CN102058627A - 披针新月蕨总黄酮及其制备和含量测定方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了披针新月蕨总黄酮及其提取纯化和检测方法，本发明提取纯化方法简便，纯度高，其具有很强的抗氧化作用，能够用于制备抗氧化剂。本发明检测方法是：用纯度大于98%的新月蕨素I作对照品，配制成梯度的标准溶液，在272nm波长下，分别测定该标准溶液的吸光度值，根据吸光度值和浓度之间的对应关系建立标准曲线；将披针新月蕨总黄酮提取物用甲醇溶解，过滤，配制成待测液，将待测液在272nm波长下测吸光度值，根据所测吸光度值由标准曲线算出所测待测液的浓度，然后根据稀释倍数换算出提取物中总黄酮的含量，解决了因披针新月蕨中所含特征成分黄烷-4-醇苷类化合物不具有黄酮的特征显色结构所致的不易检测的难题。

Description

披针新月蕨总黄酮及其制备和含量测定方法及应用

技术领域：

本发明涉从植物中提取药用物质及提取物的含量检测，具体涉及具体涉及披针新月蕨总黄酮及其提取工艺。

背景技术：

自由基是指带有未成对电子的分子或离子，它们具有很高的反应活性，可破坏生物大分子，影响细胞活性。自由基主要损害细胞膜，包括血管内皮细胞膜及亚微结构，并引起一系列有害的生化反应。现代药理学研究已证实，自由基与许多病理生理现象都有密切的关系，如衰老、肿瘤、炎症、突变、心脑缺血、动脉粥样硬化等。通过对清除自由基(如ABTS^·+及DPPH)能力，即抗氧化活性，进行测试，可以初步判断其生物学活性。

黄酮类化合物广泛存在于自然界，泛指两个具有酚羟基的苯环(A-与B-环)通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物，见图1。黄酮类化合物结构中常连接有酚羟基、甲氧基、甲基、异戊烯基等官能团。此外，它还常与糖结合成苷。根据中央三碳链的氧化程度、B-环连接位置(2-或3-位)以及三碳链是否构成环状等特点，可将主要的天然黄酮类化合物分类：黄酮类、黄酮醇、二氢黄酮类、二氢黄酮醇类、花色素类、黄烷-3，4二醇类、双苯吡酮类、查尔酮和双黄酮类等十五种。黄酮类化合物具有多种生物活性，如对心血管系统的作用，抗肝脏毒作用，抗炎作用，雌性激素作用，抗菌及抗病毒作用，泻下作用，解痉作用等。

蕨类植物(Pteridophyta)又称羊齿植物，是地球上会古老的陆生植物群，它们是介于苔藓植物和种子植物的一个类群，既是高等的孢子植物，又是原始的维管植物。今年来随着对一些蕨类植物研究的深入，蕨类植物所具有的一些生物活性正逐渐受到人们的重视。蕨类植物富含黄酮类化合物，现已从蕨类植物中分离了200多个黄酮类化合物，蕨类植物中黄酮类黄酮化合物的类型也十分丰富，几乎包括了所有类型的黄酮。

披针新月蕨(Abacopteris penangiana(Hook.)Ching)是蕨类植物门金星蕨科(Thelypteridaceae)新月蕨属(Abacopteris)多年生的蕨类植物，又名山金竹、散血莲、见血散、鸡血莲等。披针新月蕨植物高120～200cm，根茎长而横生，偶有披针形鳞片；叶近生，叶柄可长达100cm，叶片纸质，干后多呈浅紫色；羽片近对生，斜稍上，基部楔形，边缘具软骨质尖齿或大锯齿。孢子囊群圆形，背生于小脉中部或中部稍下处；无囊群盖(图2)。披针新月蕨为金星蕨科新月蕨属植物披针新月蕨(Abacopterispenangiana(Hook.)Ching)的干燥根茎。披针新月蕨又名活血莲、过山龙、鸡血莲等，主产于湖北、江西、河南、浙江等地。其性凉，味苦，微甘。披针新月蕨是鄂西北土家族民间常用药物，地下根茎和地上部分均能入药，具有清热解毒、凉血消斑、利咽止痛的功效，广泛用来治疗急、慢性咽炎、痢疾及上呼吸道感染等疾病。本课题组通过对披针新月蕨的分离工作得知该植物中含有大量黄酮类化合物，大部分为黄烷-4-醇苷类化合物。

发明内容：

发明的目的是提供抗氧化活性的披针新月蕨总黄酮及披针新月蕨总黄酮含量定方法。

实现本发明的技术方案是：

本发明提供的披针新月蕨总黄酮，是按以下方法提取纯化得到的产物：

(1)原料的制备：以当年生披针新月蕨根茎为原料，洗净，晾干，粉碎，过40目筛，得原料粗粉，用80％的乙醇，6倍量，回流提取90min，提取液浓缩过滤，冷冻干燥，得红棕色披针新月蕨总浸膏；

(2)取上述总浸膏水溶至浓度3mg/ml左右，过滤，采用HPD500树脂柱纯化，用2×24cm柱时，吸附流速为2ml/min，水洗体积为7倍柱体积、乙醇洗脱剂浓度为70％，洗脱剂体积为5倍柱体积、洗脱流速为2ml/min；使用大型柱时吸附流速、洗脱流速与柱半径放大倍数成正比，得披针新月蕨总黄酮。

因披针新月蕨中所含特征成分黄烷-4-醇苷类化合物不具有黄酮的特征显色结构，本发明提供的披针新月蕨总黄酮含量测定方法由以下方式来实现：

a、用纯度大于98％的新月蕨素I作对照品，配制成梯度的标准溶液，在272nm波长下，分别测定该标准溶液的吸光度值，根据吸光度值和浓度之间的对应关系建立标准曲线。所用的作为对照品的化合物新月蕨素I由本发明课题组从披针新月蕨中首次分离得到，含有黄烷-4-醇苷类结构，可作为披针新月蕨的代表成分，新月蕨素I结构式见图3，其鉴定谱图见图4-6。

b、将披针新月蕨的提取物用甲醇溶解，过滤，配制成待测液，将待测液在272nm波长下测吸光度值，根据所测吸光度值由标准曲线算出所测待测液的浓度，然后根据稀释倍数换算出提取物中总黄酮的含量。

本发明操作简单，稳定性、重复性好，易于控制。

通过试验对本发明涉及的披针新月蕨总黄酮提取物清除ABTS^·+自由基及DPPH自由基的能力检测，表明本发明涉及的披针新月蕨总黄酮提取物对ABTS^·+自由基及DPPH自由基有良好的清除效果，具有很强的抗氧化活性。

本发明实验资料：

(1)原料的制备：以当年生披针新月蕨根茎(2009年10月采自江西九江，经九江森林植物标本馆谭策铭研究员鉴定为蕨类植物门金星蕨科(Thelyteridaceae)新月蕨属(Abacopteris)植物披针新月蕨Abacopteris penangiana(Hook.)Ching的干燥干燥根茎)为原料，洗净，晾干，粉碎，过40目筛，得原料粗粉待用；

(2)正交设计：考察溶剂(甲醇、乙醇、丙酮)，料液比(1∶4、1∶6、1∶8)、提取时间(30min、60min、90min)和溶剂浓度(60％、80％、100％)对提取的影响，加热回流，提取三次，然后合并提取液；

(3)回收溶剂，然后用甲醇溶解，定容，根据以上发明总黄酮含量测定方法，测定吸光度值，由标准曲线得出个批次总黄酮含量，进行正交分析，得出最佳提取工艺为：80％的乙醇，6倍量，回流提取90min；

(4)根据上述得到的最佳提取工艺提取披针新月蕨根茎，干燥成红棕色浸膏，得率不低于15％(以生药材计算)；

(5)称取一定质量上述总浸膏，溶解于水中，过滤，使用7种不同极性的大孔树脂(HPD100，HPD400，HPD450，HPD500，HPD600，HPD722，D101)做静态吸附试验，根据吸附率和解析率选取纯化总黄酮的最佳树脂HPD500；

(6)做以上所选择的树脂的动态吸附试验，单独考察乙醇洗脱剂浓度(30％、50％、70％、80％)、上样液浓度(1.47mg/ml，2.86mg/ml，4.29mg/ml)、饱和上样量，正交设计考察吸附流速(1ml/min、2ml/min、4ml/min)、水洗体积(3倍柱体积、5倍柱体积、7倍柱体积)、洗脱剂体积(3倍柱体积、5倍柱体积、10倍柱体积)、洗脱流速(1ml/min、2ml/min、4ml/min)；

(7)根据本发明的总黄酮含量测定方法计算上述正交设计各批次总黄酮得率和纯度，进行正交分析，得出最佳纯化工艺为：采用HPD500树脂，上样液浓度3mg/ml左右，取饱和上样量为21.86mg/1ml的树脂，吸附流速为2ml/min，水洗体积为7倍柱体积、乙醇洗脱剂浓度为70％，洗脱剂体积为5倍柱体积、洗脱流速为2ml/min(此工艺参数为采用2×24cm柱得出，使用大型柱时吸附流速、洗脱流速与柱半径放大倍数成正比)；由此最佳工艺参数所得红棕色的披针新月蕨总黄酮，以生药材计算得率不低于3，纯度为59.77％；步骤(3)中所得总浸膏与步骤(4)中所得总黄酮的相同浓度溶液(质量/体积)的HPLC图谱如图7、8所示)。

本发明制备总黄酮的方法简便，且针对性强，产品纯度高。

本发明的具有抗氧化作用的披针新月蕨总黄酮提取物的药效如下：

(1)清除ABTS^·+自由基能力的检测：

精密称取一定量的ABTS，配制成7.0mM的水溶液，然后向溶液中加入一定量的过硫酸钾，使得溶液中过硫酸钾的最终浓度为2.45mM，将上述反应溶液在室温下，置于避光放置16h；将上面配制的ABTS^·+溶液用水稀释，直至溶液在734nm的吸光度值为0.700±0.003，备用；将20μL本发明所得披针新月蕨总黄酮溶液加入1.98mL上述稀释后的ABTS^·+溶液中，然后记录15min时反应溶液在734nm处的吸光度值，记为A₁；用溶剂做空白对照，空白对照的吸光度值记为A₀。阳性对照化合物为槲皮素；对ABTS^·+清除率按下式计算：

清除率(％)＝(A₀-A₁)/A₀×100％

10μg/mL和50μg/mL披针新月蕨总黄酮溶液对ABTS^·+自由基的清除率分别为23.56％、70.03％，10μg/mL槲皮素对ABTS^·+自由基的清除率为73.31％。

结果表明50μg/mL披针新月蕨总黄酮溶液和10μg/mL槲皮素对ABTS^·+自由基的清除率大致相当。

(2)清除DPPH自由基能力的检测：

精密称取一定量的DPPH，用无水乙醇配制成100μM的溶液，将50μL本发明所得披针新月蕨总黄酮溶液加入1.95mL上述DPPH溶液中，然后记录20min时反应溶液在517nm处的吸光度值，记为A₁。用溶剂做空白对照，空白对照的吸光度值记为A₀。阳性对照化合物为维生素E。对DPPH清除率按下式计算：

清除率(％)＝(A₀-A₁)/A₀×100％

10μg/mL和75μg/mL披针新月蕨总黄酮溶液对DPPH自由基的清除率分别为15.23％、47.71％，10μg/mL和75μg/mL维生素E对DPPH自由基的清除率分别为51.85％、94.39％。结果表明75μg/mL的披针新月蕨总黄酮溶液和10μg/mL的维生素E溶液对DPPH自由基的清除能力大致相当。

以上对本发明所得披针新月蕨总黄酮的药效学试验表明，其具有很强的抗氧化作用。

附图说明

图1：黄酮骨架：C6-C3-C6结构

图2：披针新月蕨植物图

图3：新月蕨素I

图4：新月蕨素I质谱图

图5：新月蕨素I氢谱图

图6：新月蕨素I碳谱图

图7：披针新月蕨总浸膏溶液HPLC图

图8：披针新月蕨总黄酮HPLC图

图9：原料制备与提取工艺流程图

图10：总黄酮纯化工艺流程图

具体实施方式

实施例1

(1)原料的制备：以当年生披针新月蕨根茎(2009年10月采自江西九江，经九江森林植物标本馆谭策铭研究员鉴定为蕨类植物门金星蕨科(Thelyteridaceae)新月蕨属(Abacopteris)植物披针新月蕨Abacopteris penangiana(Hook.)Ching的干燥干燥根茎)为原料，洗净，晾干，粉碎，过40目筛，得原料粗粉待用；

(2)正交设计：考察溶剂(甲醇、乙醇、丙酮)，料液比(1∶4、1∶6、1∶8)、提取时间(30min、60min、90min)和溶剂浓度(60％、80％、100％)对提取的影响，加热回流，提取三次，然后合并提取液；

(3)回收溶剂，然后用甲醇溶解，定容，根据以上发明总黄酮含量测定方法，测定吸光度值，由标准曲线得出个批次总黄酮含量，进行正交分析，得出最佳提取工艺为：80％的乙醇，6倍量，回流提取90min；

(4)根据上述得到的最佳提取工艺提取披针新月蕨根茎，干燥成红棕色浸膏，得率不低于15％(以生药材计算)；

(5)称取一定质量上述总浸膏，溶解于水中，过滤，使用7种不同极性的大孔树脂(HPD100，HPD400，HPD450，HPD500，HPD600，HPD722，D101)做静态吸附试验，根据吸附率和解析率选取纯化总黄酮的最佳树脂HPD500；

(6)做以上所选择的树脂的动态吸附试验，单独考察乙醇洗脱剂浓度(30％、50％、70％、80％)、上样液浓度(1.47mg/ml，2.86mg/ml，4.29mg/ml)、饱和上样量，正交设计考察吸附流速(1ml/min、2ml/min、4ml/min)、水洗体积(3倍柱体积、5倍柱体积、7倍柱体积)、洗脱剂体积(3倍柱体积、5倍柱体积、10倍柱体积)、洗脱流速(1ml/min、2ml/min、4ml/min)；

(7)根据本发明的总黄酮含量测定方法计算上述正交设计各批次总黄酮得率和纯度，进行正交分析，得出最佳纯化工艺为：采用HPD500树脂，上样液浓度3mg/ml左右，取饱和上样量为21.86mg/1ml的树脂，吸附流速为2ml/min，水洗体积为7倍柱体积、乙醇洗脱剂浓度为70％，洗脱剂体积为5倍柱体积、洗脱流速为2ml/min，此工艺参数为采用2×24cm柱得出，使用大型柱时吸附流速、洗脱流速与柱半径放大倍数成正比；由此最佳工艺参数所得红棕色的披针新月蕨总黄酮，得率不低于3％(以生药材计算)，纯度为59.77％。上述步骤(3)中所得总浸膏与上述步骤(4)中所得总黄酮的相同浓度溶液(质量/体积)的HPLC图谱见图7、图8。

Claims (4)

1.一种披针新月蕨总黄酮，其特征在于，它是按以下方法制备得到的产物：以披针新月蕨根茎为原料，洗净，晾干，粉碎，过40目筛，得原料粗粉，用80％的乙醇，6倍量，回流提取90min，提取液浓缩过滤，冷冻干燥，得红棕色披针新月蕨总浸膏；取上述总浸膏水溶至浓度3mg/ml左右，过滤，采用HPD500树脂柱纯化，用2×24cm柱时，吸附流速为2ml/min，水洗体积为7倍柱体积、乙醇洗脱剂浓度为70％，洗脱剂体积为5倍柱体积、洗脱流速为2ml/min；使用大型柱时吸附流速、洗脱流速与柱半径放大倍数成正比，得披针新月蕨总黄酮。

2.一种披针新月蕨提取物总黄酮含量的测定方法，包括以下步骤：

a.用纯度大于98％的新月蕨素I作对照品，配制成梯度的标准溶液，在272nm波长下，分别测定该标准溶液的吸光度值，根据吸光度值和浓度之间的对应关系建立标准曲线；

b.将披针新月蕨总黄酮提取物用甲醇溶解，过滤，配制成待测液，将待测液在272nm波长下测吸光度值，根据所测吸光度值由标准曲线算出所测待测液的浓度，然后根据稀释倍数换算出提取物中总黄酮的含量。

3.一种披针新月蕨总黄酮的提取纯化方法，包括如下步骤：

(1)以披针新月蕨根茎为原料，洗净，晾干，粉碎，过40目筛，得原料粗粉，用80％的乙醇，6倍量，回流提取90min，提取液浓缩过滤，冷冻干燥，得红棕色披针新月蕨总浸膏；

(2)取上述总浸膏水溶至浓度3mg/ml左右，过滤，采用HPD500树脂柱纯化，用2×24cm柱时，吸附流速为2ml/min，水洗体积为7倍柱体积、乙醇洗脱剂浓度为70％，洗脱剂体积为5倍柱体积、洗脱流速为2ml/min；使用大型柱时吸附流速、洗脱流速与柱半径放大倍数成正比，得披针新月蕨总黄酮。

4.权利要求1所述的披针新月蕨总黄酮在制备抗氧化剂中的应用。

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