CN106187975B - 一种提高米糠酚类物质生物活性的制备及纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高米糠酚类物质生物活性的制备及纯化方法，包括以下步骤:步骤一：将脱脂米糠粉碎成颗粒，加入乙醇水溶液，封紧浸提容器口部后，室温下振摇浸提后离心，收集上清浸提液；步骤二：将浸提液减压浓缩至无乙醇，用蒸馏水将浓缩液稀释；步骤三：选用预处理过的HPD722大孔吸附树脂进行湿法装柱，将上述稀释过的米糠酚类物质浸提液上样；步骤四：用蒸馏水洗去杂质，待洗出液无混浊时，换用乙醇水溶液作为洗脱剂开始洗脱；步骤五：将洗脱液减压浓缩至无乙醇，真空冷冻干燥得到纯化的米糠酚类物质提取物。本发明提供的方法能够分离制备出高生物活性米糠酚类物质。

Description

一种提高米糠酚类物质生物活性的制备及纯化方法
技术领域
本发明涉及功能食品制备领域，尤其涉及一种可提高生物活性的米糠酚类物质的制备及纯化方法。
背景技术
米糠是稻米加工过程中产生的副产物，我国每年生产的米糠约合1600万吨，研究发现米糠中富含不饱和脂肪酸、蛋白质、膳食纤维等营养成分和γ-谷维素、多酚等植物活性物质。且近来的研究表明，进食全谷物较精谷物对促进人体健康有重要作用，其中全谷物在其糠麸层中富集的酚类物质具有重要作用。因此，分离制备米糠酚类物质，探究其生物活性对于指导米糠的精深加工利用，揭示全谷物的健康促进作用有重要意义。
由于米糠原料中多富含蛋白、碳水化合物等其它成分，其酚类物质提取物往往含有较多的杂质，需要进一步进行纯化除杂才能得到多酚含量较高的酚类物质。目前，优化酚类物质提取纯化工艺时，都是以提取物中酚类物质含量为评价指标。由于酚类物质种类丰富，即使在同一原材料中，也往往有多达数十种的酚类成分共同存在。不同的种类和浓度的溶剂因为其极性差异，对酚类物质的提取效果会存在差异，导致其所得到的酚类提取物各酚类单体成分的构成比例不同。同样的，酚类物质的纯化有C18硅胶柱层析、聚酰胺柱层析、葡聚糖凝胶柱层析等方法所适宜纯化的酚类物质种类会有所不同。现有技术中都是以其吸附和解析附酚类物质的程度来确定适宜纯化某种来源的酚类物质的纯化方法。
尽管在活性物质的分离纯化过程中，也有研究者会对其活性进行分析，但往往是测定DPPH自由基清除活性，ORAC等化学体系抗氧化活性。这些方法测定的抗氧化活性往往与酚类物质含量呈现明显的线性相关关系。随着对植物活性物质的生物活性研究的不断深入，近来的研究发现植物活性物质发挥某种生物活性的往往不是某种单一的化学成分而是一组成分共同作用的结果。这一组成分的构成谱，即各成分的含量构成比可能会直接影响整个成分群生物活性的大小。某些物质在化学体系中测定出较强的抗氧化活性，但通过细胞抗氧化等生物体系方法进行测定时，其活性却很低。对糙米中酚类物质的细胞抗氧化活性进行分析时发现：糙米的游离酚和结合酚的含量分别为62.0mg GAE/100g和37.3mg GAE/100g，然而其细胞抗氧化活性则分别为53.7μmol QE/100g和124.2μmol QE/100g，前者的多酚含量是后者的1.7倍，而其细胞抗氧化活性却只有后者的43％。但当采用化学分析方法测定其ORAC抗氧化活性时，游离和结合部的活性分别为3462μmol TE/100g DW和842μmol TE/100g DW。可以看出：采用ORAC这一化学的抗氧化分析方法所测定的抗氧化活性与其多酚含量有很好的一致性，但CAA活性却与多酚含量有明显的差距。因此，通过现有传统的分离纯化得到的酚类物质尽管会达到较高的提取率和酚类物质含量的目标，但是否为最有利于富集其高生物活性酚类成分的分离纯化方法却值得进一步探究。
发明内容
本发明提出了一种提高米糠酚类物质生物活性的制备及纯化方法，目的在于克服现有的酚类物质分离制备方法得到的酚类物质细胞抗氧化活性低的缺陷。
本发明的技术方案是这样实现的：一种提高生物活性米糠酚类物质生物活性的制备及纯化方法，包括以下步骤:
步骤一：将脱脂米糠粉碎成颗粒，按照料液的质量体积比1：(4-6)加入体积百分数为65-75％的乙醇水溶液，封紧浸提容器口部后，室温下200-300rpm振摇浸提120-150min；3000-4000rpm离心10-15min，收集上清浸提液；
步骤二：将浸提液在45-50℃下减压浓缩至无乙醇，用蒸馏水将浓缩液稀释；
步骤三：选用预处理过的HPD722大孔吸附树脂进行湿法装柱，将上述稀释过的米糠酚类物质浸提液上样；
步骤四：用蒸馏水洗去杂质，待洗出液无混浊时，换用65-75％乙醇水溶液作为洗脱剂开始洗脱，收集黄色洗脱液，至树脂柱上黄色吸附成分被完全洗脱时停止收集；
步骤五：将洗脱液在45-50℃下减压浓缩至无乙醇，真空冷冻干燥得到纯化的米糠酚类物质提取物。
优选的，步骤一中收集完上清浸提液后，将残渣按前述条件重复浸提一次，合并两次浸提液。
优选的，步骤一中将脱脂米糠粉碎成小于80目的颗粒。
优选的，步骤二中用蒸馏水将浓缩液稀释至酚类物质含量为1.0-1.5mg/mL。
优选的，步骤三中稀释过的米糠酚类物质浸提液按照2-3BV/h的流速上样，上样体积为3-4BV。
优选的，步骤四中洗脱流速为2.5-3.5BV/h。
优选的，步骤四中收集完洗脱液之后换用蒸馏水3-4BV冲洗树脂柱，以备再次上样使用。
本发明的有益效果为：本发明选用乙醇作为浸提溶剂，所得提取液总的细胞抗氧化活性强，本发明选用的HPD722大孔树脂对米糠酚类物质的吸附量和解析率较HPD300和HPD100大孔树脂低5-10％不等，现有技术中均不采用，但采用本发明所述的纯化步骤、选用该种类型的大孔树脂进行纯化得到的米糠酚类物质较其它两种具备更高吸附解析能力的大孔树脂纯化所得的酚类物质的细胞毒性更低，且具有更高的细胞抗氧化活性。因此，本发明提供的方法能够分离制备出高生物活性米糠酚类物质。另外，本发明方法所得的具有较强细胞抗氧化活性的物质，也为进一步进行抗肿瘤等其他生物活性的研究和应用提供了广阔的前景。
具体实施方式
将脱脂米糠粉碎成小于80目的颗粒，按照料液的质量体积比1：(4-6)加入体积百分数为65-75％的乙醇水溶液，封紧浸提容器口部后，室温下200-300rpm振摇浸提120-150min；3000-4000rpm离心10-15min，收集上清浸提液；将残渣按前述条件重复浸提一次，合并两次浸提液；将浸提液在45-50℃下减压浓缩至无乙醇，用蒸馏水将浓缩液稀释至酚类物质含量为1.0-1.5mg/mL；选用预处理过的HPD722大孔吸附树脂进行湿法装柱，将上述稀释过的米糠酚类物质浸提液按照2-3BV/h的流速上样，上样体积为3-4BV；用蒸馏水洗去杂质，待洗出液无混浊时，换用65-75％乙醇水溶液作为洗脱剂开始洗脱，洗脱流速为2.5-3.5BV/h，收集黄色洗脱液，至树脂柱上黄色吸附成分被完全洗脱时停止收集，收集完洗脱液之后换用蒸馏水3-4BV冲洗树脂柱，以备再次上样使用；将洗脱液在45-50℃下减压浓缩至无乙醇，真空冷冻干燥得到纯化的米糠酚类物质提取物。
具体实施例一：将脱脂米糠粉碎成小于80目的颗粒，称取1kg米糠，按照料液的质量体积比1：4加入体积百分数为65％的乙醇水溶液，封紧浸提容器口部后，室温下200rpm振摇浸提150min；离心15min，收集上清浸提液；将残渣按前述条件重复浸提一次，合并两次浸提液；将浸提液在45℃下减压浓缩至无乙醇，用蒸馏水将浓缩液稀释至酚类物质含量为1.0mg/mL；选用预处理过的HPD722大孔吸附树脂进行湿法装柱，将上述稀释过的米糠酚类物质浸提液按照2BV/h的流速上样，上样体积为3BV；用蒸馏水洗去杂质，待洗出液无混浊时，换用65％乙醇水溶液作为洗脱剂开始洗脱，洗脱流速为2.5BV/h，收集黄色洗脱液，至树脂柱上黄色吸附成分被完全洗脱时停止收集，收集完洗脱液之后换用蒸馏水3BV冲洗树脂柱，以备再次上样使用；将洗脱液在45℃下减压浓缩至无乙醇，真空冷冻干燥得到纯化的米糠酚类物质。
具体实施例二：将脱脂米糠粉碎成小于80目的颗粒，称取1kg米糠，按照料液的质量体积比1：5加入体积百分数为70％的乙醇水溶液，封紧浸提容器口部后，室温下250rpm振摇浸提135min；3500rpm离心12min，收集上清浸提液；将残渣按前述条件重复浸提一次，合并两次浸提液；将浸提液在48℃下减压浓缩至无乙醇，用蒸馏水将浓缩液稀释至酚类物质含量为1.2mg/mL；选用预处理过的HPD722大孔吸附树脂进行湿法装柱，将上述稀释过的米糠酚类物质浸提液按照2.5BV/h的流速上样，上样体积为3.5BV；用蒸馏水洗去杂质，待洗出液无混浊时，换用70％乙醇水溶液作为洗脱剂开始洗脱，洗脱流速为3BV/h，收集黄色洗脱液，至树脂柱上黄色吸附成分被完全洗脱时停止收集，收集完洗脱液之后换用蒸馏水3.5BV冲洗树脂柱，以备再次上样使用；将洗脱液在48℃下减压浓缩至无乙醇，真空冷冻干燥得到纯化的米糠酚类物质。
具体实施例三：将脱脂米糠粉碎成小于80目的颗粒，称取1kg米糠至100mL具塞三角瓶，按照料液的质量体积比1：6加入体积百分数为75％的乙醇水溶液，封紧浸提容器口部后，室温下300rpm振摇浸提120min；3000rpm离心10min，收集上清浸提液；将残渣按前述条件重复浸提一次，合并两次浸提液；将浸提液在50℃下减压浓缩至无乙醇，用蒸馏水将浓缩液稀释至酚类物质含量为1.5mg/mL；选用预处理过的HPD722大孔吸附树脂进行湿法装柱，将上述稀释过的米糠酚类物质浸提液按照3BV/h的流速上样，上样体积为4BV；用蒸馏水洗去杂质，待洗出液无混浊时，换用75％乙醇水溶液作为洗脱剂开始洗脱，洗脱流速为3.5BV/h，收集黄色洗脱液，至树脂柱上黄色吸附成分被完全洗脱时停止收集，收集完洗脱液之后换用蒸馏水4BV冲洗树脂柱，以备再次上样使用；将洗脱液在50℃下减压浓缩至无乙醇，真空冷冻干燥得到纯化的米糠酚类物质。
从上述实施例一、二、三所得的米糠酚类物质提取物中各称取10mg，对其进行总酚含量、CAA活性检测，检测结果如表一所示。
表1不同实施例所得提取物多酚含量及细胞抗氧化活性结果
根据本发明的内容，用不同的浸提溶剂做了对比实验，具体的实验及结果如下：
实施例四：将脱脂米糠粉碎成小于80目的颗粒，称取5g米糠至100mL具塞三角瓶，按照料液的质量体积比1：5加入体积百分数为70％的乙醇水溶液，塞紧塞子后室温下300rpm振摇浸提120min，4000rpm离心10min，收集上清浸提液，残渣按上述条件重复浸提一次，合并两次浸提液；将浸提液在50℃下减压浓缩至无乙醇，用蒸馏水定容至20mL。
实施例五：将脱脂米糠粉碎成小于80目的颗粒，称取5g米糠至100mL具塞三角瓶，按照料液的质量体积比1：5加入体积百分数为70％的丙酮水溶液，塞紧塞子后室温下300rpm振摇浸提120min，4000rpm离心10min，收集上清浸提液，残渣按上述条件重复浸提一次，合并两次浸提液；将浸提液在50℃下减压浓缩至无丙酮，用蒸馏水定容至20mL。
实施例六：将脱脂米糠粉碎成小于80目的颗粒，称取5g米糠至100mL具塞三角瓶，按照料液的质量体积比1：5加入体积百分数为70％的甲醇水溶液，塞紧塞子后室温下300rpm振摇浸提120min，4000rpm离心10min，收集上清浸提液，残渣按上述条件重复浸提一次，合并两次浸提液；将浸提液在50℃下减压浓缩至无甲醇，用蒸馏水定容至20mL。
测定浸提液中总酚含量以及细胞抗氧化活性，比较不同溶剂对浸提液中酚类物质含量以及生物活性的影响。
表2：不同浸提溶剂所得米糠提取物的多酚含量及细胞抗氧化活性
注：同一列数字旁字母完全不同时，表示差异有统计学意义(p<0.05)
根据上面的结果，如果单独考虑多酚提取率，70％丙酮水溶液为最佳浸提溶剂，但是三种溶剂浸提所得米糠酚类提取物中单位重量酚类物质的细胞抗氧化活性以70％乙醇浸提液最高，当综合考虑浸提液的酚类物质含量和细胞抗氧化活性时，以70％乙醇作为浸提溶剂时所得提取液总的细胞抗氧化活性最强。
根据本发明的内容，不同极性大孔树脂对米糠酚类提取物吸附和解吸效果及其细胞抗氧化活性影响的对比实验与结果如下：
1)不同极性大孔树脂静态吸附量及解吸率测定：
树脂预处理：将大孔树脂用无水乙醇浸泡24h，待树脂充分溶胀后，再用无水乙醇淋洗直至洗出液加适量水无白色浑浊现象为止，再用蒸馏水洗至无醇味，备用。
称取经预处理的以下9种湿大孔吸附树脂HPD-100、HPD-200A、HPD-300、HPD-700、HPD-722、HPD-826、D101、ADS-17及AB-8各1.00g，分别加入100mL具塞三角瓶中，量取50mL总酚含量调整至0.2mg/mL的米糠酚类提取液于各三角瓶，室温下振荡24h，取上清液测定总酚含量(C1)，将树脂滤出并用去离子水清洗三次，用滤纸吸干表面水分，转入100mL具塞三角瓶中，加入50mL 80％乙醇，室温下振荡解吸12h，过滤去除树脂，收集所有洗脱液，减压浓缩至无乙醇，定容至10mL，用于测定总酚含量(C2)和细胞抗氧化活性。吸附量A(mg没食子酸当量(GAE)/g)＝10-50×C1；解析率D＝[(C2×10)/A]×100％。
2)总酚含量测定：总酚含量的测定方法如下：将旋蒸后的米糠酚类浸提液以及旋蒸后的大孔吸附树脂洗脱液用蒸馏水分别稀释到合适的浓度，向125μL待测样品溶液中加入0.5mL蒸馏水和125μL福林酚试剂。室温下避光静置6min后，加入1.25mL质量体积比为7％的Na2CO3溶液和1mL蒸馏水，振荡混匀，室温下避光反应90min，于760nm下测定其吸光度。以没食子酸为标准品，总酚含量以每ml浓缩液中所含没食子酸μg当量(GAE)表示，单位为μgGAE/mL。
3)细胞抗氧化活性CAA测定：将处于对数生长期的HepG2细胞悬液种到黑壁透明底96孔细胞培养板中，每孔100μL，细胞密度约为5×104/孔。培养板最外周各孔加入100μLPBS代替细胞悬液，以减少边缘效应造成的误差。细胞生长24h后，吸除培养基，用PBS 100μL/孔清洗各孔一次。然后将100μL含25μM DCFH-DA的不同浓度的槲皮素溶液或待测样品溶液(用MEM培养基溶解稀释)加入到相应孔中，空白对照孔和对照孔中加入只含有25μMDCFH-DA的荧光素检测液，每种处理设三个复孔，放入培养箱中继续培养1h。然后去除各孔中的处理溶液，用多通道移液器迅速向各孔中加入100μL ABAP溶液(514μM，临用前用PBS配制)，空白对照孔用PBS代替。迅速将细胞培养板放入荧光酶标仪中开始检测，测定条件为：激发波长485nm，发射波长520nm，12个循环，每个循环5min。绘制工作曲线计算槲皮素和样品的EC50值，以槲皮素EC50与样品EC50的比值为样品的CAA值，单位为μmol QE/mg总酚。
经24h静态吸附后HPD-300大孔树脂对米糠多酚提取物总酚的吸附量最高，为9.59mg GAE/g，其次是HPD-100，为8.84mg GAE/g，HPD-200A、HPD-700、HPD-722、D101和AB-8五种树脂对米糠多酚的吸附效果相当，以ADS-17的吸附效果最差。HPD-100、HPD-200A、HPD-300、HPD-700和HPD-722的解吸率相当，均在80％以上。进一步分析不同种类大孔树脂吸附的米糠酚类物质经80％乙醇解析后的洗脱液经旋蒸浓缩后的细胞抗氧化(CAA)活性可以发现，HPD-722大孔树脂洗脱液的CAA活性明显高于其它树脂，其次是AB-8，但由于AB-8的解析率较低，导致洗脱液中总酚含量偏低造成纯化的米糠酚类提取物得率太低。因此，根据表3的结果，如果仅以吸附量和解析率为考察指标时HPD-300无疑是最适合分离纯化米糠酚类提取物的大孔树脂类型，但是当以所得提取物的细胞抗氧化活性为跟踪指标时，同样10mL米糠酚类提取物，分别用9种大孔树脂吸附和解析处理后，其细胞抗氧化活性依次为464.4μmol QE(HPD-100)、391.6μmol QE(HPD-200A)、472.0μmol QE(HPD-300)、341.7μmol QE(HPD-700)、547.0μmol QE(HPD-722)、408.0μmol QE(HPD-826)、473.3μmol QE(D101)、278.8μmol QE(ADS-17)、450.3μmol QE(AB-8)可以看出HPD-722为最佳的树脂类型。
表3不同类型大孔树脂对米糠酚类提取物吸附和解吸效果及其细胞抗氧化活性影响
注：同一列数字旁字母完全不同时，表示差异有统计学意义(p<0.05)
通过上述对比试验及研究分析发现米糠中溶剂可提取的酚类成分含有表儿茶素、儿茶素、原儿茶酸、绿原酸、阿魏酸、咖啡酸、没食子酸等，其中表儿茶素和儿茶素为黄酮类成分，其它为酚酸类物质，不同的酚类成分其CAA活性有较大的差别，当选用不同的溶剂浸提和不同种类的大孔树脂进行纯化时，由于米糠中上述各种酚类化合物的极性以及其分子大小等的差别，导致其在不同溶剂中的浸出率和对于树脂的吸附性能等存在差别。
所得结果表明采用本发明乙醇浸提和HPD-722树脂纯化后的米糠酚类提取物具有更好的CAA活性。乙醇浸提和HPD-722树脂纯化处理更有利于具有较高CAA活性的米糠酚类物质的溶出和富集。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种提高米糠酚类物质生物活性的制备及纯化方法，其特征在于包括以下步骤:
步骤一：将脱脂米糠粉碎成颗粒，按照料液的质量体积比1：4-6加入体积百分数为65-75％的乙醇水溶液，封紧浸提容器口部后，室温下200-300rpm振摇浸提120-150min；3000-4000rpm离心10-15min，收集上清浸提液；
步骤二：将浸提液在45-50℃下减压浓缩至无乙醇，用蒸馏水将浓缩液稀释；
步骤三：选用预处理过的HPD722大孔吸附树脂进行湿法装柱，将上述稀释过的米糠酚类物质浸提液上样；
步骤四：用蒸馏水洗去杂质，待洗出液无混浊时，换用65-75％乙醇水溶液作为洗脱剂开始洗脱，收集黄色洗脱液，至树脂柱上黄色吸附成分被完全洗脱时停止收集；
步骤五：将洗脱液在45-50℃下减压浓缩至无乙醇，真空冷冻干燥得到纯化的米糠酚类物质提取物。
2.如权利要求1所述的一种提高米糠酚类物质生物活性的制备及纯化方法，其特征在于:步骤一中收集完上清浸提液后，将残渣按前述条件重复浸提一次，合并两次浸提液。
3.如权利要求1所述的一种提高米糠酚类物质生物活性的制备及纯化方法，其特征在于:步骤一中将脱脂米糠粉碎成小于80目的颗粒。
4.如权利要求1所述的一种提高米糠酚类物质生物活性的制备及纯化方法，其特征在于:步骤二中用蒸馏水将浓缩液稀释至酚类物质含量为1.0-1.5mg/mL。
5.如权利要求1所述的一种提高米糠酚类物质生物活性的制备及纯化方法，其特征在于:步骤三中稀释过的米糠酚类物质浸提液按照2-3BV/h的流速上样，上样体积为3-4BV。
6.如权利要求1所述的一种提高米糠酚类物质生物活性的制备及纯化方法，其特征在于:步骤四中洗脱流速为2.5-3.5BV/h。
7.如权利要求1所述的一种提高米糠酚类物质生物活性的制备及纯化方法，其特征在于:步骤四中收集完洗脱液之后换用蒸馏水3-4BV冲洗树脂柱，以备再次上样使用。
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