一定体积，浓缩液加入等量的Sevag试剂除蛋白，反复进行5次；取上层液加无水乙醇使其含醇量达到80％，置于4℃冰箱中静置过夜，再离心分离(4000r/min，l0min)，沉淀依次用无水乙醇、丙酮反复洗涤5次，于50C减压干燥至恒重，即得精制红景天多糖。

(二)换算因素的测定  精密称取60℃干燥至恒重的大花红景天多糖21.03mg置于100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，即可。精密吸取0.6ml，按照“最大吸收波长的选择”项下方法，自“加水至1.0ml”起操作，另取1.0ml水为空白，在486nm处测定吸光度。另精密吸取葡萄糖对照品溶液0.6ml，同法操作，测定吸光度。按照下面公式计算换算因素f：

换算因素 $f=\frac{W*1000}{C*D}$

W：称取多糖的重量(μg)，C：溶液中多糖液中葡萄糖单糖的重量(μg)，D：多糖的稀释倍数。计算得f＝2.14。

(三)样品测定：精密吸取样品溶液0.6ml，按照“最大吸收波长的选择”项下方法，自“加水至1ml”起操作，另取1.0ml水为空白，在486nm处测定吸光度。另精密吸取葡萄糖对照品溶液0.6ml，同法操作，测定吸光度。按照下面公式计算样品中红景天多糖的含量：

C：样品提取液中按标准曲线计算出的葡萄糖的量(μg)D：多糖的稀释倍数  f：换算因素  W：样品重量(g)

⑨提取物中多糖含量测定测定

取各大花红景天提取物粉末12mg，精密称定，按照“样品溶液制备”方法操作，测定，以相应试剂为空白，在486nm处测定吸收度，并计算其含量。测定结果见表9。

表9  不同来源药材中红景天多糖含量测定结果(n＝3)

由表9可知，10批大花红景天提取物中红景天多糖含量在33.52～33.81之间，平均含量为33.73％。由此，暂定大花红景天按干燥品计算，含红景天多糖不得少于30.0％。

(5)多酚的含量测定

①显色剂的配制

盐酸溶液的配制  精密吸取浓盐酸适量于1000ml的容量瓶中，用水稀释并定容至刻度，摇匀，配制成0.10moL/L的溶液，即得。

铁氰化钾溶液的配制  精密称取铁氰化钾0.65852g于250ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.008moL/L铁氰化钾溶液。

三氯化铁溶液的配制  精密称取三氯化铁4.05525g于250ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.100moL/L三氯化铁溶液。

②对照品溶液的制备  精密称取没食子酸对照品12.50mg于25ml量瓶中，丙酮-水(1∶1)溶解并加至刻度，得到0.5mg/ml的对照品溶液。精密吸取该溶液1ml于10ml量瓶中，加入丙酮-水(1∶1)至刻度，配成50ug/ml对照品溶液。

③供试品溶液的制备  取大花红景天粉末50mg，精密称量，加入适量内酮-水(1∶1)溶解并定容10ml容量瓶中，摇匀，即得。

④最大吸收波长的选择

分别精密称吸取没食子酸对照品溶液0.5ml、供试品溶液0.6ml分别置于25ml量瓶中，依次加入0.100moL/L三氯化铁溶液0.5ml、0.008moL/L铁氰化钾溶液0.5ml和0.10moL/L盐酸溶液0.5ml，定容，同时在25ml量瓶中加入0.100moL/L三氯化铁溶液0.5ml、0.008moL/L铁氰化钾溶液0.5ml和0.10moL/L盐酸溶液0.5ml，定容后得到空白溶液，在600～900nm之间扫描。结果表明，对照品溶液和供试品溶液在738nm处有最大吸收峰，故选择738nm作为测定波长。

⑤标准曲线的制备  精密移取对照品溶液0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml分别置于25ml量瓶中，按照“最大吸收波长的选择”项下方法，在738nm处测定吸光度。以吸光度(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线，得没食子酸的浓度C与吸光度A之间的回归方程为：A＝0.4877C+0.0649，r＝0.9995(线性范围0.4～1.6μg/ml)，见表10。

表10  标准曲线的制备

⑥精密度试验

取同一份没食子酸对照品溶液，重复测定6次，其RSD为0.17％。结果见表11，表明仪器设备精密度良好。

表11  精密度实验结果

⑦稳定性试验

取没食子酸标准溶液0.5ml，按“最大吸收波长的选择”操作显色，每30min测定一次吸光度。结果见表12，表明在3小时内吸光度基本保持恒定，稳定性良好。

表12  稳定性试验结果

⑧重复性试验

取同一大花红景天提取物5份，每份50mg，分别精密称定，按照“最大吸收波长的选择”方法操作，测定，结果见表13。所测样品平均含量为9.55％，RSD为1.44％，表明供试品重复性良好。

表13  重复性试验结果

⑨提取物样品中多酚测定

取各大花红景天提取物粉末各50mg，精密称定，按照“样品溶液制备”方法操作，测定，以相应试剂为空白，在738nm处测定吸收度，并计算其含量。测定结果见表14。

表14  不同来源药材中红景天多酚含量测定结果(n＝3)

结果10批大花红景天药材中红景天多酚含量在37.17～37.55％之间，平均含量为37.41％。由此，暂定大花红景天按干燥品计算，含红景天多酚不得少于34.0％。

实施例3  本发明大花红景天提取物的制备方法的筛选

1 提取溶媒的选择

大花红景天中所含红景天苷极性较大，在水、乙醇等亲水性溶剂中溶解度较好。本实验以红景天苷、浸出物的含量为评价指标，考察水和30％、50％、70％、95％的乙醇对红景天苷的提取效率，筛选大花红景天药材的最佳提取溶媒，方法是称取大花红景天粗粉50g，置于1000ml烧瓶中，加10倍量70％的乙醇回流提取1次，提取时间为1h，过滤，取滤液2ml于10ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，过0.45um微孔滤膜后测定。结果见表15。

表15  不同提取溶媒红景天苷含量

注：红景天苷含量＝提取液中红景天苷量/称取的药材量*100％

实验结果显示，以70％乙醇作为提取溶媒时，提取液中红景天苷含量最高，浸出物含量也较高，故确定70％乙醇为提取大花红景天药材的溶媒，并进一步以正交试验考察提取工艺条件。

2 正交试验设计优化提取工艺

2.1 因素水平设置

溶剂法提取中影响提取效率的因素主要有溶媒用量、提取时间及提取次数等。根据生产实际，设置醇用量、提取时间及提取次数为3个考察因素，因素水平设置见表16。

表16  因素水平表

2.2 实验安排及结果

考察影响提取效能的主要因素乙醇用量、提取时间、提取次数及相应水平，选取正交表L₉(3⁴)作正交试验，所选因素-水平见表16。称取大花红景天药材约50g，按L₉(3⁴)正交试验表按排试验，以红景天苷含量(红景天苷含量＝提取液中红景天苷质量/称取的药材量*100％)为评价指标。试验方案及结果分析见表17，表18。

表17  L₉(3⁴)正交试验表(m＝2)

表18  方差分析表

直观分析结果，因素A：III＞II＞I；因素B：III＞II＞I；因素C：I＞III＞II；方差分析结果，因素A为主要因素；因素B为重要因素，但因素B中II和III相差甚小，所以选择水平II；因素C为次要影响因素，选择水平I。可预测优化工艺条件为：A₃B₂C₁，即：10倍量70％乙醇，回流2次，每次1小时。

2.3 验证试验

以优化工艺条件A₃B₂C₁重复试验3次，结果表明所选工艺条件红景天苷含量最高，且重现性好，见表19。

表19  验证试验结果

2.4 小结

以红景天苷的含量为评价指标，选用正交表L₉(3⁴)作正交试验考察提取工艺条件，确定大花红景天药材提取的工艺条件为：以70％乙醇为提取溶媒，10倍量，回流提取2次，每次回流提取1小时。在该工艺条件下，红景天苷的提取效率最高，为下一步纯化大花红景天提取物奠定了基础。

3 大花红景天纯化工艺

影响大孔吸附树脂技术吸附分离效果的因素，首先是大孔吸附树脂的类型，包括其极性、孔径、强度的影响，其次是上样液性质及吸附等条件的影响。本实验首先以静态吸附容量及固形物筛选树脂类型，然后在静态吸附条件下，考察了上样液生药浓度和最大上样量，最终确定了大孔吸附树脂纯化大花红景天提取物的工艺条件与参数。

3.1 树脂类型的筛选

本实验以红景天苷的吸附量与固形物为评价指标，考察了五种不同极性的大孔树脂树脂在纯化大花红景天红景天苷成分方面的效果，以确定纯化大花红景天提取物的大孔吸附树脂类型。各类大孔吸附树脂物理性能见表20。

表20  各类大孔吸附树脂物理性能

3.1.1 上柱液的制备及红景天苷的含量测定

称取大花红景天药材适量，按所确定的优化工艺条件提取，回收乙醇至无醇味，加一定量水稀释，离心30min(5000r/min)，取上清液定容至一定体积，即得上柱液(每1ml相当于原生药0.1g)。

3.1.2 树脂预处理及沉降系数的测定

取各型树脂适量，烘干称重W，加95％乙醇浸泡至充分溶胀，湿法装柱，以95％乙醇洗脱至乙醇液与水混合(1∶2)不呈白色混浊，用去离子水洗至无醇味，待树脂在水中沉降完全后测定其体积V，ρ＝W/V，结果见表21。

表21  各型树脂的沉降密度

3.1.3 不同类型大孔吸附树脂静态吸附性能的考察

量取各型树脂(干重约2g)置150ml具塞锥形瓶中，分别精密加入大花红景天提取液50ml(生药浓度为0.1g/ml)，静置24h，前7小时每半小时振摇一次，测定各树脂在t时刻(t＝0h、2h、4h、6h、7h、24h)药液中红景天苷的浓度，并计算树脂吸的吸附量Q(mg)(结果见表8)，以Qt对t作图，得各大孔吸附树脂吸附后剩余红景天苷曲线，见图1。再过滤除去大孔吸附树脂，把所得的滤液置于洗净并干燥至衡重的蒸发皿中回去溶剂，测定固形物的重量，并计算红景天苷在固形物中的百分含量，结果见表22。

表22  各型树脂的吸附量

注：(1)吸附量＝上样中红景天苷量(mg)-泄漏液中红景天苷量(mg)(以下同)

(2)解吸率＝[解吸液中红景天苷量(mg)÷吸附量(mg)]×100％

由图可知，各型树脂在7小时时就达到吸附平衡，HPD₈₂₆对大花红景天苷的吸附量最大。

3.1.4 各型大孔吸附树脂静态洗脱性能的考察

在上述吸附饱和的各型大孔吸附树脂中，分别加入100ml95％的乙醇，静置24h，前5h每隔半小时振摇一次，过滤，将滤液浓缩并定容与10ml容量瓶中，测定红景天苷的含量，根据吸附量计算解析率(％)。解析率＝CV/Q，式中C为滤液中红景天苷的浓度(mg/g)，V为滤液的体积(ml)，Q为大孔吸附树脂的吸附量(mg/g)。结果见表23。

表23  各大孔吸附树脂的解析率

静态吸附试验和静态试验表明，所考察的几种树脂中HPD₈₂₆有最大吸附量和最大解析率，分别为21.75mg/g和93.42％。因而认为HPD₈₂₆大孔吸附树脂适用于红景天苷分离纯化。

3.2 各型大孔吸附树脂纯化工艺动态吸附阶段

(1)上样药液生药浓度的确定

量取一定体积的药液，分别稀释成不同浓度，通过装有约4g HPD₈₂₆树脂的吸附柱中，以2ml/min流速进行吸附，收集流出液，测定红景天苷量，计算树脂比吸附量，结果见表24。

表24  上样浓度考察结果

注：比吸附量＝吸附量(mg)/树脂干重(g)(以下同)

其中，当生药浓度为0.05～0.25g/ml时，红景天苷浓度约为0.65～3.25mg/ml。

结果表明，上样药液生药浓度为0.10g/ml时，HPD₈₂₆大孔吸附树脂对红景天苷的比吸附量最大。故上样浓度以0.10g药材·ml^-1为宜。

(2)径高比的考察

大孔吸附树脂柱内径与其柱高的比例是影响大孔吸附树脂吸附效果的因素之一。合适的径高比可为分离提供较高的柱效，从而更有利于大孔树脂的吸附和分离。量取3g、4g、5g HPD₈₂₆树脂，分别湿法装柱于同一型号(内径1.5cm，长30cm)的柱子中，径高比分别为(1.5/7.1、1.5/10、1.5/13)，取一定体积药液(生药浓度为0.1g/ml)上样，在2ml/min的流速下进行吸附，收集流出液，测定红景天苷含量，计算树脂比吸附量，结果见表25。

表25  动态吸附径高比考察结果

结果表明，当吸附径高比为1.5/10时，HPD₈₂₆树脂对红景天苷的比吸附量最大。

(3)吸附流速的考察

将70ml的药液(生药浓度为0.1g/ml)，通过已经处理好的装有约4gHPD₈₂₆型树脂的吸附柱(径高比为1.5/10)中，分别以1、2、3、4、5、6ml/min的流速进行动态吸附，收集流出液，测定红景天苷量，计算树脂比吸附量。结果见表26。

表26  吸附流速的考察结果

结果表明，流速为1、2、3ml/min时，HPD₈₂₆型大孔吸附树脂对红景天苷的吸附量都比较大，虽然较低的流速对吸附有利，但流速过低，操作时间长，在实际生产中应考虑缩短生产周期问题，故确定最佳吸附流速为2ml/min。

(4)动态泄漏曲线

依照上述确定的工艺参数，将总体积为100ml的药液(生药浓度为0.1g/ml)通过约4gHPD₈₂₆型树脂柱，以2ml/min的流速进行动态吸附，分段收集流出液，每10ml收集一次，测定流出液中红景天苷含量，计算泄漏百分率。结果见表27，绘制动态泄漏曲线，见图2。

表27  最大上样量考察

结果分析：由测定结果可知上样至第5份时累积泄露百分率超过5％；从泄露曲线可以看出第5份未吸附红景天苷明显增大，说明上样至第4份时红景天苷开始明显泄露，即树脂比上柱量为0.25～1g/g(药材/干树脂)时，可防止有效成分的泄露，然而考虑到原料的利用率，故确定树脂比吸附量为12.59mg/g，树脂比上柱量为1g/g(药材/干树脂)。

3.3 HPD₈₂₆型树脂纯化工艺动态解析阶段

(1)水洗用量的选择

红景天苷作为主要的功效成分，但在用水洗脱吸附药液后的树脂柱时，大量的红景天苷被水洗脱下来，因此，有必要对水洗脱用量进行考察，以确保水洗脱下的红景天苷最小，减少红景天苷的损失。按照上述确定的工艺，取6份40ml的药液(生药浓度为0.1g/ml)通过6根装有4gHPD₈₂₆型树脂柱(径高比为1.5/16)进行动态吸附，分别用蒸馏水0.5、1、2、3、4、5BV的水进行洗脱，同时对洗脱液进行MoLish反应，并测定洗脱中红景天苷的含量，计算红景天苷的损失率，结果见表28，图3。

表28  水洗条件的考察

“+”代表MoLish反应为阳性，“+”越多表明MoLish反应阳性越强；损失率＝水洗脱红景天苷量/(上样红景天苷量-未吸附红景天苷量)*100％

结果表明，用0.5BV蒸馏水洗脱，不仅保证红景天苷的损失量达到最小，同时，MoLish反应也基本达到阴性。所以，确定洗脱蒸馏水的用量为0.5BV。

(2)洗脱剂的选择

按上述确定的工艺条件，取5份40ml的药液(生药浓度为0.1g/ml)通过5根装有4gHPD₈₂₆型树脂柱(径高比为1.5/16)进行动态吸附，先用0.5BV蒸馏水洗脱，再分别用10％乙醇，20％乙醇，30％乙醇，40％乙醇，50％乙醇，95％乙醇各150ml洗脱，收集洗脱液测定红景天苷量及固形物量，计算红景天苷含量及洗脱率，结果见表29。

表29  洗脱剂的考察

洗脱率(％)＝洗脱成分质量/(上样液成分质量-过柱流出液成分质量-水洗脱部分成分质量)*100％

结果表明，不同比例的乙醇都可将红景天苷不同程度的洗脱下来。本实验以洗脱率和洗脱物中红景天苷的纯度综合考虑选择最佳洗脱剂，由上述结果可知，30％乙醇解析效率最高，其洗脱率和红景天苷纯度分别为94.84％、12.18％，故选择30％乙醇为洗脱剂。

(2)洗脱溶媒用量的确定

取药液(生药浓度为0.1g/ml)40ml依法上柱，先用0.5BV蒸馏水洗，再用200ml30％乙醇洗脱，洗脱速度分别为2ml/min，每20ml收集一次流份。测定各流份中红景天苷及固形物量，计算洗脱率与红景天苷纯度，结果见表30。

表30  洗脱试验数据

由测定结果和洗脱曲线图4可知：在第5份即洗脱剂用量为100ml时，能将大部分红景天苷解吸下来，但为了获得将红景天苷尽可能的洗脱下来，建议洗脱剂用量为6倍量树脂柱体积。

3.4 树脂重复使用次数的考察

一般而言，在吸附若干次后，吸附剂的吸附能力会显著下降，分离效果明显降低。其影响因素很多，其中样品和洗脱剂的类型非常重要。本试验以树脂对红景天苷的吸附量为指标，考察HPD₈₂₆型树脂的重复使用的次数。按上述确定的吸附、洗脱条件，取样品溶液进行上柱、吸附和洗脱，在同一根柱子上重复操作5次，分别计算红景天苷比吸附量，结果见下表31。

表31  树脂重复使用后红景天苷比吸附量的变化

由表可知，随着大孔树脂吸附柱使用次数的增加，树脂对红景天苷吸附量明显下降，树脂重复使用3次后，红景天苷比吸附量下降约66％需要再生才可继续使用。

3.5 工艺验证

按上述确定的工艺条件进行验证实验，结果见下表32。

表32  HPD₈₂₆型树脂纯化红景天提取物的工艺验证结果

※精制度＝(30％乙醇洗脱液固形物中红景天苷纯度/上柱液固形物中红景天苷纯度)×100％。

结果表明：红景天提取物经大孔树脂纯化后有效地降低了固形物的含量，提高了红景天苷的含量，红景天苷的平均精制度达306.39％，该工艺稳定、可行。

3.6 干燥与成型工艺研究

真空干燥具有干燥温度低，干燥速度快，能减少物料与空气接触，避免污染或氧化变质，产品松脆，易于粉碎等特点，故可对经大孔吸附树脂纯化、减压回收浓缩至稠膏的大花红景天提取物进行真空干燥的方法，制备大花红景天提取物浸膏粉。

将大孔吸附树脂纯化、减压回收浓缩至稠膏的同一批大花红景天提取物等分成3份，置减压干燥器中，分别在35℃、45℃、55℃的条件下干燥24h，测定浸膏粉中水分与红景天苷含量，结果见表33。

表33  干燥温度的考察

结果显示，在三个温度下，大花红景天提取物浸膏粉中水分含量变化不大，考虑成本等因素，选择45℃作为大花红景天提取物的干燥温度。

3.7 小结

本实验采用大孔树脂吸附法富集、纯化红景天苷，系统考察了影响树脂纯化效果的不同因素水平，确定优化工艺条件为：以HPD₈₂₆大孔吸附树脂纯化红景天苷，上样液生药浓度为0.1g/ml(红景天苷浓度约1.28mg/ml)，径高比为1.5/10，上样量为每g树脂1.0g生药，吸附速率为2ml/min，吸附平衡后，以蒸馏水0.5BV、30％乙醇6BV依次洗脱，洗脱速率为2ml/min，回收乙醇，备用。以此优化工艺条件纯化红景天提取物可达到较好的纯化效果，红景天苷的精制度达到306.39％，固形物收率达31.45％，红景天苷纯度达12.16％。

以下通过药效学试验证明本发明的有益效果。

试验例1不同红景天提取物主要药效学比较研究

目前，市场销售的红景天类提取物主要有两种：一种是红景天提取物；一种是大花红景天提取物。

红景天提取物以红景天(Rhodiola rosea L.)为原料加工制成的提取物，主要含红景天苷、酪醇、多酚等物质，其中的rosavin是其特有的成分，欧美企业标准将其rosavin和红景天苷一起作为红景天提取物的质量控制指标。红景天提取物的原料红景天主要分布在欧洲北部、俄罗斯、蒙古、朝鲜以及日本；在我国，红景天在新疆阿尔泰山区等地有少量分布，但不具备作为红景天提取物原料利用的价值。

大花红景天提取物以大花红景天(R.crenuata(Hook.f.et Thomx.)H.Ohba)为原料加工而成，主要含红景天苷、酪醇、多酚等物质，不含有rosavin，大花红景天提取物主要以红景天苷为质控指标。大花红景天为《中国药典》收载品种。我国大花红景天资源丰富，且蕴藏量大，尤其是西藏、四川、云南等广大的西部地区，是大花红景天的主要产区，具有很强的开发利用价值。通过小鼠的抗疲劳、耐缺氧实验，对红景天提取物与大花红景天提取物在药理作用方面的是否存在差异进行探讨。

1 供试品的制备

1.1 试验动物  昆明种雄性小白鼠200只，体重(18～22)g，由成都中医药大学验动物中心提供。实验动物许可证号：SCXK(川)2008-11。

1.2 供试品的制备  红景天提取物(红景天苷3％和rosavin3％，市售)；大花红景天提取物B(红景天苷3％，由提取物C稀释得到)；大花红景天提取物C(红景天苷12％，实施例1制备得到)；市售菜籽油；猪油(自制)。

2 实验方法

实验组分为红景天提取物A组(含3％的红景天苷和3％rosavin)、大花红景天提取物B组(含3％的红景天苷)、大花红景天提取物C组(含12％的红景天苷)3个提取物组，各提取物组以3.0(高)、2.0(中)、1.0(低)g·(kg·d)^-1的剂量灌胃给药，空白对照组灌胃等量的蒸馏水。

2.1 红景天提取物和大花红景天提取物对小鼠抗疲劳时间的影响

取昆明种小鼠100只按体重随机分为10组，每组10只。其中，各实验组分别以1.0(低)、2.0(中)、3.0(高)g·(kg·d)^-1的红景天提取物灌喂给药，对照组灌喂同样体积[0.2ml·(kg·d)^-1]蒸馏水。连续给药5d。末次灌喂30min后在小鼠尾根部各负荷体重5％的铅丝。入50cm×40cm×40cm水箱游泳，水温(30±2)℃。以小鼠头部沉入水中，经10s仍不能返回水面视为力竭。记录游泳开始时间至力竭的时间作为小鼠游泳时间。

2.2 红景天提取物和大花红景天提取物对小鼠耐缺氧时间的影响

取昆明种小鼠100只按体重随机分为10组，每组10只。其中，各实验组分别以1.0(低)、2.0(中)、3.0(高)g·(kg·d)^-1的红景天提取物灌喂给药，对照组灌喂同样体积[0.2ml·(kg·d)^-1]蒸馏水。连续灌胃5d，末次灌喂30min后将小鼠放入300ml磨口广口瓶中，密封(瓶内放碱石灰10g以吸收CO₂和H₂O，垫滤纸以吸收尿液，广口瓶用前均盛水校正容量，每瓶放一只小鼠)，以呼吸停止为指标，记录小鼠的存活时间。

2.3 红景天提取物、大花红景天提取物对油脂抗氧化作用的影响

称取菜籽油、猪油各6份，每份20g，置12个250ml锥形瓶中。其中一份加人5ml无水乙醇作为空白；其余五份分别加入5ml0.1％的VC；5ml0.02g/ml的市售红景天提取物；5ml0.02g/ml的自制组A提取物；5ml0.02g/ml的自制组B提取物；充分振摇后，置(65+1)℃恒温干燥箱中，在24h、48h、72h、96h、120h时称取油2.0g用氯仿作溶剂进行过氧化值(POV)的测定，每次取样后均充分振摇锥形瓶，以混入足够的空气。油脂过氧化值(POV值)得测定参照GB/T-5538-1995测定，并按下式计算POV值：

$\mathrm{POV}(\mathrm{meq}/\mathrm{kg})=\frac{c(V_1-V_0)}{m}\×100\%$

式中：V₁-用于测定的硫代硫酸钠标准溶液(6.6)的体积，ml；

      V₀-用于测定空白的硫代硫酸钠标准溶液(6.6)的体积，ml；

      c-硫代硫酸钠标定浓度moL/L；

      m-试样的质量，g。

3 统计学处理  采用SPSS 16.0统计软件进行处理，计量资料以平均值±标准差()表示，组间比较采用单因素方差分析，检验水准α＝0.05。

4 实验结果

4.1 不同提取物对小鼠抗疲劳时间的影响，结果见表34。

表34  不同提取物对小鼠游泳时间的影响

与对照组相比*P＜0.05，**P＜0.01；同剂量下各提取物组相比#P＜0.05；同一提取物内高、低剂量相比P＜0.05。

由表34可见，各红景天提取物组高、中、低3个剂量组和对照组比较，均可提高小鼠抗疲劳的时间，其中红景天提取物A组、大花红景天提取物B组的高剂量、大花红景天提取物C组的中、高剂量与对照组比较(P＜0.01)，有极显著的差异；红景天提取物A组、大花红景天提取物B组以及大花红景天提取物C组的低剂量与对照组比较(P＜0.05)，有显著的差异。同等剂量下，红景天提取物A组与大花红景天提取物B组比较(P＞0.05)，没有显著差异；大花红景天提取物C组与红景天提取物A组、大花红景天提取物B组比较(P＜0.05)，有显著差异。在同一提取物组中，高剂量与低剂量比较(P＜0.05)，有显著差异。

4.2 不同提取物对小鼠抗疲劳时间的影响，结果见表35。

表35  不同提取物对小鼠缺氧的影响

与对照组相比*P＜0.05，**P＜0.01；同剂量下各提取物组相比#P＜0.05；同一提取物内高、低剂量相比P＜0.05。

由表35可见，各红景天提取物组高、中、低3个剂量组和对照组比较，均可提高小鼠抗疲劳的时间，其中大花红景天提取物C组的高低剂量与对照组比较(P＜0.01)，有极显著的差异；红景天提取物A组、大花红景天提取物B组的高剂量以及大花红景天提取物C组的中、低剂量与对照组比较(P＜0.05)，有显著的差异。同等剂量下，红景天提取物A组与大花红景天提取物B组比较(P＞0.05)，没有显著差异；大花红景天提取物C组与红景天提取物A组、大花红景天提取物B组比较(P＜0.05)，有显著差异。在同一提取物组中，高剂量与低剂量比较(P＜0.05)，有显著差异。

4.3 不同提取物对菜籽油、猪油抗氧化作用的影响，结果见图5，图6。

由图5、图6可见，红景天提取物对两种油脂都有明显的抗氧化效果，大花红景天提取物抗油脂氧化作用明显明显强于红景天提取物。油脂的氧化历程主要是自由基连锁反应，包括三个阶段(RH表示油脂)。

引发反应：RH+O₂→R·+·OOH    RH→R·+·H

自由基的传递：R·+O₂→ROO·    ROO·+RH→R·+ROOH

反应终止：ROO·+R·→ROOR     R·+R·→RR

红景天中含有的酚性物质红景天苷及其苷元和多酚；以及挥发油类物质(以HA表示)易失去H·，即将H·提供给ROO·或R·生成相对稳定的自由基A·，即：

ROO·+AH→ROOH+A·

R·+AH→RA+A·

从而延长了脂肪氧化的诱导期，终止了油脂氧化链式反应的传播，起到了油脂抗氧化剂的作用。

5 小结

本实验首次对红景天提取物和大花红景天提取物进行抗疲劳、耐缺氧、抗氧化的对比研究，由实验结果看出，在抗疲劳、耐缺氧方面，两种不同的红景天提取物都具有抗疲劳、耐缺氧的效果，且与红景天苷呈量效关系。红景天苷含量相同时，同等剂量下，含有rosavin的红景天提取物与不含rosavin的大花红景天提取物B组抗疲劳、耐缺氧时间没有显著差异(P＞0.05)，当红景天苷、多糖、多酚含量提高时，却能显著地延长抗疲劳和耐缺氧的时间；在抗氧化上，大花红景天提取物作用也明显强于红景天提取物。由此推断，rosavin可能只是红景天提取物的一个标志成分。

大花红景天提取物B为本发明红景天提取物C的稀释产物，其中含有与市售红景天提取物相近的红景天苷含量(3％)，但不含有rosavin，药效实验表明，该提取物B能够达到与市售红景天提取物相当的药效，这就表明，利用本发明方法制备的大花红景天提取物中含有的其他成分(多糖、多酚)能够达到rosavin相类似的药效；同时，实验也表明本发明大花红景天提取物C在同等剂量下的药效显著优于市售红景天提取物。

综上所述，本发明提取物的制备方法，与03116051.4公开的一种红景天有效成分提取物的制备方法相比，省去了有机试剂进行萃取的过程，更适合工业化生产，减少环境污染，且本发明方法制备得到的大花红景天提取物比现有方法所得提取物药效更优；本发明大花红景天提取物虽然不含有指标成分rosavin，但仍然能够起到良好药效作用，并且显著优于含有rosavin的市售红景天提取物，为临床提供了一种新的用药选择。

Claims (3)

1.一种大花红景天提取物，其特征在于：该提取物中含有红景天苷的重量百分含量为11％～13％；含有红景天多糖的重量百分含量为30～35％；含有红景天多酚的重量百分含量35～40％，rosavin含量为0％；

该提取物是由如下方法制备得到的：

a、取大花红景天，加入10倍量70％乙醇，回流提取2次，每次回流提取1小时，得大花红景天醇提取物；

b、选用HPD₈₂₆大孔吸附树脂，取a步骤制得的大花红景天醇提取物上样至树脂达饱和吸附，停止上样，以蒸馏水0.5BV、30％乙醇6BV依次洗脱，洗脱速率为2ml/min，收集乙醇洗脱部位，回收乙醇，干燥，即得大花红景天提取物；

b步骤中，上样具体操作如下：所述的上样液生药浓度为0.10g/ml，吸附柱的径高比为1.5∶10，上样量为每g树脂1.0g生药，吸附速率为2ml/min。

2.根据权利要求1所述的大花红景天提取物，其特征在于：含有红景天苷的重量百分含量为11.9％～12.2％；含有红景天多糖的重量百分含量为33.5～33.9％；含有红景天多酚的重量百分含量37.1～37.6％。

3.一种制备权利要求1或2所述的大花红景天提取物的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

a、取大花红景天，加入10倍量70％乙醇，回流提取2次，每次回流提取1小时，得大花红景天醇提取物；

b、选用HPD₈₂₆大孔吸附树脂，取a步骤制得的大花红景天醇提取物上样至树脂达饱和吸附，停止上样，以蒸馏水0.5BV、30％乙醇6BV依次洗脱，洗脱速率为2ml/min，收集乙醇洗脱部位，回收乙醇，干燥，即得大花红景天提取物；

b步骤中，上样具体操作如下：所述的上样液生药浓度为0.10g/ml，吸附柱的径高比为1.5∶10，上样量为每g树脂1.0g生药，吸附速率为2ml/min。 

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